pmid: "35132348"
title: "Butirato de Sódio Atenua a Lesão da Barreira do Epitélio Intestinal Induzida por Estresse Oxidativo e o Dano Mitocondrial através da Via AMPK-Mitofagia."
authors: "Li X, Wang C, Zhu J, Lin Q, Yu M, Wen J, Feng J, Hu C"
journal: "Oxidative medicine and cellular longevity"
pubdate: "2022"
doi: "10.1155/2022/3745135"
source: "PMC Full Text"
Butirato de Sódio Atenua a Lesão da Barreira do Epitélio Intestinal Induzida por Estresse Oxidativo e o Dano Mitocondrial através da Via AMPK-Mitofagia.
Autores
Li X, Wang C, Zhu J, Lin Q, Yu M, Wen J, Feng J, Hu C
Periodico
Oxidative medicine and cellular longevity (2022)
Conteudo
Butirato de Sódio Ameliora a Lesão da Barreira do Epitélio Intestinal Induzida por Estresse Oxidativo e Dano Mitocondrial através da Via AMPK-Mitofagia
Butirato de sódio tem recebido atenção crescente por seus vastos efeitos benéficos. No entanto, se o butirato de sódio poderia aliviar a disfunção intestinal induzida por estresse oxidativo e o dano mitocondrial de leitões e seu mecanismo subjacente permanece incerto. O presente estudo utilizou um modelo de estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio (H2O2) para estudar se o butirato de sódio poderia aliviar o estresse oxidativo, a lesão do epitélio intestinal e a disfunção mitocondrial de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) na via dependente de AMPK-mitofagia. Os resultados indicaram que o butirato de sódio aliviou o estresse oxidativo induzido por H2O2, diminuiu o nível de espécies reativas de oxigênio (ROS), aumentou o potencial de membrana mitocondrial (MMP), o DNA mitocondrial (mtDNA) e a expressão de mRNA de genes relacionados à função mitocondrial, e inibiu a liberação do citocromo c mitocondrial (Cyt c). O butirato de sódio reduziu a expressão proteica da proteína recombinante da família NLR, domínio pirina contendo a proteína 3 (NLRP3) e a permeabilidade ao dextrano fluoresceína isotiocianato 4 kDa (FD4) e aumentou a resistência transepitelial (TER) e a expressão proteica das junções apertadas. O butirato de sódio aumentou a expressão da proteína B associada à cadeia leve (LC3B) e Beclin-1, reduziu a expressão de P62 e potencializou a mitofagia. No entanto, o uso de inibidor de AMPK ou inibidor de mitofagia enfraqueceu o efeito protetor do butirato de sódio sobre a função mitocondrial e a função de barreira do epitélio intestinal e suprimiu o efeito de indução do butirato de sódio sobre a mitofagia. Além disso, também descobrimos que após a interferência com AMPKα, o efeito protetor do butirato de sódio sobre as células IPEC-J2 tratadas com H2O2 foi suprimido, indicando que a AMPKα é necessária para que o butirato de sódio exerça seu efeito protetor. Em resumo, esses resultados revelaram que o butirato de sódio induziu a mitofagia ao ativar a AMPK, aliviando assim o estresse oxidativo, a lesão da barreira do epitélio intestinal e a disfunção mitocondrial induzidos por H2O2.
A barreira do epitélio intestinal é conhecida como a barreira importante para prevenir a invasão de toxinas ou antígenos. Estudos descobriram que o estresse oxidativo está envolvido no comprometimento da barreira intestinal de leitões, o que se refere principalmente ao desequilíbrio entre espécies reativas de oxigênio (EROs) e o sistema antioxidante. Sob estresse oxidativo, a superprodução de EROs pode causar peroxidação lipídica, danos a proteínas e ao DNA. Múltiplos estudos mostraram que o butirato de sódio dietético pode proteger a barreira intestinal de leitões ao fornecer energia para as células epiteliais intestinais, anti-inflamação, desacetilação de histonas, regulação imunológica, etc. Os experimentos in vivo em ratos e experimentos in vitro com células epiteliais intestinais demonstraram que os efeitos protetores da função de barreira intestinal pelo butirato de sódio estão relacionados à sua capacidade antioxidante. Como as mitocôndrias são a principal fonte de EROs, o efeito antioxidante do butirato de sódio pode resultar do direcionamento às mitocôndrias.
O intestino precisa de muita energia para manter a homeostase, que é fornecida principalmente pelas mitocôndrias intracelulares. No entanto, sob estresse oxidativo, as mitocôndrias não são apenas a principal fonte de EROs, mas também um importante alvo de ataque delas. Mitocôndrias danificadas induzidas pelo estresse oxidativo podem produzir mais de dez vezes mais EROs do que as mitocôndrias normais, o que agrava ainda mais o dano mitocondrial. Para bloquear esse ciclo vicioso, o corpo remove seletivamente as mitocôndrias danificadas por meio da degradação lisossomal, um processo chamado mitofagia. Um estudo recente relatou que o butirato de sódio pode induzir mitofagia em células de ovário de hamster chinês. Especulamos que o efeito antioxidante do butirato de sódio está relacionado à diminuição da produção de EROs mitocondriais e à mitofagia.
A proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina (AMPK) é um sensor chave de energia, bem como um importante sensor de estresse oxidativo, que exerce um papel importante na função mitocondrial e na mitofagia. A AMPKα é o núcleo catalítico da AMPK, e Toyama et al. descobriram que a AMPK é ativada em células sob situação de deficiência energética, conforme indicado pelo fato de que a AMPK promoveu o recrutamento adicional de múltiplas proteínas relacionadas à divisão mitocondrial ao fosforilar a proteína downstream fator de fissão mitocondrial (MFF), causando assim a divisão mitocondrial, o que conecta o receptor de energia AMPK à divisão mitocondrial. É bem conhecido que o butirato de sódio é uma importante substância energética para as células epiteliais intestinais e tem as funções de aliviar o estresse oxidativo e proteger a barreira intestinal. Mollica et al. relataram que alimentar camundongos obesos resistentes à insulina com butirato de sódio pode aumentar a atividade da AMPK no fígado, reduzir a produção de ROS e melhorar a função mitocondrial hepática. No entanto, se o butirato de sódio pode aliviar o estresse oxidativo e melhorar a função mitocondrial através da AMPK permanece incerto. Mais pesquisas são necessárias para estudar o mecanismo através do qual o butirato de sódio alivia o estresse oxidativo e melhora a função da barreira intestinal.
Portanto, este experimento utilizou um modelo de estresse oxidativo em células IPEC-J2 por H2O2 para estudar os efeitos do butirato de sódio na lesão da barreira intestinal, função mitocondrial, mitofagia e os mecanismos moleculares subjacentes.
2. Material e Métodos
2.1. Reagentes
A célula IPEC-J2 foi uma cortesia do Prof. Yin Yulong, Instituto de Agricultura Subtropical, Academia Chinesa de Ciências. H2O2 (Sinopharm Group, China), meio DMEM-F12 (Shanghai Yuanpei Biotechnology, China), e dextrana fluorescente de isotiocianato de fluoresceína 4 kDa (FD4) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA). Tripsina (Beyotime Biotechnology, China), solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Bozan Biotechnology, China), penicilina-estreptomicina (Solabao Biotechnology, China), soro fetal bovino (Gemini, Austrália), kit CCK-8 (Beyotime Biotechnology, China), MitoSpy™ Red CMXRos (Biolegend, EUA), fixador para imunofluorescência (Sevier Biotechnology, China), Triton-X 100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), Glicina (Sinopharm Group, China), DAPI (Beyotime Biotechnology, China), Goat Anti-Mouse IgG Dylight 594 (Earthox, EUA), Goat Anti-Mouse IgG Dylight 488 (Earthox, EUA), inibidor da divisão mitocondrial (Mdivi-1) (Selleck, EUA), inibidor de AMPK (Compound C, CC) (Selleck, EUA), Lipofectamine RNAiMAX, e Lipofectamine 2000 foram obtidos da Invitrogen (Invitrogen, EUA).
2.2. Desenho Experimental e
As células IPEC-J2 foram cultivadas em meio completo DMEM-F12 (10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina)). As condições de cultura são 37°C, 5% de CO2 e 95% de umidade em incubadora de dióxido de carbono, e o meio é trocado a cada 2 dias. O modelo de estresse oxidativo das células IPEC-J2 é construído com 600 μmol/L de H2O2 por 8 horas. Este estudo está dividido em três experimentos. Experimento 1: grupo controle (controle), grupo butirato de sódio (NaB), grupo estresse oxidativo (H2O2) e grupo butirato de sódio + estresse oxidativo (NaB+H2O2); 600 μmol/L de H2O2 foi tratado com células no grupo H2O2 e no grupo NaB+H2O2 por 8 horas. As células do grupo controle e do grupo NaB receberam a mesma quantidade de PBS. Experimento 2: grupo controle (controle), grupo estresse oxidativo (H2O2), grupo butirato de sódio + estresse oxidativo (NaB+H2O2), grupo butirato de sódio + estresse oxidativo + inibidor de mitofagia (NaB+H2O2+Mdivi-1) e grupo butirato de sódio + estresse oxidativo + inibidor da via de sinalização AMPK (NaB+H2O2+Compound C); 1 hora antes da adição de H2O2 ou PBS, o inibidor de mitofagia (Mdivi-1, 1 μmol/L) ou o inibidor da via de sinalização AMPK (Compound C, 10 μmol/L) foi adicionado às células. Experimento 3: o experimento é dividido em seis grupos: grupo controle (controle+siAMPKα), grupo estresse oxidativo (H2O2), grupo estresse oxidativo + interferência AMPKα (H2O2+siAMPKα), grupo butirato de sódio + estresse oxidativo (NaB+H2O2) e grupo butirato de sódio + estresse oxidativo + interferência AMPKα (NaB+H2O2+siAMPKα). As células dos grupos controle, H2O2 e NaB+H2O2 foram transfectadas com siControl. E as células dos grupos controle+siAMPKα, H2O2+siAMPKα e NaB+H2O2+siAMPKα foram transfectadas com siAMPKα.
2.3. Experimento de Viabilidade Celular
Células IPEC-J2 em fase logarítmica foram semeadas em placa de 96 poços, 10 μl de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço, incubadas a 37°C por 4 h, e a absorbância a 450 nm foi medida com leitor de microplacas (FLx800, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, EUA). A viabilidade celular é normalizada com base na absorbância das células no grupo controle.
2.4. Resistência Elétrica Transepitelial (TER) e Fluxo de FD4 das Células IPEC-J2 no Sistema Transwell
De acordo com o estudo anterior, o transwell (Corning, NT, EUA) é pré-umedecido com meio DMEM-F12 na incubadora por mais de 30 minutos antes do uso. Após a tripsinização das células, interrompa a reação com meio fresco, centrifugue a 1500 rpm por 5 min, descarte o sobrenadante e adicione um volume determinado de meio fresco, ajuste a concentração celular para 1 × 10⁶ células/ml, adicione 150 μl da suspensão celular na câmara superior, adicione 1,5 ml de meio fresco na câmara inferior e coloque em uma incubadora de dióxido de carbono para cultivo. Troque o meio a cada 2 dias. De acordo com o estudo anterior, a TER foi medida pelo sistema de resistência Millicell-ERS (Millipore; Bedford, MA) em três pontos diferentes em cada transwell, e a média dos três valores medidos foi considerada a TER real. O valor de TER medido sem inoculação do cultivo celular é a TER do branco. A TER da monocamada celular = (TER medida − TER do branco) × área efetiva da membrana do transwell e expressa em (Ω·cm²). FD4 (concentração final 1 mg/ml) foi adicionado à câmara superior do transwell, e 50 μl (suplementado com o mesmo volume de meio fresco após a coleta) foram amostrados na câmara inferior em 24 horas e 48 horas, para determinar a concentração de FD4 e calcular a permeabilidade da barreira do epitélio intestinal ao FD4 por um leitor de microplacas de fluorescência (FLx800, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, EUA).
2.5. Determinação da Capacidade Antioxidante Celular e IL-1β
Após o tratamento celular, adicione o lisado celular, lise no gelo por 10 min, centrifugue a 4°C por 10 min (12000 rpm/min) e colete o sobrenadante para teste. De acordo com as instruções do kit ELISA (Instituto de Engenharia Bioquímica Nanjing Jiancheng, Jiangsu, China), a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e glutationa redutase (GSH), o conteúdo de malondialdeído (MDA) e o conteúdo de IL-1β foram medidos para cada amostra.
2.6. Determinação do Nível de ROS Celular
A citometria de fluxo foi realizada para determinar o nível de ROS celular usando o indicador fluorescente sensível a ROS 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA; Sigma-Aldrich). Resumidamente, as células no microtubo de 2 ml foram incubadas com 1 ml de DCFH-DA diluído em meio livre de soro (1:1000) a 37°C por 30 min no escuro. Após lavagem duas vezes com PBS e ressuspensão, a citometria de fluxo (BD, EUA) foi utilizada para detectar o ROS celular. Os dados foram calculados pelo software FlowJo 10.4 (V 7.6.1).
2.7. Medição do Potencial de Membrana Mitocondrial (MMP)
O potencial de membrana mitocondrial foi medido pelo kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial (Beyotime Biotechnology, China) de acordo com o estudo anterior. Os monômeros de JC-1 (verde) podem formar agregados (fluorescência vermelha) nas mitocôndrias com alto ΔΨm, que não podem formar agregados nas mitocôndrias com baixo ΔΨm. Resumidamente, as células foram incubadas com solução de trabalho de JC-1 a 37°C por 25 minutos. Após lavagem por três vezes com PBS, citometria de fluxo (BD, EUA) ou microscópio confocal a laser (FV1000, Olympus, Japão) foi utilizado para detectar o potencial de membrana mitocondrial (MMP).
2.8. Análise do Nível de Expressão de mRNA por PCR Quantitativa em Tempo Real (RT-qPCR)
A extração de RNA total foi realizada com Trizol de acordo com as instruções do fabricante (Takara, Japão). Após a detecção da concentração e pureza do RNA, este foi utilizado para a síntese de cDNA (Vazyme, Nanjing, China) e, em seguida, para RT-qPCR de acordo com as instruções do fabricante (qPCR, master mix, Vazyme, Nanjing, China), conforme descrito anteriormente. As sequências dos primers são mostradas na Tabela Suplementar 1. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como gene de referência interno para calcular a expressão relativa de cada gene, e os dados foram normalizados usando o método 2-ΔΔCt.
2.9. Experimento de Western Blot
O experimento de Western blot foi conduzido de acordo com o estudo anterior. A extração e quantificação de proteínas totais foram realizadas através do tampão de lise RIPA e do Kit de Ensaio de Proteínas BCA (Beyotime Biotechnology, Xangai, China). As proteínas da mucosa do jejuno foram corridas e isoladas através de SDS-PAGE. Em seguida, as proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. Após bloqueio com 5% de leite em pó desnatado à temperatura ambiente por uma hora, os blots foram incubados com anticorpos primários específicos durante a noite e, em seguida, com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano-silvestre (HRP). O kit BeyoECL Moon (Beyotime Biotechnology, China) foi usado para visualizar o blot de proteínas. Os anticorpos primários, incluindo β-actina, PINK1, Parkin, Claudina-1, Ocludina, ZO-1, LC3B, Beclina-1 e P62, foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos citocromo c, NLRP3, Caspase-1, IL-1β, IgG anti-coelho conjugado com HRP e IgG anti-camundongo conjugado com HRP foram adquiridos da HUABIO (Hangzhou, China).
2.10. Ultraestrutura das Mitocôndrias das Células IPEC-J2
Resumidamente, as células IPEC-J2 foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% a 4°C durante a noite e, em seguida, pós-fixadas com OsO4 a 1%. Após desidratação (concentração gradiente de etanol), infiltração (resina Spurr), embebição, cortes ultrafinos (LEICA EM UC7) e coloração (acetato de uranila e citrato de chumbo alcalino por 5 a 10 minutos, respectivamente), as amostras foram observadas por microscópio eletrônico de transmissão (Hitachi Model H-7650, Tóquio, Japão).
2.11. Marcação Mitocondrial por MitoSpy™ Red CMXRos
MitoSpy™ Sonda de Localização Mitocondrial (Biolegend, EUA) é um reagente químico fluorescente permeável a células usado para marcar mitocôndrias em células vivas. De acordo com as instruções do fabricante, centrifugamos o reagente liofilizado no tubo de centrífuga para garantir que o reagente esteja no fundo do frasco, adicionamos 94 μl de DMSO a cada tubo e reconstituímos o MitoSpy™ Red CMXRos a uma concentração de 1 mmol/L com DMSO. A solução estoque é diluída em meio livre de soro para preparar a solução de trabalho de MitoSpy™ Red CMXRos. Após o término do tratamento celular, lave uma vez com PBS 1X morno. Adicione a solução diluída de MitoSpy™ Red CMXRos às células vivas e coloque-as em uma incubadora a 37°C por 20-30 min. Lave as células duas vezes com PBS 1X morno ou meio. Fixe as células com fixador de imunofluorescência (paraformaldeído a 4%) por 10-20 minutos à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com PBS 1X para experimentos subsequentes.
2.12. Análise de Imunofluorescência
As células IPEC-J2 foram semeadas em uma placa de cultura para microscopia confocal a laser. Após o tratamento indicado, as células foram lavadas duas vezes com PBS pré-resfriado e passaram pelas etapas de fixação, permeabilização (Tritox X-100, Beyotime Biotechnology, Xangai, China), bloqueio, incubação com anticorpo primário (Claudina-1, LC3B e PINK1), incubação com anticorpo secundário (conjugado com Dylight, Earthox, EUA), coloração nuclear (DAPI) e selagem. As amostras foram observadas e fotografadas sob um microscópio confocal a laser (FV1000, Olympus, Japão).
2.13. siRNA e Transfecção Celular
Células IPEC-J2 foram semeadas em placas de 6 poços para crescer até aproximadamente 80% de confluência. No dia seguinte, siRNA e plasmídeo alvo individuais foram misturados com Lipofectamine RNAiMAX ou Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA). A sequência do siRNA é a seguinte: siAMPKα (5′-GCT GCACCAGAAGTAATTTTT-3′) e siControl (5′-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3′). A mistura RNAiMAX/siRNA foi adicionada às células IPEC-J2 em meio livre de antibióticos e cultivada por 4-6 h. O meio contendo siRNA foi substituído pelo meio geral. Butirato de sódio e H₂O₂ foram adicionados ao grupo indicado de acordo com o desenho experimental. Em seguida, as amostras foram coletadas para experimentos subsequentes.
2.14. Análise Estatística
Os dados experimentais foram analisados estatisticamente usando o software SPSS 20.0. A análise de variância de uma via (ANOVA) foi utilizada para análise dos testes. O método de Turkey foi usado para comparações múltiplas, e o software GraphPad Prism 7.01 foi usado para a criação de gráficos. P < 0,05 indica diferença significativa.
3. Resultados
3.1. Efeito do Butirato de Sódio no Estresse Oxidativo de Células IPEC-J2 Tratadas com H₂O₂
As células IPEC-J2 foram tratadas com diferentes concentrações de H2O2 (200 μmol/L, 400 μmol/L, 600 μmol/L, 800 μmol/L e 1000 μmol/L) por 8 horas, e a viabilidade celular foi determinada. Conforme mostrado na Figura 1(a), constatou-se que H2O2 a 600, 800 e 1000 μmol/L reduziu significativamente a viabilidade celular (P < 0,05). As células foram tratadas com 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 e 16 μmol/L de butirato de sódio por 24 horas, e observou-se que 0,25-2 mmol/L de butirato de sódio não apresentou efeito significativo na viabilidade celular, e concentrações superiores a 4 mmol/L inibiram significativamente o crescimento celular (Figura 1(b)). Além disso, as células foram tratadas com 0,25, 0,5, 1, 2 e 4 mmol/L de butirato de sódio, e constatou-se que 1 mmol/L de butirato de sódio foi capaz de inibir efetivamente a diminuição da viabilidade celular induzida por H2O2 (P < 0,05) (Figura 1(c)). Portanto, os experimentos subsequentes utilizaram o modelo de estresse oxidativo induzido por 600 μmol/L de H2O2 e pré-tratamento com 1 mmol/L de butirato de sódio. Conforme mostrado nas Figuras 1(d)–1(f), em comparação com o grupo controle, o tratamento com H2O2 reduziu significativamente as atividades de SOD e GSH das células IPEC-J2 (P < 0,05) e aumentou o nível de MDA (P < 0,05); concomitantemente, em comparação com o grupo H2O2, o butirato de sódio inibiu significativamente a diminuição da atividade de SOD e GSH induzida por H2O2, atenuando o aumento do nível de MDA (P < 0,05). Da mesma forma, os dados de citometria de fluxo mostraram que, em comparação com o grupo controle, o pré-tratamento com butirato de sódio inibiu significativamente o aumento dos níveis de ROS induzido por H2O2 (P < 0,05) (Figura 1(g)).
3.2. Efeito do Butirato de Sódio na Função Mitocondrial das Células IPEC-J2 Tratadas com H2O2
Os dados de citometria de fluxo mostraram que, em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ aumentou significativamente a proporção de células despolarizadas (P < 0,05), enquanto o pré-tratamento com butirato de sódio reverteu o aumento na proporção de células despolarizadas induzido pelo H₂O₂ (P < 0,05) (Figura 2(a)). Além disso, sob microscópio confocal a laser, descobrimos que, em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ reduziu a razão entre agregados de JC-1 e monômero (P < 0,05), indicando que o potencial de membrana mitocondrial foi reduzido, e o tratamento com butirato de sódio atenuou a diminuição do potencial de membrana mitocondrial celular induzida pelo H₂O₂ (P < 0,05) (Figura 2(b)). Através da detecção da quantidade de DNA mitocondrial (mtDNA) (Figura 2(c)) e do nível de expressão de mRNA de genes relacionados à função mitocondrial (Figura 2(d)), constatou-se que, em comparação com o grupo controle, o tratamento com H₂O₂ reduziu significativamente a quantidade de mtDNA e a expressão de mRNA do gene relacionado à função mitocondrial fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fator respiratório nuclear-1 (NRF-1) e coativador-1α do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PGC-1α) (P < 0,05); o butirato de sódio atenuou significativamente a redução do mtDNA e do nível de mRNA dos genes relacionados à função mitocondrial induzida pelo H₂O₂ (P < 0,05). Da mesma forma, sob o microscópio eletrônico de transmissão, foi observado (Figura 2(e)) que as células do grupo H₂O₂ apresentaram inchaço mitocondrial evidente, quebra das cristas mitocondriais e vacuolização mitocondrial; o butirato de sódio melhorou significativamente a ultraestrutura das mitocôndrias. Conforme mostrado na Figura 2(f), em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ aumentou o nível de citocromo c (Cyt c) no citoplasma (P < 0,05) e diminuiu o nível de Cyt c nas mitocôndrias (P < 0,05), sugerindo que o H₂O₂ aumentou a permeabilidade das membranas mitocondriais interna e externa e resultou na liberação de Cyt c mitocondrial para o citoplasma, indicando que a função mitocondrial está danificada; em comparação com o grupo H₂O₂, o butirato de sódio atenuou a liberação de Cyt c mitocondrial causada pelo H₂O₂ (P < 0,05), indicando que o tratamento com butirato de sódio pode ajudar a melhorar a função mitocondrial sob estresse oxidativo.
3.3. Efeito do Butirato de Sódio no Inflamassoma e Fatores Inflamatórios de Células IPEC-J2 Tratadas com H₂O₂
Conforme mostrado nas Figuras 3(a)–3(c), em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ aumentou significativamente o nível de mRNA e o nível de proteína de NLRP3, Caspase-1 e IL-1β em células IPEC-J2 (P < 0,05) e aumentou o conteúdo de IL-1β (P < 0,05); em comparação com o grupo H₂O₂, o butirato de sódio reduziu significativamente o nível de mRNA e a expressão proteica de NLRP3, Caspase-1 e IL-1β (P < 0,05) e reduziu o conteúdo de IL-1β (P < 0,05).
3.4. Efeito do Butirato de Sódio na Função de Barreira do Epitélio Intestinal de Células IPEC-J2 Tratadas com H₂O₂
Conforme mostrado na Figura 4(a), em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ reduziu significativamente a TER (P < 0,05) e aumentou o fluxo de FD4 (P < 0,05). Em comparação com o grupo H₂O₂, o pré-tratamento com butirato de sódio atenuou significativamente a diminuição induzida por H₂O₂ na TER e o aumento no fluxo de FD4 (P < 0,05). Em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ reduziu significativamente a expressão de Claudina-1, Ocludina e ZO-1 das células IPEC-J2 (P < 0,05); em comparação com o grupo H₂O₂, o pré-tratamento com butirato de sódio aumentou significativamente a expressão proteica de Claudina-1, Ocludina e ZO-1 nas células IPEC-J2 (P < 0,05) (Figura 4(b)). Conforme mostrado na Figura 4(c), a proteína Claudina-1 das células IPEC-J2 no grupo controle está distribuída principalmente próxima à membrana celular e forma um anel contínuo ao redor da membrana celular; mas em comparação com o grupo controle, o tratamento com H₂O₂ destruiu a distribuição e expressão normais de Claudina-1 (P < 0,05). O pré-tratamento com butirato de sódio preveniu o distúrbio na distribuição de Claudina-1 no limite celular e a diminuição da expressão proteica causada pelo H₂O₂ (P < 0,05).
3.5. Efeito do Butirato de Sódio na Mitofagia de Células IPEC-J2 Tratadas com H₂O₂
Conforme mostrado nas Figuras 5(a)–5(d), em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ aumentou significativamente a expressão de mRNA de LC3B, Beclina-1, ATG 5, PINK1 e Parkina das células IPEC-J2 e reduziu o nível de mRNA de P62 (P < 0,05). Em comparação com o grupo H₂O₂, o pré-tratamento com butirato de sódio aumentou ainda mais seu nível de mRNA (P < 0,05) e reduziu a expressão de mRNA de P62 (P < 0,05). Da mesma forma, em comparação com o grupo H₂O₂, o pré-tratamento com butirato de sódio aumentou ainda mais a expressão proteica de PINK1, Parkina, LC3B e Beclina-1 (P < 0,05) e diminuiu a expressão de P62 (P < 0,05). De acordo com os resultados de imunofluorescência (Figura 5(e)), descobrimos que, em comparação com o grupo controle, o H₂O₂ aumentou significativamente a intensidade de fluorescência de LC3B das células IPEC-J2 (P < 0,05); em comparação com o grupo H₂O₂, o pré-tratamento com butirato de sódio aumentou ainda mais a intensidade de fluorescência de LC3B (P < 0,05). Conforme mostrado na Figura 5(f), os resultados da microscopia confocal mostraram que, sob estresse oxidativo, o butirato de sódio promove a colocalização de LC3B e mitocôndrias e também aumenta a colocalização de PINK1, Parkina e LC3B (Figuras 5(g) e 5(h)). Da mesma forma, de acordo com os resultados do microscópio eletrônico de transmissão (MET), também observamos o aumento de vesículas de mitofagia sob o cotratamento com butirato de sódio e H₂O₂ (Figura 5(i)). Esses resultados indicam que o butirato de sódio promove a mitofagia em células IPEC-J2 tratadas com H₂O₂.
3.6. O Efeito do Butirato de Sódio no Estresse Oxidativo, Barreira Epitelial Intestinal e Mitofagia de Células IPEC-J2 após Inibição da Mitofagia ou AMPKα
Conforme mostrado nas Figuras 6(a)–6(c), em comparação com o grupo H2O2, o butirato de sódio aumentou a atividade da SOD (P < 0,05) e diminuiu o nível de MDA (P < 0,05). Em comparação com o grupo NaB+H2O2, o tratamento com Mdivi-1 ou Compound C aumentou o nível de MDA (P < 0,05) e inibiu a atividade da SOD (P < 0,05). Esses resultados indicam que a inibição da mitofagia e da AMPKα enfraquece o efeito antioxidante do butirato de sódio. Conforme mostrado na Figura 6(d), em comparação com o grupo NaB+H2O2, os tratamentos com Mdivi-1 e Compound C aumentaram significativamente (P < 0,05) a porcentagem de células despolarizadas (refletindo a diminuição do potencial de membrana mitocondrial). Em comparação com o grupo NaB+H2O2, os tratamentos com Mdivi-1 e Compound C aumentaram significativamente os níveis de ROS nas células IPEC-J2 (P < 0,05) (Figura 6(e)). Esses resultados indicam que a inibição da mitofagia ou da AMPKα enfraquece os efeitos protetores do butirato de sódio sobre as mitocôndrias sob estresse oxidativo. Conforme mostrado nas Figuras 6(f) e 6(g), em comparação com o grupo NaB+H2O2, o tratamento com Mdivi-1 ou Compound C reduziu significativamente a TER (P < 0,05) e aumentou o FD4 (P < 0,05). O tratamento com Mdivi-1 ou Compound C também reduziu a expressão das proteínas de junção de oclusão Claudina-1, Ocludina e ZO-1 (P < 0,05). Os dados indicaram que a inibição da mitofagia ou da AMPKα enfraqueceu os efeitos protetores do butirato de sódio na função de barreira do epitélio intestinal sob estresse oxidativo.
3.7. O Efeito do Butirato de Sódio na Mitofagia das Células IPEC-J2 após Inibição da Mitofagia ou da AMPKα
Conforme mostrado nas Figuras 7(a) e 7(b), em comparação com o grupo NaB+H2O2, o tratamento com Mdivi-1 ou Compound C reduziu significativamente os níveis de Beclina-1 (P < 0,05) e aumentou os níveis de P62 (P < 0,05). Da mesma forma, em comparação com o grupo NaB+H2O2, o tratamento com Mdivi-1 ou Compound C também reduziu os níveis de expressão das proteínas de mitofagia PINK1 e Parkina (P < 0,05). O resultado de imunofluorescência mostrou que a inibição da mitofagia ou da AMPKα reduziu a co-localização de LC3B e mitocôndrias e reduziu a co-localização de PINK1 e LC3B (Figuras 7(c) e 7(d)). Esses resultados indicam que a inibição da mitofagia e da AMPKα suprime a indução da mitofagia pelo butirato de sódio.
3.8. O Efeito do Butirato de Sódio na Mitofagia, Estresse Oxidativo e Barreira do Epitélio Intestinal das Células IPEC-J2 após Interferência com AMPKα
Conforme mostrado na Figura 8(a), a interferência com AMPKα reduziu (P < 0,05) a expressão proteica de PINK1 e Parkin e aumentou o nível de expressão proteica de P62 (P < 0,05) quando comparada ao grupo H2O2 e ao grupo NaB+H2O2. Os resultados indicaram que a interferência com AMPKα bloqueou o aumento da mitofagia induzido pelo butirato de sódio. Conforme mostrado nas Figuras 8(b)–8(f), os resultados demonstraram que a interferência com AMPKα reduziu significativamente a atividade da SOD e aumentou o nível de MDA (P < 0,05) quando comparada ao grupo NaB+H2O2. A interferência com AMPKα aumentou a produção de ROS (P < 0,05) e diminuiu o potencial de membrana mitocondrial (P < 0,05) quando comparada ao grupo H2O2 e ao grupo NaB+H2O2, indicando que o papel do butirato de sódio em aliviar o estresse oxidativo celular e a disfunção mitocondrial foi neutralizado. A partir dos resultados, pôde-se concluir que a mitofagia mediada por AMPKα é necessária para os efeitos protetores do butirato de sódio sobre o estado redox celular e a função mitocondrial. Conforme mostrado nas Figuras 8(g) e 8(h), a interferência com AMPKα aumentou significativamente a expressão proteica de NLRP3 e Caspase-1 quando comparada aos grupos H2O2 e NaB+H2O2 (P < 0,05), indicando que a interferência com AMPKα reduziu significativamente a inibição da ativação de NLRP3 pelo butirato de sódio. Ao mesmo tempo, a interferência com AMPKα resultou em uma diminuição na TER (P > 0,05) e um aumento no FD4 (P > 0,05), indicando que a interferência com AMPKα enfraqueceu o efeito protetor do butirato de sódio na barreira do epitélio intestinal. A partir dos resultados, pôde-se concluir que a AMPKα é necessária para que o butirato de sódio iniba a inflamação intestinal e proteja a barreira do epitélio intestinal das células IPEC-J2 sob estresse oxidativo.
4. Discussão
Ma et al. relataram que o butirato de sódio poderia aliviar o dano à barreira epitelial intestinal das células IPEC-J2 e regular o nível antioxidante celular. Até o momento, não foram encontrados dados sobre o efeito do butirato de sódio no dano intestinal induzido por estresse oxidativo em células IPEC-J2. O presente estudo demonstrou que o butirato de sódio protegeu as células IPEC-J2 do estresse oxidativo induzido por H2O2, conforme indicado pelo aumento das atividades de SOD e GSH e pela diminuição dos níveis de MDA e ROS nas células IPEC-J2. Da mesma forma, Russo et al. descobriram que o butirato poderia inibir efetivamente a diminuição da atividade da glutationa transferase (GST) e o aumento do nível de ROS induzidos por LPS em células Caco-2. A produção excessiva de ROS afetaria a cadeia respiratória eletrônica das mitocôndrias, abriria os poros de transição de permeabilidade mitocondrial e levaria à despolarização das membranas mitocondriais. Descobrimos que o butirato de sódio aliviou a diminuição induzida por H2O2 no potencial de membrana mitocondrial (MMP), conforme indicado pela diminuição da proporção de células despolarizadas e pelo aumento da razão da intensidade de fluorescência vermelha (polímero JC-1)/verde (monômero JC-1) em comparação com o grupo H2O2. Em consonância com nossa pesquisa, Li et al. relataram que o butirato de sódio inibiu a perda de MMP induzida por LPS em células epiteliais mamárias bovinas. O aumento da produção de ROS nas mitocôndrias e a diminuição do MMP nas mitocôndrias podem levar a danos no DNA mitocondrial, o que pode estar relacionado à biogênese mitocondrial anormal. Descobrimos que o butirato de sódio aliviou a disfunção mitocondrial aumentando os níveis de expressão de mtDNA e mRNA dos genes relacionados à função mitocondrial TFAM, NRF-1 e PGC-1α. Da mesma forma, um estudo anterior descobriu que o butirato de sódio aliviou o dano oxidativo das células HepG2, conforme indicado pelo aumento do número de cópias de mtDNA e da expressão de mRNA de PGC-1α e TFAM. As alterações na função mitocondrial serão acompanhadas por alterações na ultraestrutura mitocondrial. Nossa pesquisa mostrou que o H2O2 causou inchaço mitocondrial evidente, ruptura das cristas respiratórias e vacuolização mitocondrial, enquanto o pré-tratamento com butirato de sódio melhorou significativamente a ultraestrutura das mitocôndrias. As alterações na ultraestrutura das mitocôndrias não são apenas a base estrutural do dano oxidativo mitocondrial, mas também levam à liberação de Cit c das mitocôndrias para o citoplasma. Descobrimos que o H2O2 aumentou o nível de Cit c no citoplasma e diminuiu o nível de Cit c nas mitocôndrias, sugerindo que o H2O2 aumentou a permeabilidade das membranas mitocondriais interna e externa, causando a liberação de Cit c mitocondrial para o citoplasma. Enquanto isso, o butirato de sódio aliviou a liberação de Cit c mitocondrial induzida por H2O2, indicando que o tratamento com butirato de sódio poderia ajudar a melhorar a função mitocondrial sob estresse oxidativo. Os resultados acima revelaram que o butirato de sódio poderia aliviar efetivamente o desequilíbrio do estado redox e o comprometimento mitocondrial induzidos por H2O2.
A barreira intestinal é uma importante linha de defesa do organismo para impedir que substâncias nocivas invadam o corpo, e manter sua integridade é vital para a saúde do organismo. Descobrimos que o butirato de sódio aliviou significativamente a lesão da barreira do epitélio intestinal induzida por H₂O₂ em células IPEC-J2, conforme indicado pelo aumento da TER do epitélio intestinal e pela diminuição da permeabilidade ao FD4. Da mesma forma, Valenzano et al. e Wang et al. descobriram que o tratamento de células Caco-2 com uma determinada concentração de ácido butírico poderia melhorar efetivamente a barreira do epitélio intestinal. O butirato de sódio também inibiu significativamente a diminuição de Claudina-1, Ocludina e ZO-1 em células IPEC-J2 induzida por H₂O₂. Consistente com nossa pesquisa, Yan e Ajuwon descobriram que o butirato de sódio aumentou o nível proteico de Claudina-3 e Claudina-4, aliviando assim o dano do LPS à integridade de células IPEC-J2 em monocamada. A integridade das células epiteliais intestinais não está relacionada apenas ao nível de expressão da proteína de junção apertada, mas também é afetada por sua área de distribuição. Em nosso estudo, descobrimos que após o tratamento com H₂O₂, a distribuição e expressão normais de Claudina-1 foram destruídas e o butirato de sódio preveniu o distúrbio na distribuição de Claudina-1 e a diminuição na expressão de Claudina-1 causados por H₂O₂. Da mesma forma, estudos descobriram que, quando as células Caco-2 eram submetidas a estímulos adversos, as proteínas Ocludina e ZO-1 originalmente expressas na membrana celular eram transferidas para o citoplasma, aumentando assim a permeabilidade celular; no entanto, o ácido butírico promoveu a redistribuição das proteínas de junção apertada e aumentou o nível de expressão das junções apertadas. Esses resultados indicaram que o butirato de sódio poderia aliviar efetivamente o dano à barreira do epitélio intestinal e o distúrbio na expressão e distribuição das proteínas de junção apertada induzidos por H₂O₂ em células IPEC-J2.
O estresse oxidativo pode causar inflamação intestinal, conforme comprovado pelo fato de que a produção excessiva de ROS nos intestinos de pacientes com colite ulcerativa e doença de Crohn enfraqueceu a capacidade antioxidante e agravou o dano oxidativo. De acordo com nossos resultados, H₂O₂ aumentou a expressão de mRNA e proteína de NLRP3, Caspase-1 e IL-1β em células IPEC-J2 e aumentou o conteúdo de IL-1β, enquanto o pré-tratamento com butirato de sódio aliviou esse fenômeno. Da mesma forma, o inflamassoma NLRP3 e a IL-1β foram ativados por H₂O₂ em fígados de ratos. Jiang et al. também descobriram que, em macrófagos bovinos, o butirato de sódio poderia reduzir a resposta inflamatória causada por LPS ao inibir as vias de sinalização NF-κB e NLRP3. De acordo com os resultados, supusemos que o butirato de sódio poderia inibir efetivamente a ativação de NLRP3 e aliviar a inflamação intestinal induzida por H₂O₂.
A mitofagia é um mecanismo de autoproteção para remover mitocôndrias disfuncionais. No entanto, não havia relatos sobre o efeito do butirato de sódio na mitofagia de células IPEC-J2. Descobrimos que o butirato de sódio potencializou a mitofagia de células IPEC-J2, conforme indicado pelo aumento do nível de mRNA e proteína da proteína mitofágica e pela promoção da colocalização de LC3B e mitocôndrias, bem como da colocalização de PINK1, Parkin e LC3B; enquanto isso, também descobrimos que o butirato de sódio aumentou as vesículas de mitofagia sob TEM. Da mesma forma, Zhou et al. descobriram que o ácido butírico pode regular a autofagia das células epiteliais intestinais através da via HIF-1α para aliviar a colite. Wang et al. descobriram que o butirato de sódio ativou a via PINK1-Parkin e induziu a mitofagia. J. S. Lee e G. M. Lee também descobriram que o butirato de sódio poderia induzir a mitofagia em células de ovário de hamster Chinês (CHO), e a proteína mitofágica Parkin foi recrutada para as mitocôndrias, sugerindo que o butirato de sódio induziu a mitofagia para remover mitocôndrias danificadas. De acordo com os resultados acima, era razoável supor que o butirato de sódio poderia regular o PINK1 e a Parkin e desencadear a mitofagia para obliterar as mitocôndrias danificadas causadas por H2O2, o que poderia prevenir o intestino da colite.
No presente experimento, descobrimos que o butirato de sódio protegeu as células IPEC-J2 contra danos oxidativos induzidos por H2O2, danos à barreira do epitélio intestinal e comprometimento mitocondrial, além de aumentar a mitofagia, mas seu mecanismo molecular específico ainda precisava ser mais estudado. A AMPK é um sensor de energia chave que pode regular o metabolismo energético celular. Mollica et al. relataram que a administração de butirato de sódio a camundongos obesos resistentes à insulina pode aumentar a atividade da AMPK hepática, reduzir a produção de ERO e melhorar a função mitocondrial hepática. No entanto, se o butirato de sódio poderia aliviar o estresse oxidativo das células IPEC-J2 através da mitofagia dependente de AMPK ainda precisava ser mais explorado. Portanto, nos experimentos seguintes, utilizamos inibidor de AMPK e inibidor de mitofagia para explorar o papel específico da via de sinalização AMPK e da mitofagia nos efeitos protetores do butirato de sódio na barreira do epitélio intestinal. Descobrimos que o butirato de sódio inibiu a diminuição da atividade da SOD e o aumento do nível de MDA induzidos por H2O2. No entanto, o uso do inibidor de mitofagia Mdivi-1 ou do inibidor de AMPK Compound C aumentou os níveis celulares de MDA e reduziu a atividade da SOD. Esses resultados indicaram que a inibição da mitofagia e da AMPK poderia reduzir o efeito antioxidante do butirato de sódio. Da mesma forma, Guo et al. descobriram que o ácido butírico ativou a via de sinalização AMPK através do GPR109A em células epiteliais mamárias bovinas (BMECs) e, em seguida, exerceu um efeito antioxidante. Descobrimos que o nível de ERO e a porcentagem de células despolarizadas aumentaram significativamente após o uso do inibidor de mitofagia Mdivi-1 ou do inibidor de AMPK Compound C. Similarmente, Zhao et al. relataram que altas concentrações de insulina em células HepG2 poderiam reduzir significativamente o DNA mitocondrial e diminuir o potencial de membrana mitocondrial, enquanto o butirato de sódio aumentou significativamente o potencial de membrana mitocondrial e o DNA mitocondrial, o que estava envolvido na via de sinalização GPR43-β-AMPK. Também relatamos anteriormente que a tributirina ativou a via de sinalização AMPK-mTOR e melhorou a função mitocondrial intestinal em leitões desmamados. Esses resultados indicaram que a inibição da mitofagia ou da AMPKα inibiu os efeitos protetores do butirato de sódio na melhora das mitocôndrias sob estresse oxidativo das células IPEC-J2.
Além disso, descobrimos que o uso do inibidor de mitofagia Mdivi-1 e do inibidor de AMPK Compound C prejudicou a função de barreira do epitélio intestinal, conforme indicado pela diminuição da TER e do nível de expressão de junções oclusivas e pelo aumento da permeabilidade ao FD4 das células IPEC-J2. De forma similar, Elamin et al. relataram que o butirato de sódio atenuou a disfunção de barreira das células Caco-2 induzida por etanol in vitro, cujos efeitos protetores foram suprimidos por inibidores de AMPK ou siRNA. Miao et al. descobriram que, nas células Caco-2, o butirato de sódio ativou a AMPK, promovendo assim a reorganização das junções oclusivas. Portanto, era razoável supor que a mitofagia e a AMPK eram necessárias para que o butirato de sódio melhorasse a barreira do epitélio intestinal sob estresse oxidativo induzido por H2O2. Além disso, também descobrimos que o uso do inibidor de mitofagia Mdivi-1 ou do inibidor de AMPK Compound C inibiu a mitofagia, conforme indicado pela diminuição do nível de expressão da proteína mitofágica e da colocalização de PINK1 e LC3B, sugerindo que a inibição da mitofagia ou da AMPK poderia suprimir a mitofagia induzida pelo butirato de sódio. De acordo com nossos resultados, Evans et al. descobriram que o butirato induziu a apoptose celular dependente de autofagia da célula epitelial gengival humana Ca9-22 para aliviar a doença periodontal, conforme indicado pela ativação da AMPK e indução da produção de LC3B, que foi atenuada pela inibição da AMPK; além disso, a interferência com o gene LC3B também pôde inibir significativamente a morte celular induzida por butirato. Portanto, a mitofagia mediada por AMPK é necessária para os efeitos protetores do butirato de sódio contra o estresse oxidativo.
Para confirmar ainda mais o papel da AMPK na mitofagia induzida pelo butirato de sódio em células IPEC-J2, utilizamos então a tecnologia de siRNA para silenciar a AMPKα, conhecida como a subunidade catalítica dominante da AMPK. Descobrimos que a interferência com AMPKα reduziu o nível de expressão de PINK1 e Parkin e aumentou o nível de P62 quando comparada ao grupo H2O2 e ao grupo NaB+H2O2. De forma similar, Luo et al. descobriram que o butirato de sódio aumentou o nível de expressão de mRNA e proteína de LC3B e ativou a AMPK fosforilada, o que foi suprimido pelo tratamento com siRNA AMPK em células de câncer colorretal. Esses resultados indicaram que a AMPKα pode mediar a mitofagia induzida pelo butirato de sódio. Em seguida, descobrimos que a interferência com AMPKα aumentou significativamente o nível de MDA e produção de ROS e diminuiu o MMP, indicando que os efeitos protetores do butirato de sódio na atenuação do estresse oxidativo celular e na disfunção mitocondrial foram enfraquecidos. Além disso, a interferência com AMPKα aumentou significativamente a expressão proteica de NLRP3 e Caspase-1 em células IPEC-J2, indicando que a interferência com AMPKα enfraqueceu o efeito inibitório do butirato de sódio sobre os fatores inflamatórios NLRP3. Ao mesmo tempo, a interferência com AMPKα prejudicou a função de barreira do epitélio intestinal, conforme indicado pela diminuição da TER e pelo aumento da permeabilidade ao FD4 das células IPEC-J2, sugerindo que a interferência com AMPKα enfraqueceu os efeitos protetores do butirato de sódio na barreira do epitélio intestinal. Nossos resultados sugeriram que o butirato de sódio pode promover a mitofagia via ativação da AMPK, proteger as mitocôndrias e exercer um efeito protetor na barreira do epitélio intestinal de células IPEC-J2 sob estresse oxidativo.
5. Conclusão
Em conclusão, nosso trabalho revelou que o butirato de sódio melhorou o estresse oxidativo e a inflamação e potencializou a função de barreira do epitélio intestinal e a função mitocondrial através da via AMPK-mitofagia em células IPEC-J2.
Abreviações
AMPK:
Proteína quinase ativada por adenosina 5′-monofosfato (AMP-)
CC:
Composto C
Cyt c:
Citocromo c
FD4:
Dextrano isotiocianato de fluoresceína de 4 kDa
GSH:
Glutationa redutase
H2O2:
Peróxido de hidrogênio
IPEC-J2:
Células epiteliais intestinais suínas
IL-1β:
Interleucina-1β
SOD:
Superóxido dismutase
LC3B:
Proteína B associada à cadeia leve
mtDNA:
DNA mitocondrial
MDA:
Malondialdeído
Mdivi-1:
Inibidor da divisão mitocondrial 1
NRF-1:
Fator respiratório nuclear 1
NaB:
Butirato de sódio
NLRP3:
Proteína 3 contendo domínio pirina da família NLR recombinante
PINK1:
Quinase putativa 1 induzida por PTEN
PGC-1α:
Coativador-1α do receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo
ROS:
Espécies reativas de oxigênio
TFAM:
Fator A de transcrição mitocondrial
TER:
Resistência transepitelial
ZO-1:
Zônula oclusiva-1.
Disponibilidade de Dados
Os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis junto ao autor correspondente mediante solicitação lógica.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes Chinesas para Bem-Estar Animal e Protocolo Experimental e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Zhejiang.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram que não há conflito de interesse.
Contribuições dos Autores
Caihong Hu projetou todo o esquema dos experimentos; Xin Li, Chunchun Wang, Jiang Zhu, Qian Lin, Minjie Yu e Jiashu Wen conduziram os experimentos; Xin Li e Chunchun Wang analisaram os dados e prepararam o manuscrito inicial; Jie Feng revisou o manuscrito; Caihong Hu teve a responsabilidade principal pelo conteúdo final. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final. Chunchun Wang é co-primeiro autor.
Materiais Suplementares
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Butirato de sódio alivia as respostas inflamatórias induzidas por lipopolissacarídeo através da regulação negativa das vias de sinalização NF-κB, NLRP3 e ativação da acetilação de histonas em macrófagos bovinos
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Função mitocondrial modulada pelo butirato de sódio na disfunção de células HepG2 induzida por alta insulina
O butirato de sódio promove a remontagem das junções de oclusão em monocamadas de Caco-2 envolvendo a inibição da via MLCK/MLC2 e a fosforilação da PKCβ2
Efeitos combinados da privação de nutrientes e do butirato na morte de células epiteliais gengivais dependente de autofagia
O butirato de sódio induz autofagia em células de câncer colorretal via sinalização LKB1/AMPK
Efeitos do butirato de sódio (NaB) no estresse oxidativo de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) tratadas com peróxido de hidrogênio (H2O2). (a–c) Efeito de diferentes concentrações de H2O2 e NaB na viabilidade celular. (d–f) Atividade da superóxido dismutase (SOD) e glutationa redutase (GSH) celular, e nível de malondialdeído (MDA). (g) Citometria de fluxo para quantificar o nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células IPEC-J2. Letras sobrescritas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (P < 0,05). ∗ e # indicam diferenças significativas (P < 0,05) em relação ao grupo controle.
Efeitos do butirato de sódio (NaB) na função mitocondrial de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) tratadas com H2O2. (a) Citometria de fluxo para detectar alterações no potencial de membrana mitocondrial celular. (b) Razão entre vermelho e verde da mitocôndria JC-1 em microscópio confocal a laser e resultados da quantificação. (c, d) Conteúdo de DNA mitocondrial (mtDNA) e expressão gênica do fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fator nuclear respiratório-1 (NRF-1) e coativador 1α do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PGC-1α). (e) Ultrastrutura das mitocôndrias em microscópio eletrônico de transmissão (TEM). (f) Expressão proteica e quantificação do citocromo c. Letras sobrescritas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (P < 0,05).
Efeitos do butirato de sódio (NaB) no inflamassoma e fatores inflamatórios de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) tratadas com H2O2. (a) Expressão proteica e quantificação da proteína 3 contendo domínio pirina da família NLR recombinante (NLRP3), Caspase-1 e IL-1β. (b) Expressão gênica relativa de NLRP3, Caspase-1, ASC e IL-1β. (c) Conteúdo de IL-1β nas células IPEC-J2. Letras sobrescritas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (P < 0,05).
Efeitos do butirato de sódio (NaB) na função de barreira de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) tratadas com peróxido de hidrogênio (H2O2). (a) Resistência transepitelial (TER) e permeabilidade ao dextrano isotiocianato de fluoresceína 4 kDa (FD4) do epitélio intestinal. (b) Expressão proteica e quantificação de Claudina-1, Ocludina e ZO-1. (c) Distribuição e quantificação da proteína Claudina-1 em microscópio confocal. Letras sobrescritas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (P < 0,05).
Efeitos do butirato de sódio (NaB) na mitofagia de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) tratadas com H2O2. (a, b) Nível de expressão de mRNA de genes relacionados à autofagia. (c, d) Western blot da expressão e quantificação de proteínas relacionadas à autofagia. (e) Expressão e quantificação da proteína B associada à cadeia leve (LC3B) sob microscópio confocal a laser. (f) Colocalização do Mito Red mitocondrial e da proteína de autofagia LC3B sob microscópio confocal a laser. (g) Colocalização das proteínas de mitofagia PINK1 e LC3B sob microscópio confocal a laser. (h) Colocalização das proteínas de mitofagia Parkin e LC3B sob microscópio confocal a laser. (i) Vesículas de mitofagia sob microscópio eletrônico de transmissão. Diferentes letras sobrescritas na mesma linha indicam diferença significativa (P < 0,05).
Efeitos do butirato de sódio (NaB) no estresse oxidativo, na barreira do epitélio intestinal e na mitofagia de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2) após inibição da mitofagia ou AMPK. (a–c) Atividade da superóxido dismutase (SOD), glutationa redutase (GSH) e conteúdo de malondialdeído (MDA) de IPEC-J2 tratadas com Mdivi-1 ou Compound C (CC). (d) Quantificação do potencial de membrana mitocondrial celular por citometria de fluxo. (e) Quantificação do nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) celular por citometria de fluxo. (f) Resistência transepitelial (TER) do epitélio intestinal e permeabilidade ao dextrano 4 kDa marcado com isotiocianato de fluoresceína (FD4). (g) Expressão e quantificação das proteínas de junção apertada Claudina-1, Ocludina e ZO-1. ∗ indica diferença significativa em comparação com o grupo controle (P < 0,05); # indica diferença significativa em comparação com o grupo H2O2 (P < 0,05); & indica diferença significativa em comparação com o grupo NaB+H2O2 (P < 0,05).
Efeitos do butirato de sódio (NaB) na mitofagia de células epiteliais intestinais suínas (IEPC-J2) após inibição da mitofagia ou AMPK. (a, b) Expressão e quantificação de proteína de autofagia. (c) Colocalização de mitocôndrias e proteína B associada à cadeia leve (LC3B) sob microscópio confocal a laser. (d) Colocalização das proteínas de mitofagia PINK1 e LC3B sob microscópio confocal a laser. ∗ indica diferença significativa em comparação com o grupo controle (P < 0,05); # indica diferença significativa em comparação com o grupo H2O2 (P < 0,05); & indica diferença significativa em comparação com o grupo NaB+H2O2 (P < 0,05).
Efeitos do butirato de sódio (NaB) na mitofagia, estresse oxidativo e barreira do epitélio intestinal após interferência com AMPKα. (a) Expressão e quantificação das proteínas de mitofagia PINK1, Parkin e P62. (b–d) Atividade da superóxido dismutase (SOD), glutationa redutase (GSH) e conteúdo de malondialdeído (MDA) de células epiteliais intestinais suínas (IPEC-J2). (e) Nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) celulares de IPEC-J2. (f) Potencial de membrana mitocondrial celular de IPEC-J2. (g) Expressão e quantificação de proteína recombinante da família NLR, proteína 3 contendo domínio pirina (NLRP3) e Caspase-1. (h) Resistência transepitelial (TER) do epitélio intestinal e permeabilidade ao dextrano 4 kDa marcado com isotiocianato de fluoresceína (FD4). ∗ indica diferença significativa em comparação com o grupo controle (P < 0,05).