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pmid: "38888634"
title: "Inibir o receptor CB1 no modelo animal induzido por CIH alivia a lesão no cólon."
authors: "Wang PP, Cheng XQ, Dou ZJ, Fan YQ, Chen J, Zhao L, Han JX, Lin XW, Wang B"
journal: "Applied microbiology and biotechnology"
pubdate: "2024 Jun 18"
doi: "10.1007/s00253-024-13216-0"
source: "PMC Full Text"

Inibir o receptor CB1 no modelo animal induzido por CIH alivia a lesão no cólon.

Autores

Wang PP, Cheng XQ, Dou ZJ, Fan YQ, Chen J, Zhao L, Han JX, Lin XW, Wang B

Periodico

Applied microbiology and biotechnology (2024 Jun 18)

Conteudo

Inibir o receptor CB1 em modelo animal induzido por HIC alivia a lesão do cólon
Resumo
A apneia obstrutiva do sono (AOS) pode levar a lesão intestinal, endotoxemia e distúrbio da flora intestinal. Além disso, como um componente crucial do sistema endocanabinoide, alguns estudos demonstraram que os receptores canabinoides 1 (CB1) estão intimamente ligados à disfunção de múltiplos órgãos desencadeada pela AOS. No entanto, o papel do receptor CB1 no alívio da lesão do cólon induzida pela AOS permanece incerto. Aqui, através da construção do modelo clássico de AOS, descobrimos que o tecido do cólon de camundongos induzidos por hipóxia intermitente crônica (HIC) apresentava superexpressão do receptor CB1. Os resultados da coloração por hematoxilina-eosina e da microscopia eletrônica de transmissão revelaram que a inibição do receptor CB1 poderia diminuir o espaço entre a mucosa e a muscular da mucosa, aliviar o inchaço mitocondrial, reduzir a perda de microvilosidades e promover a recuperação das junções oclusivas em camundongos induzidos por HIC. Além disso, a inibição do receptor CB1 reduziu os níveis de endotoxemia metabólica e respostas inflamatórias, exibindo efeitos protetores significativos na lesão do cólon causada pela HIC. No nível molecular, através das técnicas de western blotting e reação em cadeia da polimerase em tempo real, descobrimos que a inibição do receptor CB1 pode aumentar significativamente a expressão das proteínas ZO-1 e Ocludina, que estão intimamente relacionadas à manutenção da função de barreira da mucosa intestinal. Através do sequenciamento de alto rendimento do rRNA 16S e da determinação de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), descobrimos que a inibição do receptor CB1 aumentou a diversidade da flora microbiana e controlou a composição da flora intestinal. Além disso, a concentração de ácido butírico e a quantidade de bactérias produtoras de AGCC, como Ruminococcaceae e Lachnospiraceae, foram ambas marcadamente elevadas pela inibição do receptor CB1. Os resultados do estudo de correlação de Spearman indicaram que Lachnospiraceae mostrou uma associação positiva tanto com ZO-1 quanto com Ocludina, mas foi correlacionada negativamente com o receptor CB1 do cólon, IL-1β e TNF-α. De acordo com este estudo, descobrimos que inibir o receptor CB1 pode melhorar a lesão do cólon induzida por HIC através da regulação da microbiota intestinal, reduzindo o dano da mucosa e promovendo a recuperação das junções oclusivas.
Pontos-chave
•A HIC leva à superexpressão do receptor CB1 no tecido do cólon.
•A HIC causa desordem da flora intestinal, dano à mucosa intestinal e ruptura das junções oclusivas.
•A inibição do receptor CB1 pode aliviar a lesão do cólon causada pela HIC através da regulação da microbiota intestinal, reduzindo o dano à mucosa e promovendo a recuperação das junções oclusivas.
Resumo gráfico
Introdução
A apneia obstrutiva do sono (AOS) é uma condição comum do sono caracterizada pelo colapso repetido do trato respiratório superior que interfere nos padrões normais de respiração durante o sono. A AOS pode levar à hipóxia intermitente crônica (HIC), excitação simpática e fragmentação do sono devido ao colapso do trato respiratório superior. Entre essas características, a consequência mais grave da AOS é a indução da HIC, resultando em um estado sustentado de níveis reduzidos de oxigênio em todo o corpo (Myers et al.). Pesquisas crescentes apontam que a AOS está intimamente relacionada ao aparecimento e desenvolvimento de diabetes, hipertensão, disfunção cognitiva, cânceres e outras doenças (Drager et al.; Kheirandish-Gozal e Gozal; Yeghiazarians et al.; Sánchez-de-la-Torre et al.). No entanto, o mecanismo-chave não foi esclarecido e uma exploração adicional ainda é necessária.

A barreira intestinal constitui a interação entre o ambiente humano e o mundo externo. A propriedade de membrana semipermeável da estrutura intestinal fornece uma base para a troca de substâncias dentro e fora do intestino, absorção de nutrientes, manutenção da homeostase corporal e vigilância e resposta imunológica (Suzuki; Allam-Ndoul et al.). A composição da barreira intestinal é muito complexa, incluindo a flora intestinal, camada mucosa, camada de células epiteliais, células imunes na lâmina própria e as proteínas de junção apertada ZO-1 e Ocludina responsáveis por regular o espaço paracelular das células epiteliais (Allam-Ndoul et al.; Di Tommaso et al.). De acordo com pesquisas relevantes, observou-se que a HIC leva a uma diminuição das células caliciformes da mucosa intestinal, redução das proteínas de junção apertada, aumento dos marcadores associados à barreira intestinal prejudicada, bem como alterações na abundância e diversidade da microbiota intestinal (Wang et al.; Li et al.). A integridade da barreira intestinal é subsequentemente comprometida.

O sistema endocanabinoide é um sistema de sinalização composto por endocanabinoides, receptores canabinoides e várias proteínas envolvidas no metabolismo. Os principais endocanabinoides são a N-araquidonoil etanolamina e o 2-araquidonoil glicerol, e os receptores CB1 e CB2 são os dois receptores canabinoides mais amplamente estudados atualmente (Iannotti et al.). Os receptores CB1 estão distribuídos no sistema nervoso central, fígado, músculo esquelético, rim e trato digestivo, enquanto os receptores CB2 estão distribuídos principalmente no sistema imunológico periférico. Estudos anteriores mostraram que a expressão do receptor CB1 aumentou em vários tecidos, como rim, osso e cérebro, sob condições de HIC. Enquanto isso, o antagonista do receptor CB1 poderia aliviar os danos aos órgãos causados pela HIC (Gao et al.; Dou et al.; Zhao et al.). Isso sugere, portanto, que o sistema endocanabinoide está envolvido nos danos aos órgãos causados pela AOS.
Múltiplas pesquisas descobriram que a manutenção da barreira intestinal é regulada através do sistema canabinoide. Estudos recentes mostraram que a ativação de receptores canabinoides através de fitocanabinoides pode restaurar a integridade da barreira intestinal promovendo a expressão de proteínas de junção apertada, facilitando a secreção de muco, melhorando os distúrbios da flora intestinal e inibindo a inflamação (Alhamoruni et al.; Becker et al.). No entanto, o impacto do sistema canabinoide na barreira intestinal e seu mecanismo ainda são controversos. Porque alguns estudos apontaram que a ativação do receptor CB1 pode levar à destruição da barreira intestinal (Mehrpouya-Bahrami et al.). Enquanto isso, outro estudo também demonstrou que o antagonista do receptor CB1 pode prevenir ainda mais a via da lipopolissacarídeo (LPS) do intestino para a circulação. Em comparação com o grupo controle, a diminuição do LPS sérico no grupo antagonista do receptor CB1 indica uma reparação adicional da barreira intestinal (Muccioli et al.). Como mencionado acima, os danos multiorgânicos causados pela CIH estão relacionados à expressão anormal do receptor CB1, e os receptores canabinoides estão intimamente relacionados à integridade da barreira intestinal. Portanto, se o receptor CB1 é o mecanismo chave do dano à barreira intestinal causado pela CIH ainda precisa de maior esclarecimento. Nenhum estudo anterior explorou os efeitos de antagonistas no comprometimento da barreira intestinal causado pela CIH. Propomos a hipótese de que a exposição à CIH pode levar à ruptura da integridade da barreira intestinal e à ocorrência de distúrbio da flora intestinal, e que o uso de antagonista do receptor CB1 pode reverter esses efeitos. Descobrimos, pela primeira vez, que a inibição do receptor CB1 pode aliviar a lesão do cólon causada pela CIH através da regulação da microbiota intestinal, redução da lesão da mucosa e promoção da recuperação das junções apertadas.
Materiais e métodos
Agrupamento animal e intervenção
O tratamento dos animais experimentais está de acordo com os requisitos éticos chineses (Ethics No. :SYDL20200011). Camundongos C57BL/6 machos com idades entre 4 e 5 semanas foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Shanxi e mantidos em ambiente livre de patógenos específicos (SPF) com dieta normal (20,3% kcal de proteína, 15,8% kcal de gordura e 63,9% kcal de carboidratos). Os camundongos foram arbitrariamente divididos em três grupos (n = 6 para cada grupo) da seguinte forma: (1) Grupo controle, (2) Grupo CIH e (3) Grupo CIH tratado com antagonista do receptor CB1 (grupo AM251). Especificamente, os camundongos foram submetidos a injeção intraperitoneal do antagonista do receptor CB1 AM251 (1 mg/kg) antes de entrar na câmara de hipóxia intermitente. O AM251 é um antagonista seletivo do receptor CB1, amplamente utilizado em diversos experimentos. O efeito inibitório do AM251 sobre o receptor CB1 é significativamente confiável (Sugawara et al.; Caltana et al.; Higginbotham et al.). Os camundongos expostos à CIH foram colocados na câmara de hipóxia intermitente às 9:00 da manhã todos os dias até as 17:00. Os camundongos foram mantidos em ambiente de ar normal ou CIH por 6 semanas antes dos experimentos seguintes.

Modelo de hipóxia intermitente crônica em camundongos
Os camundongos expostos à CIH foram colocados na câmara de hipóxia OxyCycler Model A84 (Biospherix, Parish, NY, EUA), configurada em modo de concentração alternada de oxigênio de 9–21% e preenchida com nitrogênio comprimido de alta pureza e oxigênio comprimido de alta pureza por 120s por ciclo. No aparato experimental, o nitrogênio foi injetado para reduzir a concentração de oxigênio de 21% para 9% em 50s, e a condição de hipóxia foi mantida por 10s. Em seguida, oxigênio de alta pureza foi injetado por 50s, elevando rapidamente a concentração de oxigênio de volta para 21%, que foi então mantida por mais 10s. O ciclo de hipóxia-reoxigenação foi repetido 30 vezes a cada hora, com a menor concentração de oxigênio sendo ± 9%, conforme descrito anteriormente (Dou et al.; Zhao et al.). Este protocolo foi realizado continuamente por 8 h a cada dia, das 9:00 às 17:00.

Anticorpos
O antagonista do receptor CB1 AM251 foi adquirido da Topscience (Xangai, China, No: T1915), e os anticorpos de coelho anti-camundongo Occludina (GB111402) e ZO-1 (GB11149) foram adquiridos da Servicebio (Wuhan, China); o anticorpo de coelho anti-camundongo CB1R foi adquirido da Thermo Fisher (Waltham, MA, EUA). O segundo anticorpo de cabra anti-coelho foi adquirido da Wuhan Sanying (Wuhan, China).

Coloração de hematoxilina-eosina (HE)
Tecidos do cólon de camundongos foram coletados e fixados usando solução de paraformaldeído a 4%. A inclusão em parafina do tecido foi realizada após a fixação, então os tecidos foram seccionados (5 µm). As seções foram então desparafinadas com xileno convencional, desidratadas com concentração gradiente de álcool e lavadas com PBS. A coloração HE foi realizada por 5 min, seguida de desidratação usando álcool gradiente convencional. As seções então passaram por processo de diafanização usando xileno 2 vezes por 5 min cada. Finalmente, as seções foram seladas com goma neutra. Um microscópio óptico foi usado para visualizar as alterações patológicas no tecido do cólon.
Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Tecidos frescos do cólon foram cortados no tamanho de 1 mm³ após a coleta. Os tecidos foram então imediatamente colocados em um tubo de centrífuga preenchido com solução fixadora de microscopia eletrônica de glutaraldeído a 2,5% e armazenados a 4 °C para preservação. Subsequentemente, por 2h, os tecidos foram fixados em ácido ósmico a 1% à temperatura ambiente. A desidratação foi realizada à temperatura ambiente, seguida por permeação e polimerização. Cortes ultrafinos foram preparados e corados adequadamente. As alterações ultraestruturais dentro do tecido do cólon foram estudadas através de um microscópio eletrônico de transmissão. Imagens foram capturadas e subsequentemente analisadas.
Imunofluorescência
Seções parafinizadas do cólon foram desparafinadas por reidratação, o antígeno foi recuperado usando forno de micro-ondas, selado com albumina de soro bovino (BSA) a 3% por 30 min, seguido por gotas de anticorpo primário CB1R (1:500, Proteintech, Wuhan, China), incubado durante a noite a 4 °C, seguido por gotas de 100 μl de anticorpo fluorescente marcado anti-IgG de coelho, incubado por 50 min à temperatura ambiente, nucleado com solução de trabalho de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a 37 °C por 10 min, e então selado. Sob um microscópio confocal a laser, o sinal positivo foi fluorescência vermelha e o azul foi o sinal de coloração nuclear. A intensidade média de fluorescência da expressão positiva foi calculada.
Amplificação e sequenciamento do gene 16S rRNA
Ao final do estudo (semana 6), amostras fecais foram coletadas. Cada grupo contém seis camundongos. O DNA das amostras fecais foi extraído e a amplificação por PCR foi realizada usando primers ligados à região altamente variável V3-V4 do 16S rRNA. Os fragmentos de DNA da comunidade foram pareados com sequenciamento paired-end usando uma plataforma Illumina (Illumina, San Diego, CA, EUA). Os dados brutos de sequenciamento foram processados e analisados na plataforma de análise QIIME2 (Sun et al.).
Análise de SCFAs fecais
As fezes de camundongos foram coletadas e armazenadas a −80 ℃. O teste de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA) inclui ácido acético, ácido butírico, ácido isovalérico, ácido valérico, ácido caproico, ácido propiônico e ácido isobutírico. Um espectrômetro de massa em fase gasosa foi utilizado para a detecção. As condições da cromatografia foram as seguintes: sistema de fase gasosa Thermo Trace 1310 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), coluna capilar Agilent HP-INNOWAX (Agilent, Santa Clara, CA, EUA), injeção split, volume de injeção 1 μL, razão de split 10:1, temperatura do injetor 250 ℃, temperatura da fonte de íons 300 ℃, temperatura da linha de transferência 250 ℃. A temperatura inicial do aquecimento programado é 90 ℃. Em seguida, foi aquecido a 10 ℃/min até 120 ℃, depois a 5 ℃/min até 150 ℃ e, por último, a 25 ℃/min até 250 ℃ por 2 min. O gás de arraste foi hélio e a vazão do gás de arraste foi de 1,0 mL/min. As condições do espectrômetro de massa foram as seguintes: espectrômetro de massa Thermo ISQ LT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), fonte de ionização por bombardeamento de elétrons (EI), modo de varredura de monitoramento de íons selecionados (SIM), energia de elétrons 70 eV.
Western blotting
A proteína do tecido do cólon foi isolada e o ensaio do ácido bicinconínico (BCA) foi realizado para determinar a concentração da proteína. As amostras de proteína foram desnaturadas em banho-maria a 100 ℃ por 10 min antes da eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). A membrana foi transferida para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por transferência elétrica, bloqueada com leite desnatado, seguida de incubação overnight com os anticorpos primários mencionados a 4 °C: anticorpo de coelho anti-ZO-1 (1:2000, Servicebio, Wuhan, China), anticorpo de coelho anti-Ocludina (1:3000, Servicebio, Wuhan, China) e anticorpo de coelho anti-receptor CB1 (1:3000, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA). Em seguida, as membranas foram lavadas com 0,05% de Tween-20 (TBST) três vezes (5 min cada). As membranas foram então incubadas com anticorpos secundários à temperatura ambiente (Proteintech, Wuhan, China) por 2 h, seguidas de lavagens com TBST três vezes (5 min cada). A revelação foi realizada usando um luminizador químico melhorado (Millipore, Boston, MA, EUA) e o sinal foi visualizado em um sistema de imageamento de gel abrangente (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). β-Actina foi usada como proteína de referência interna.
Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)
A lista de sequências de primers
Gene Forward Reverse
GAPDH GGTTGTCTCCTGCGACTTCA TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC
CB1R TCGACAGGTACATATCCATTCACA GAGAGGCAACACAGCGATTACTATT
ZO-1 GGAAACCCGAAACTGATGCTATGG AACTGGCTGGCTGTACTGTGAG
Occludin TCTCAGCCGGCATACTCTTT ATAGGCTCTGTCCCAAGCAA
IL-1β AGCTTCCTTGTGCAAGTGTCTG GACCACTCTCCAGTACCCACT
TNF-α CAGGCGGTGCCTATGTCTC CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG
IL-10 CCTCTGGATACAGCTGCGAC TAGACACCTTTGTCTTGGAGCTA
O RNA total foi isolado do tecido cólon congelado pelo método TRIzol e transcrito reversamente em cDNA (Kidd et al.). Usando o gene GAPDH como controle endógeno, o 2-ΔΔCt foi utilizado para calcular o nível de expressão relativa do gene alvo após a reação. Todos os primers utilizados estão listados na Tabela 1.
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Amostras de sangue total de camundongos foram obtidas e centrifugadas por 2 h a 3000 rpm em uma centrífuga de baixa temperatura a 4 °C por 15 min. O soro (sobrenadante) foi coletado para medir a concentração de LPS de acordo com as instruções do kit (Jingmei, Yancheng, China).
Análise estatística
O programa de análise de dados utilizado foi o SPSS 26.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA), e o GraphPad Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) foi usado para plotagem. ANOVA de um fator foi usada para amostras com distribuição normal, o teste LSD foi empregado para comparação quando a variância dentro dos grupos era homogênea, e quando a variância era desigual, o teste de Dunnett T3 foi utilizado. Amostras que não satisfizeram a distribuição normal foram comparadas entre grupos usando testes não paramétricos de Kruskal-Wallis. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
CIH promove superexpressão do receptor CB1 no tecido do cólon
CIH promove superexpressão do receptor CB1 no tecido do cólon. a-b A expressão do receptor CB1 nos tecidos do cólon foi detectada por imunofluorescência. c RT-PCR foi usado para detectar o nível de expressão de mRNA do receptor CB1 nos tecidos do cólon. d-e O nível de expressão da proteína do receptor CB1 nos tecidos do cólon foi detectado por western blot. *P < 0,05, **P < 0,01,***P < 0,001, comparado com o grupo Controle; #P < 0,05, ##P < 0,01,###P < 0,001, comparado com o grupo CIH
Na Fig. 1, examinamos os níveis de expressão do receptor CB1 no tecido do cólon. A imunofluorescência e o western blot mostraram que a exposição ao CIH promoveu a alta expressão do receptor CB1, e o tratamento com AM251 diminuiu significativamente o nível do receptor CB1. Da mesma forma, o RT-PCR revelou que os níveis de expressão do receptor CB1 no grupo CIH eram mais altos. Após o tratamento com AM251, o nível de mRNA do receptor CB1 foi consideravelmente reduzido.
Inibição do receptor CB1 atenua a lesão patológica do tecido do cólon em camundongos expostos ao CIH
A inibição do receptor CB1 mitigou o dano patológico do cólon induzido pelo CIH. Imagem representativa da coloração HE (100 µm) e microscopia eletrônica de transmissão (20 µm) do tecido do cólon. MET, microscopia eletrônica de transmissão
Conforme mostrado na Fig. 2, a coloração HE e a MET foram utilizadas para examinar as alterações morfológicas patológicas do tecido do cólon em camundongos. Os resultados da coloração HE revelaram que a distância entre a glândula mucosa do intestino médio e o miométrio mucoso aumentou e o grupo CIH foi altamente infiltrado por células inflamatórias em comparação com o grupo Controle. Em contraste, o grau de dano no tecido do cólon e infiltração de células inflamatórias foi substancialmente reduzido no grupo AM251 em comparação com o grupo CIH. A MET revelou que, em oposição ao grupo Controle, as mitocôndrias no grupo CIH apresentaram inchaço grave, volume aumentado, dissolução da matriz da membrana, forma encurtada e enrolada, estrutura de crista reduzida e vacuolização parcial. Além disso, houve uma leve expansão do retículo endoplasmático rugoso, encurtamento das junções estreitas, borramento nas regiões densas, algumas junções intermediárias pouco claras e redução dos filamentos proteicos nas regiões densas dos desmossomos. No entanto, observamos que o inchaço mitocondrial foi reduzido, as microvilosidades foram eliminadas em uma pequena extensão, e houve junções intercelulares estreitas e junções intermediárias após a inibição do receptor CB1 por AM251. De acordo com esses achados, a inibição do receptor CB1 pode aliviar a lesão patológica do tecido colônico em camundongos expostos à CIH.
A inibição do receptor CB1 melhora a desregulação da flora intestinal em camundongos expostos à CIH
Efeito da inibição do receptor CB1 no microbioma intestinal de camundongos OSA. a Diagrama de Venn de OTUs; b-c Chao1 e Observed_species indicam a riqueza da comunidade; d-e Shannon e Simpson indicam a diversidade da comunidade; e f Pielou_e indica a uniformidade da comunidade. g Análise de componentes principais (PCoA) baseada na distância weighted_unifrac. h 3D. *P < 0,05, **P < 0,01
Para investigar a consequência da inibição do receptor CB1 na flora intestinal de camundongos expostos à HIC, coletamos fezes de camundongos e analisamos a composição e função da flora intestinal dos camundongos usando a tecnologia de sequenciamento da região V3-V4 do gene 16S rRNA. Um total de 1.010.596 sequências válidas foram obtidas nesta amostra para a construção de unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A análise de agrupamento de OTUs mostrou que 8.145 OTUs estavam no grupo controle, 5.479 OTUs eram do grupo HIC, 8.247 OTUs eram do grupo AM251 e 1.434 OTUs sobrepostas estavam em todos os três grupos (Fig. 3a). A análise de diversidade de espécies foi usada para estudar as mudanças na estrutura da flora intestinal entre todos os grupos. Os resultados da análise de diversidade alfa mostraram que, nos índices Chao1 e Observed_species observados, o grupo HIC é comparável ao grupo Controle; no entanto, os índices Simpson, Shannon e Pielou_e foram consideravelmente diminuídos no grupo HIC em comparação ao grupo Controle (Fig. 3b–f). O tratamento com AM251 pode aumentar significativamente o índice de diversidade alfa, incluindo os índices Chao1, Observed_species, Simpson, Shannon e Pielou_e. Estes indicam que a exposição à HIC reduziu grupos bacterianos específicos, enquanto o tratamento com AM251 aumentou grupos bacterianos específicos. Em seguida, estudamos a similaridade das comunidades microbianas através de PCoA e análise de coordenadas principais em 3D. A distância weighted_unifrac para análise de diversidade beta mostrou que as amostras do grupo Controle foram significativamente agrupadas com as do grupo AM251 e completamente separadas das amostras do grupo HIC; isso sugere que a composição da microbiota intestinal é marcadamente diferente nestes três grupos (Fig. 3g, h).

A inibição do receptor CB1 altera a composição do microbioma intestinal induzida pela HIC. a Composição microbiana intestinal dos 10 principais filos. b A composição microbiana intestinal das 10 principais famílias. c Composição microbiana intestinal dos 10 principais níveis de espécie. Análise de diferença da flora nos níveis d–f de filo, g–j de família e k–m de espécie. *P < 0,05, **P < 0,01, em comparação ao grupo Controle; #P < 0,05, ##P < 0,01, em comparação ao grupo HIC.
Avaliamos ainda as diferenças nos microbiomas entre os diferentes grupos. As abundâncias relativas dos níveis dos 10 principais filos, famílias e espécies também mudaram significativamente após a exposição à HIC (Fig. 4a–c). Notavelmente, no nível de filo bacteriano, em oposição ao grupo Controle, o número de Firmicutes no grupo HIC foi significativamente elevado, enquanto o número de Bacteroidetes foi significativamente reduzido, com uma maior razão Firmicutes/Bacteroidetes (F/B). A inibição do receptor CB1 pelo seu antagonista AM251 diminuiu significativamente a quantidade de Firmicutes, elevou a quantidade de Bacteroidetes e diminuiu a razão F/B, indicando uma melhora na composição da flora intestinal (Fig. 4d–f). No nível de família, em comparação com o grupo Controle, os números de S24-7, Lachnospiraceae e Ruminococcaceae em camundongos expostos à HIC foram reduzidos, enquanto a abundância de Lactobacillaceae foi elevada. A administração de AM251 elevou significativamente a quantidade de S24-7 e das bactérias produtoras de SCFA Lachnospiraceae e Ruminococcaceae (Fig. 4g–j). No nível de espécie, em comparação com o grupo Controle, o número de Lactobacillus_vaginalis e Akkermansia_muciniphila aumentou no grupo HIC, e o número de Parabacteroides_distasonis diminuiu significativamente. Em comparação com o grupo HIC, o tratamento com AM251 diminuiu substancialmente a quantidade de Lactobacillus_vaginalis (Fig. 4k–m).
a Diagrama de ramificação LEFse. b Análise do histograma LEFse de espécies marcadoras com diferenças significativas entre grupos (LDA>2). c Análise de floresta aleatória: O mapa de calor mostra a distribuição de abundância dessas espécies em cada grupo. De cima para baixo, a importância das espécies para o modelo diminui em ordem.
Posteriormente, a análise LEfse foi utilizada para identificar espécies marcadoras com diferenças significativas entre os grupos. As OTUs que mudaram significativamente no grupo Controle incluíram f_Lachnospiraceae, f_Rikenellaceae e s_Parabacteroides_distasonis, enquanto as OTUs que mudaram significativamente no grupo HIC incluíram c_Bacilli, o_Lactobacillales, f_Lactobacillaceae, g_Lactobacillus, s_Lactobacillus_vaginalis e g_Pediococcus, respectivamente. As OTUs que mudaram significativamente no grupo AM251 foram p_Bacteroidetes, c_Bacteroidia, o_Bacteroidales, c_Clostridia, o_Clostridiales, f_Ruminococcaceae, g_Oscillospira e g_Coprococcus (Fig. 5a, b). Enquanto isso, empregamos a análise de floresta aleatória para descrever as diferenças de espécies entre os grupos. A significância das espécies para o modelo classificador é exibida no gráfico de barras, e o mapa de calor mostra a distribuição de abundância dessas espécies em cada amostra. Pode-se considerar que as espécies mais importantes entre essas são marcadores de diferenças entre os grupos. Pudemos observar uma prevalência significativamente maior de Parabacteroides_distasonis no grupo Controle e no grupo AM251 em comparação com o grupo HIC (Fig. 5c).
Papel do receptor CB1 nas vias metabólicas
Análise de correlação da microbiota intestinal e vias metabólicas. a Abundância relativa das vias metabólicas. b Top 10 componentes das vias metabólicas KEGG com diferenças significativas entre todos os grupos

Utilizamos a via funcional KEGG gerada pelo Picrust2 para prever funções potenciais associadas a alterações na flora intestinal. Os resultados mostram que a flora intestinal está principalmente enriquecida em processos celulares, processamento de informações ambientais, processamento de informações genéticas, doenças humanas, metabolismo e funções de sistemas organismais (Fig. 6a). Em seguida, para avaliar a influência do AM251 na função da flora intestinal, analisamos ainda mais as 10 principais vias metabólicas significativamente diferentes. A Figura 6b demonstra que o grupo AM251 foi significativamente enriquecido na via da pentose fosfato, ciclo de Calvin-Benson-Bassham, fermentação de piruvato para isobutanol, biossíntese II de L-isoleucina, degradação V de amido, biossíntese I de L-isoleucina e biossíntese de L-valina em comparação ao grupo CIH.

Efeito da inibição do receptor CB1 nos SCFAs fecais

A inibição do receptor CB1 pode melhorar os distúrbios metabólicos de SCFAs induzidos por CIH. a Análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA). b Gráfico de escores do modelo OPLS-DA. c–j Concentrações de SCFAs em cada grupo. c SCFAs totais. d Ácido acético. e Ácido butírico. f Ácido isovalérico. g Ácido valérico. h Ácido caproico. i Ácido propiônico. j Ácido isobutírico. *P < 0,05, **P < 0,01, comparado ao grupo Controle; #P < 0,05, ##P < 0,01, comparado ao grupo CIH

Para investigar o efeito da inibição do receptor CB1 no conteúdo de SCFAs fecais em camundongos expostos a CIH, utilizamos análise estatística multivariada para investigar o grau de agregação e dispersão entre as amostras (Fig. 7a, b). A análise de SCFAs mostrou que o grupo CIH apresentou níveis substancialmente diminuídos de SCFAs totais, ácido butírico, ácido propiônico, ácido isovalérico e ácido isobutírico em comparação ao grupo Controle. Os conteúdos de ácido acético e ácido valérico também foram diminuídos (Fig. 7c–j). Por outro lado, após o tratamento com AM251, o conteúdo de ácido butírico foi significativamente aumentado (Fig. 7e).

A inibição do receptor CB1 promove a expressão de proteínas de junção estreita e reduz a endotoxemia

A inibição do receptor CB1 promove a produção de proteínas de junção estreita intestinal sob condições de CIH e reduz a inflamação intestinal e a endotoxemia metabólica. a–c Western blot para detectar a expressão de ZO-1 e Ocludina no cólon. d, e RT-PCR para detectar a expressão de mRNA de ZO-1 e Ocludina no cólon. f–h RT-PCR para detectar mRNA de IL-1β (f), TNF-α (g) e IL-10 (h). i Nível de LPS sérico detectado por ELISA (eu, unidades ELISA). *P < 0,05, **P < 0,01, comparado ao grupo Controle; #P < 0,05, ##P < 0,01, comparado ao grupo CIH
Para investigar se a inibição do receptor CB1 contribuiu para a função de barreira intestinal comprometida e a resposta inflamatória em camundongos expostos à CIH, examinamos as expressões proteicas e gênicas da proteína de junção estreita e das citocinas inflamatórias em tecidos do cólon por western blot e RT-PCR. Observamos que os níveis de expressão das proteínas e mRNA de ZO-1 e Ocludina nos camundongos do grupo CIH foram consideravelmente reduzidos em comparação com o grupo Controle, enquanto os níveis de ZO-1 e Ocludina tratados com AM251 foram significativamente aumentados (Fig. 8a–e). Além disso, os níveis de mRNA dos fatores pró-inflamatórios IL-1β e TNF-α foram significativamente diminuídos, e o fator anti-inflamatório IL-10 foi significativamente aumentado no grupo AM251 em oposição ao grupo CIH (Fig. 8f–h). Esses achados sugerem que os receptores CB1 estão envolvidos na degradação da barreira intestinal e na inflamação do cólon causadas pela CIH. Em conjunto, esses dados sugerem que a exposição à CIH causa disfunção da barreira do cólon e agrava as respostas inflamatórias do cólon em camundongos, e que inibir os receptores CB1 é crítico para manter a integridade da barreira intestinal e suprimir a inflamação do cólon.
A endotoxemia metabólica é geralmente causada pelo desequilíbrio da flora intestinal, e as endotoxinas também participam significativamente do dano a múltiplos órgãos causado pela OSA. Portanto, para avaliar o efeito da inibição do receptor CB1 na endotoxemia metabólica em camundongos expostos à CIH, os níveis séricos de LPS foram avaliados. Os dados demonstraram que o nível sérico de LPS dos camundongos no grupo CIH foi substancialmente maior do que o do grupo Controle, e a intervenção com AM251 pôde reduzir significativamente o nível de LPS dos camundongos CIH (Fig. 8i).
Relação entre a flora intestinal e os índices fisiológicos
A relação entre a flora intestinal e os índices fisiológicos. a Análise de mapa de calor mostrou a correlação entre a flora intestinal e os índices fisiológicos. b A relação entre SCFA e citocinas. A profundidade da cor indica a força da correlação: vermelho indica uma correlação positiva, azul indica uma correlação negativa e branco indica nenhuma correlação. *P < 0,05, **P < 0,01
Para examinar a relação entre índices fisiológicos e flora intestinal, foi realizada análise de correlação de Spearman com base nos parâmetros experimentais. Os resultados revelaram que Bacteroidetes e Lachnospiraceae foram positivamente correlacionados com ácido butírico, enquanto Firmicutes foi negativamente correlacionado com ele. Além disso, Bacteroidetes, Lachnospiraceae e Parabacteroides_distasonis foram encontrados negativamente correlacionados com a proteína CB1 do cólon. Os resultados indicaram que, em relação às proteínas de junção estreita intestinal, Verrucomicrobia, Lachnospiraceae e Akkermansia_muciniphila foram positivamente correlacionados com ZO-1, e Lachnospiraceae e Parabacteroides_distasonis foram positivamente correlacionados com Ocludina. Da mesma forma, Bacteroidetes, S24-7 e Parabacteroides_distasonis foram negativamente correlacionados com LPS sérico, mas positivamente correlacionados com Firmicutes (Fig. 9a).
Em seguida, examinamos a conexão entre SCFA e citocinas em mais detalhes. Foi descoberto que ácido acético, ácido butírico, ácido propiônico, ácido isobutírico e SCFAs foram altamente negativamente correlacionados com CB1, mas tiveram uma correlação positiva significativa com ZO-1 e Ocludina. Os níveis séricos de LPS e TNF-α foram negativamente correlacionados com ácido acético, ácido isovalérico, ácido propiônico, ácido isobutírico e SCFAs (Fig. 9b).

Discussão
Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a esclarecer como a CIH, uma das características fisiopatológicas proeminentes da OSA, induz a destruição da integridade da barreira intestinal através da expressão anormal do receptor CB1. Neste estudo, utilizando o modelo de CIH, descobrimos que a superexpressão do receptor CB1 do cólon causada pela CIH é um mecanismo fundamental por trás da ruptura da barreira intestinal do cólon induzida pela CIH. Além disso, a administração do antagonista do receptor CB1 reverteu o comprometimento da barreira intestinal do cólon causado pela CIH.
Neste estudo, nossos resultados mostraram que camundongos CIH exibiram barreira mucosa intestinal danificada, incluindo junção estreita desorganizada, mitocôndrias severamente inchadas, microvilosidades desprendidas e células inflamatórias infiltradas, evidenciado pela expressão diminuída de ZO-1 e Ocludina. Além disso, a CIH levou à superexpressão do receptor CB1 no tecido do cólon. Enquanto isso, AM251 melhorou o dano à barreira intestinal causado pela CIH. AM251 é um potente antagonista seletivo do receptor CB1 com maior afinidade de ligação e seletividade (Lan et al.). Ao tratar camundongos expostos à CIH com o antagonista do receptor CB1 AM251, descobrimos que as junções estreitas entre as células da mucosa intestinal foram restauradas; o inchaço mitocondrial intracelular, a infiltração de células inflamatórias e o desprendimento de microvilosidades foram aliviados; e os níveis de expressão de ZO-1 e Ocludina também aumentaram significativamente. Neste estudo, a inibição do receptor CB1 aliviou a lesão do cólon induzida pela CIH, elevando os níveis de expressão das proteínas de junção estreita e reduzindo o inchaço mitocondrial e a infiltração de células inflamatórias no cólon.
A função desregulada da barreira mucosa intestinal pode permitir que inúmeras toxinas atravessem a corrente sanguínea e levem à inflamação crônica devido à barreira intestinal prejudicada. Portanto, o grau de lesão da mucosa intestinal está intimamente relacionado à inflamação (Williams). TNF-α é um fator secretado por macrófagos ativados para iniciar uma resposta inflamatória, que pode promover a proliferação e diferenciação de macrófagos, coordenar a resposta inflamatória do corpo, elevar a expressão dos fatores pró-inflamatórios IL-1β e IL-6, e causar a infiltração de várias células inflamatórias nos tecidos intestinais para promover o desenvolvimento da inflamação intestinal e agravar os danos à barreira intestinal. Foi demonstrado que a inflamação está intimamente associada à maioria das condições relacionadas à OSA, como hipertensão, doença coronariana, obesidade e diabetes (Turnbull et al.; Arnaud et al.; Sanderson et al.; Campos-Rodriguez et al.; Wali et al.). Foi relatado que a inibição do receptor CB1 reduz a inflamação do fígado e do tecido adiposo em camundongos obesos (Wang et al.). A aplicação de AM251 em camundongos diabéticos pode reduzir os níveis de expressão dos fatores inflamatórios TNF-α e IL-6 no fígado (Chen et al.). Em consonância com descobertas anteriores, nossos achados também revelam que a inibição do receptor CB1 reduz os níveis de expressão de IL-1β e TNF-α e aumenta o nível do fator anti-inflamatório IL-10 em camundongos expostos à CIH. Assim, a inibição do receptor CB1 exerce efeitos anti-inflamatórios em camundongos expostos à CIH ao modular mediadores inflamatórios.

Além disso, no processo de exploração da inflamação do cólon causada pela CIH, nosso estudo ainda descobriu que a CIH leva à translocação de LPS do intestino para o sangue, e elucidou ainda que o receptor CB1 pode estar envolvido nesse processo. LPS é uma endotoxina parte da parede celular de bactérias gram-negativas e é o principal meio pelo qual pode causar danos. Desempenha um papel integral na indução de doenças metabólicas relacionadas, sendo assim denominada "endotoxemia metabólica" (Cani et al.). O LPS produzido por bactérias intestinais vaza do intestino para o sistema circulatório sistêmico, onde desencadeia a liberação de outros mediadores inflamatórios, levando ainda mais à inflamação sistêmica (Tucureanu et al.). Nosso estudo descobriu que a exposição à CIH aumentou os níveis séricos de LPS em camundongos, e a inibição do receptor CB1 reduziu significativamente o nível de LPS. Portanto, acreditamos que a inibição do receptor CB1 mitigou a endotoxina metabólica em camundongos expostos à CIH.
É bem conhecido que a flora intestinal é um dos principais componentes da barreira intestinal. A perturbação da flora causará uma série de consequências adversas para o trato intestinal, como aumento de substâncias tóxicas na cavidade intestinal, diminuição dos SCFAs, danos às células epiteliais da mucosa intestinal, bem como degradação da mucina, e ativação anormal de células imunes, o que pode, em última análise, resultar na destruição da função da barreira intestinal. Ao construir um modelo de HIC, este estudo descobriu que o distúrbio da flora intestinal causado pela HIC inclui uma diminuição na diversidade alfa, um aumento na razão F/B e uma diminuição na abundância de bactérias produtoras de SCFAs. As mudanças acima mencionadas na flora foram observadas em pacientes com OSA (Ko et al.; Wang et al.). As bactérias no cólon são compostas principalmente por Bacteroides e Firmicutes (Dominguez-Bello et al.). O aumento na abundância de Firmicutes e a diminuição na abundância de Bacteroidetes levarão a um aumento na razão F/B. Estudos anteriores mostraram que a razão F/B é um marcador de disbiose intestinal e está intimamente relacionada à inflamação imunológica intestinal (Min et al.; Li et al.; Tilahun et al.). Bacteroidetes são considerados a fonte da próxima geração de probióticos e podem melhorar várias doenças intestinais (Ma et al.). Curiosamente, este estudo pode alterar a disbiose intestinal causada pela HIC em certa medida usando o antagonista do receptor CB1 AM251. Inibir o receptor CB1 pode reduzir significativamente a quantidade de Firmicutes e a razão F/B, enquanto aumenta a quantidade de Bacteroidetes. Mais importante ainda, descobrimos que Firmicutes e CB1 do cólon, LPS sérico e fatores inflamatórios apresentavam uma correlação positiva, enquanto era negativamente correlacionada com SCFAs como ácido butírico e ácido propiônico. O filo Bacteroidetes é negativamente correlacionado com CB1 do cólon, LPS sérico e fatores inflamatórios. No nível de família, descobrimos que a inibição do receptor CB1 elevou a quantidade de bactérias produtoras de SCFAs Lachnospiraceae, Ruminococcaceae e Lachnospiraceae e apresentou uma correlação negativa com CB1. No nível de espécie, a inibição do receptor CB1 diminuiu o número de Lactobacillus_vaginalis e Akkermansia_muciniphila e aumentou Parabacteroides_distasonis em camundongos expostos à HIC. Portanto, levantamos a hipótese de que a inibição do receptor CB1 proporciona proteção profunda da microbiota intestinal em camundongos expostos à HIC, prevenindo a disbiose intestinal causada pela HIC.
Um metabólito essencial da flora intestinal, os AGCC modulam a regulação do apetite, o metabolismo da glicose e dos lipídios, a integridade da barreira intestinal, o estresse oxidativo, a inflamação e a homeostase do sistema imunológico (Jiao et al.; Liu et al.). A produção de butirato bacteriano é crítica para a regulação da estabilidade microecológica intestinal, pois essa classe de ácido butírico é considerada a principal fonte de energia nas células epiteliais intestinais (Sonnenburg et al.). Dados anteriores mostraram que o ácido butírico melhora a função da barreira intestinal ao aumentar a expressão de proteínas de junção estreita e reduz a liberação de LPS na corrente sanguínea e a resposta inflamatória intestinal (Peng et al.; Moreno-Indias et al.). Assim, a síntese de AGCC bacterianos é crucial para a regulação da estabilidade microecológica intestinal. Estudos recentes descobriram que os componentes de ácido acético, ácido butírico e ácido propiônico no soro estavam substancialmente reduzidos em pacientes com AOS grave (Zhang et al.). Nossa pesquisa revelou que os componentes de ácido butírico, ácido isovalérico, ácido propiônico e ácido isobutírico estavam consideravelmente diminuídos em camundongos expostos à HIC, enquanto a inibição do receptor CB1 pode aumentar significativamente a concentração de ácido butírico. Além disso, a análise de correlação também revelou uma correlação positiva entre o nível de ácido butírico e Lachnospiraceae, ZO-1 e Ocludina, mas correlacionada negativamente com CB1 do cólon, IL-1β e TNF-α.
Embora este estudo tenha descoberto que o antagonista do receptor CB1 pode melhorar a lesão colônica causada pela HIC e explorado ainda mais os mecanismos potenciais, ainda existem algumas limitações neste estudo. Em primeiro lugar, este estudo carece de evidências diretas do papel do receptor CB1 na melhora do desequilíbrio da flora intestinal e da lesão patológica colônica. Em segundo lugar, a relação entre o receptor CB1 e a lesão do cólon não foi validada em experimentos celulares. Finalmente, a HIC só pode simular as alterações patológicas causadas pela HIC em pacientes com AOS, e não pode simular completamente os processos fisiopatológicos em pacientes com AOS. Enquanto isso, os resultados de experimentos animais não podem ser extrapolados para pacientes com AOS. Portanto, a aplicação do antagonista do receptor CB1 no tratamento de pacientes com AOS e lesão colônica precisa de confirmação adicional em ensaios clínicos multicêntricos.
Em conclusão, os receptores CB1 desempenham um papel crucial na lesão do cólon causada pela HIC. A HIC leva ao aumento da expressão do receptor CB1 nos tecidos do cólon, danos à mucosa colônica, diminuição da expressão de proteínas de junção estreita, perturbação da microbiota intestinal, aumento dos níveis de mediadores inflamatórios no intestino e translocação de LPS. Além disso, a inibição do receptor CB1 é uma forma eficaz de aliviar a lesão do cólon causada pela HIC.
Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Os autores estabeleceram exclusivamente todas as alegações feitas neste artigo; a editora, editores, revisores e quaisquer organizações relacionadas não necessariamente as endossam. A editora não oferece garantias sobre qualquer produto que possa ser revisado neste artigo ou sobre quaisquer alegações feitas pelo fabricante.

Contribuição dos autores
P-P W: análise de dados, revisão de literatura e redação do rascunho. X-QC, Z-JD e Y-Q F: integração de resultados e redação do rascunho. JC, LZ e J-XH: integração de resultados e revisão de literatura. X-WL: seleção de amostras. BW: orientação de desenho experimental.

Financiamento
Os Projetos Especiais de Pesquisa Chave da Comissão de Saúde de Shanxi (2022XM29) e o Projeto de Exploração Livre da Comissão de Saúde de Shanxi (YDZJSX20231A063) forneceram financiamento para este trabalho.

Disponibilidade de dados
Mediante solicitação razoável, o autor correspondente fornecerá os conjuntos de dados criados durante o trabalho atual. Os dados brutos de sequência da microbiota que corroboram as conclusões do nosso estudo foram adicionados ao NCBI SRA com o número de acesso PRJNA1052947.

Declarações
Declaração de ética
O Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Médica de Shanxi examinou e autorizou o estudo animal.

Conflito de interesses
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

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