pmid: "40176466"
title: "Efeitos Sinérgicos do Riluzol e Butirato de Sódio na Função de Barreira e Progressão da Doença da Esclerose Lateral Amiotrófica Através do Eixo Intestino-Neurônio."
authors: "Zhang Y, Robinson K, Xia Y, Sun J"
journal: "Comprehensive Physiology"
pubdate: "2025 Apr"
doi: "10.1002/cph4.70009"
source: "PMC Full Text"

Efeitos Sinérgicos do Riluzol e Butirato de Sódio na Função de Barreira e Progressão da Doença da Esclerose Lateral Amiotrófica Através do Eixo Intestino-Neurônio.

Autores

Zhang Y, Robinson K, Xia Y, Sun J

Periodico

Comprehensive Physiology (2025 Apr)

Conteudo

Efeitos Sinérgicos de Riluzol e Butirato de Sódio na Função de Barreira e na Progressão da Doença da Esclerose Lateral Amiotrófica Através do Eixo Intestino-Neurônio

RESUMO

Evidências emergentes mostraram que a disfunção da barreira intestino-cérebro ocorre nos estágios iniciais da ELA. Estudos anteriores demonstraram que o butirato de sódio prolongou significativamente a expectativa de vida de camundongos com ELA. O Riluzol é o primeiro medicamento aprovado pela FDA para o tratamento da ELA. Nossa hipótese é que o tratamento combinado de Riluzol e butirato de sódio diminui ainda mais a agregação da h-SOD1G93A, restaura a função da barreira intestino-cérebro e retarda a progressão da ELA. Camundongos SOD1G93A (com 9–10 semanas de idade) foram tratados com Riluzol (10 mg/kg, I.P. diariamente), butirato de sódio (2% na água de beber) ou a combinação de Riluzol e butirato de sódio por 6 semanas. A combinação Riluzol/butirato mostrou um tempo significativamente maior no rotarod, aumento da força de preensão e melhora da barreira intestinal, em comparação com o tratamento apenas com Riluzol ou butirato de sódio. Uma maior redução da agregação de h-SOD1G93A foi observada no cólon, medula espinhal lombar e córtex cerebral com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com o tratamento apenas com Riluzol ou butirato de sódio. As proteínas de junção apertada (ZO-1 e Claudina-5) aumentaram significativamente no cólon, medula espinhal lombar e córtex cerebral de camundongos com o tratamento com Riluzol e butirato de sódio. A combinação de Riluzol e butirato de sódio reduziu os lipopolissacarídeos séricos e a agregação de h-SOD1G93A, e as citocinas inflamatórias mais do que aquelas no tratamento apenas com Riluzol ou butirato de sódio. No geral, o tratamento com Riluzol e butirato de sódio é mais eficaz do que apenas Riluzol ou butirato de sódio isoladamente em retardar a progressão da ELA. Isso fornece uma potencial estratégia terapêutica e mecanismo ao restaurar a função de barreira através do eixo intestino-cérebro para a ELA.

A disfunção da barreira intestino-cérebro ocorre na esclerose lateral amiotrófica (ELA) juntamente com outros sintomas, como fraqueza muscular, espasmos musculares e dificuldade na fala. O tratamento combinado com Riluzol aprovado pela FDA e butirato de sódio é mais eficiente do que apenas Riluzol ou butirato de sódio isoladamente em retardar a progressão da ELA, provavelmente através do eixo intestino-neurônio.

Introdução
A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neuromuscular fatal caracterizada por morte progressiva dos neurônios motores e atrofia e paralisia da musculatura esquelética (Duranti and Villa ; Hardiman et al. ). O risco de ELA ao longo da vida é de cerca de 1 em 472 em mulheres e 1 em 350 em homens (Alonso et al. ). Por ser uma doença dependente da idade, um aumento na prevalência da ELA pode ser esperado à medida que a população dos EUA aumenta e envelhece. Veteranos militares, independentemente do ramo de serviço, da época em que serviram ou se serviram em tempo de paz ou guerra, apresentam maior risco de morrer de ELA do que aqueles que não serviram nas forças armadas (Beard et al. ). Muitos casos de ELA familiar (20%–25% dos casos de ELA familiar) estão associados a mutações no gene da superóxido dismutase Cu/Zn (SOD1). O gene SOD1 protege as células de moléculas de oxigênio. No entanto, quando o SOD1 está mutado, as moléculas de oxigênio têm acesso às células, o que induz o glutamato, levando assim a lesões neuronais. A maioria dos pacientes com ELA morre em até 5 anos após o início da doença. Apesar dos intensos esforços de pesquisa, não há cura eficaz para a ELA. Os tratamentos disponíveis (Riluzol e Edaravona) são para aliviar os sintomas e melhorar a qualidade de vida dos pacientes com ELA. O Qalsody foi aprovado mais recentemente pela Food and Drug Administration dos EUA e tem como alvo o mRNA do SOD1 para prevenir a produção da proteína SOD1. Ainda há necessidades significativas de desenvolver novos tratamentos para a ELA e melhorar a qualidade de vida dos pacientes com ELA (Sun and Zhang ).
O Riluzol foi o primeiro tratamento aprovado pela FDA para ELA e especula-se que reduz a neurotransmissão glutamatérgica ao bloquear canais de sódio dependentes de voltagem em neurônios pré-sinápticos. O Riluzol prolonga a vida do paciente por alguns meses (Joyce et al. ). O aumento de citocinas inflamatórias séricas (Zhang et al. ), lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) (Zhang et al. ) e microbioma aberrante foram relatados em estudos anteriores de ELA humana (Fang et al. ). Nosso estudo com administração oral de butirato de sódio apresenta uma estratégia terapêutica promissora (Sun e Zhang ; Zhang et al. ). Camundongos tratados com butirato mostraram uma latência significativamente maior para cair no teste de rotarod, em comparação com os camundongos G93A não tratados. LPS bacterianos, glicolipídios encontrados na membrana externa de bactérias gram-negativas, são pró-inflamatórios e foram encontrados aumentados no soro de pacientes com ELA (Zhang et al. ). De fato, o aumento das citocinas inflamatórias IL-17 e IL-23 foi relatado no soro e no líquido cefalorraquidiano de pacientes com ELA (Rentzos et al. ). Demonstramos aumento de IL-17 sérica em camundongos SOD1G93A com ELA, em comparação com camundongos selvagens (Wu et al. ). Nosso estudo mostrou que a disbiose estava correlacionada com inflamação intestinal e aumento da permeabilidade intestinal na ELA (Wu et al. ; Figueroa-Romero et al. ). No entanto, o impacto e o mecanismo do Riluzol no intestino de pacientes com ELA são desconhecidos. O papel combinado e o mecanismo do Riluzol e do butirato de sódio também são desconhecidos.
No presente estudo, utilizamos butirato de sódio a 2% na água de beber combinado com Riluzol em camundongos SOD1G93A. Os resultados focaram na progressão clínica da doença, por exemplo, peso corporal, rotarod, início e neuroproteção (redução da perda de neurônios motores e inibição da ativação glial, e sobrevivência). Além disso, examinamos as mudanças na agregação da SOD1G93A mutante humana (h-SOD1G93A), junções apertadas (TJs) para função de barreira e inflamação. Uma melhor compreensão dos mecanismos dos medicamentos existentes e dos efeitos sinérgicos do Riluzol e do butirato de sódio fornecerá insights sobre a função de barreira e a progressão da ELA.
Materiais e Métodos
SOD1G93A strain (B6SJL‐Tg (SOD1‐G93A) 1Gur/J, estoque No. 002726) (Zhang et al.; Ogbu et al.; Sun) foi adquirida do Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, EUA). Todos os camundongos foram mantidos em ambientes livres de patógenos específicos, sob condições controladas de ciclo claro/escuro de 12 h luz/12 h escuro a 20°C–22°C e umidade de 45% ± 5%, com livre acesso ao mesmo alimento e água autoclavada. Todos os materiais envolvidos, incluindo gaiola, maravalha, garrafas de água e suporte de identificação da gaiola, foram autoclavados antes de alojar os camundongos. Os camundongos são alojados do mesmo sexo, e cada gaiola não possui mais de 5 camundongos. Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo IACUC do Comitê de Recursos Animais da Universidade de Illinois Chicago (ACC 21‐178 e ACC 23‐149). O estudo é relatado de acordo com as diretrizes ARRIVE.
Teste do Rotarod
A coordenação motora, resistência e equilíbrio foram determinados pela latência no teste do rotarod. Os camundongos foram treinados no teste do rotarod 3 dias antes das tentativas de desempenho, em velocidade crescente de 4 a 40 rpm por 300 s, utilizando o Modelo Rotarod LE8205 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA). A latência para queda foi registrada quando o camundongo caía da barra (Zhang et al.; Gilli et al.). Cada camundongo foi testado em 2 tentativas por dia durante 2 dias consecutivos. As médias dos tempos das 4 tentativas dos testes foram calculadas para cada camundongo.
Avaliação da Força de Preensão
Medidas de preensão dos membros anteriores e posteriores foram adquiridas em triplicata com um medidor de força de preensão de 25 N (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA). Os camundongos foram abaixados sobre uma barra triangular do medidor de força de preensão até que os animais segurassem a barra com os membros anteriores ou posteriores; em seguida, os camundongos foram puxados suavemente para trás até soltarem a barra. O dinamômetro do medidor de preensão registrou a força máxima (Zhang et al.; Huerta Ojeda et al.).
Tratamento com Riluzol e Butirato em Camundongos SOD1G93A
Camundongos SOD1G93A (machos e fêmeas) com 9–10 semanas de idade foram aleatoriamente designados para 4 grupos. O grupo controle não recebeu tratamento. O tratamento com butirato de sódio a 2% em água potável filtrada e a dose de Riluzol (10 mg/kg, intraperitoneal) foram baseados em estudos anteriores (Verhave et al. ; Kitzman ; Milane et al. ), incluindo os nossos (Zhang et al. ). O tratamento com butirato de sódio a 2% em água potável filtrada levou à restauração da homeostase microbiana intestinal, redução da agregação de SOD1G93A humana, melhora da função do ENS e muscular no intestino e neurônios, e prolongamento da vida útil dos camundongos SOD1G93A (Zhang et al. ). A dose de Riluzol (10 mg/kg, intraperitoneal) foi benéfica em doenças neurodegenerativas (Verhave et al. ; Kitzman ; Milane et al. ). O grupo tratado com Riluzol recebeu intraperitonealmente Riluzol (Sigma-Aldrich, 1604337, St. Louis, MO, EUA) na dose de 10 mg/kg de peso corporal diariamente. O grupo tratado com butirato de sódio recebeu butirato de sódio a 2% (Sigma-Aldrich, 303410, St. Louis, MO, EUA) em água potável filtrada. O grupo tratado com a combinação Riluzol/butirato de sódio recebeu Riluzol e butirato de sódio. Os tratamentos com Riluzol e butirato de sódio começaram com 9–10 semanas e terminaram com 15–16 semanas. Todos os animais foram pesados e submetidos a um exame clínico detalhado, que incluiu avaliações de aparência, movimento e padrões comportamentais, condições da pele e pelos, olhos e membranas mucosas, respiração e excreções. A extensão restrita das patas traseiras observada ao segurar a cauda foi considerada um sintoma de ELA; camundongos que não conseguiam virar em 20 segundos após serem colocados de costas foram eutanasiados de forma humanitária por inalação de CO2 seguida de deslocamento cervical.
Análise de Western Blot e Anticorpos
As células epiteliais do cólon de camundongos foram coletadas por raspagem do tecido do cólon do animal, incluindo as regiões proximal e distal. A medula espinhal (região lombar) e o córtex cerebral dos camundongos foram extraídos e picados em pedaços minúsculos com tesoura (Shen et al. ; Lin et al. ). Os tecidos coletados foram sonicados em tampão de lise (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 1% Triton X-100) com 0,2 mM de ortovanadato de sódio e coquetel inibidor de protease. A concentração de proteínas foi medida utilizando o Reagente BioRad (BioRad, Hercules, CA, EUA) e, em seguida, sonicada. Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, transferidas para nitrocelulose e imunobloteadas com anticorpos primários. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-SOD1 humano (Abcam, ab52950, Cambridge, MA, EUA), anti-ZO-1 (Invitrogen, 33-9100, Carlsbad, CA, EUA), anti-Claudina-5 (Invitrogen, 35-2500, Carlsbad, CA, EUA), anti-Claudina-1 (Invitrogen, 71-7800, Carlsbad, CA, EUA), anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, 5174, Danvers, MA, EUA) ou anti-β-actina (Sigma-Aldrich, A5316, St. Louis, MO, EUA), e foram visualizados por ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). As membranas sondadas com mais de um anticorpo foram removidas antes de uma nova sondagem. O software Quantity One foi utilizado para a quantificação das bandas do western blot. Resumidamente, a "ferramenta retangular" foi selecionada primeiro para medir o fundo e as bandas dos western blots uma a uma. Todos os valores de "densidade" e "volume" após a medição foram transferidos para um arquivo Excel. Com a subtração da medição de fundo, os valores de "densidade" para cada banda no western blot foram calculados.
Os tecidos do cólon, medula espinhal e cérebro foram isolados recentemente e embebidos em parafina após fixação com formalina tamponada neutra a 10%. A imunofluorescência foi realizada em seções embebidas em parafina (5 μm). Após o preparo das lâminas conforme descrito anteriormente (Zhang et al.; Zhang, Zhang, et al.), as amostras de tecido foram incubadas com anti-SOD1 humano (Abcam, ab52950, Cambridge, MA, EUA), anti-ZO-1 (Invitrogen, 33-9100, Carlsbad, CA, EUA) e anti-Claudina-5 (Invitrogen, 35-2500, Carlsbad, CA, EUA) a 4°C durante a noite. As amostras foram então incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A-11008, Carlsbad, CA, EUA), anticorpo secundário de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A-11001, Carlsbad, CA, EUA) ou anticorpo secundário de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 594 (Invitrogen, A-11032, Carlsbad, CA, EUA) e DAPI (Invitrogen, D1306, Carlsbad, CA, EUA) por 1 h à temperatura ambiente. Os tecidos foram montados com SlowFade (Invitrogen, s2828, Carlsbad, CA, EUA), seguido por uma lamínula, e as bordas foram seladas para evitar ressecamento. Os espécimes foram examinados com um microscópio confocal a laser Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Alemanha). A agregação da proteína h-SOD1G93A foi quantificada com o software AggreCount (https://aggrecount.github.io/). A intensidade de fluorescência foi determinada usando o software Image J. Este método determina a fluorescência total corrigida subtraindo o sinal de fundo, o que é útil para comparar a intensidade de fluorescência entre células ou regiões.
Permeabilidade Intestinal
Dextrana marcada com isotiocianato de fluoresceína (peso molecular médio 4000, Sigma, 46944, Burbank, CA, EUA, diluída em HBSS) foi administrada por gavagem (25 mg/kg de camundongo) 4 h antes da coleta das amostras. Os camundongos foram anestesiados com avertina; a profundidade da anestesia foi avaliada por compressão da pata, e então o sangue foi coletado por punção cardíaca seguida de deslocamento cervical. Amostras de sangue de camundongos foram coletadas para o teste de permeabilidade intestinal (Zhang et al.; Zhang, Xia, et al.).
Detecção de Lipopolissacarídeos (LPS) Séricos
O LPS em amostras de soro foi medido com ensaios cromogênicos de ponto final do lisado de amebócitos do limulus (Hycult Biotech, HIT302, Plymouth, PA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram diluídas 1:4 com água livre de endotoxina e então aquecidas a 75°C por 5 min em uma placa quente para desnaturar a proteína antes da reação. Uma curva padrão foi gerada e usada para calcular as concentrações, que foram expressas em EU/mL nas amostras de soro.
Ensaio Multiplex de ELISA
Amostras de sangue de camundongos foram coletadas por punção cardíaca e colocadas em tubos contendo EDTA (10 mg/mL). As citocinas dos camundongos foram medidas utilizando o Painel 1 de 26 Plex de Citocinas e Quimiocinas Conveniência ProcartaPlex para Camundongos (Invitrogen, EPXR260-26088-901, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, beads de propriedades espectrais definidas foram conjugadas a anticorpos de captura específicos para proteínas e adicionadas junto com as amostras (incluindo padrões de concentração proteica conhecida, amostras controle e amostras teste) nos poços de uma microplaca de fundo filtrante, onde as proteínas se ligaram aos anticorpos de captura durante uma incubação de 2 h. Após a lavagem das beads, anticorpos detectores biotinilados específicos para proteínas foram adicionados e incubados com as beads por 1 h. Após a remoção do excesso de anticorpos detectores biotinilados, a proteína fluorescente R-ficoeritrina conjugada com estreptavidina foi adicionada e incubada por 30 min. Após lavagem para remover a estreptavidina–R-ficoeritrina não ligada, as beads foram analisadas com o sistema de detecção Luminex (Bio-Rad, Bio-Plex 200 Systems, Hercules, CA, EUA).

Análise Estatística

Todos os dados foram expressos como média ± EPM ou ± DP. Todos os testes estatísticos foram bilaterais. Todos os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As diferenças entre amostras para mais de dois grupos foram analisadas usando ANOVA de uma via ou ANOVA de duas vias conforme apropriado, com base na distribuição dos dados e no número de fatores, respectivamente. Os valores de p nas análises de ANOVA foram ajustados para correção de comparações múltiplas usando o método de Tukey para garantir resultados precisos. As análises estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, EUA).

Resultados

A Combinação de Riluzol e Butirato de Sódio Mostrou uma Proteção Sinergicamente Significativa Contra a Progressão da Doença em Camundongos SOD1G93A
Para examinar os efeitos sinérgicos de Riluzole e butirato de sódio na progressão da doença, estabelecemos 4 grupos experimentais com apenas Riluzole, apenas butirato de sódio, e combinação de Riluzole e butirato de sódio, e controle sem tratamento em camundongos SOD1G93A com 9–10 semanas de idade. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente para cada grupo. O tratamento durou um total de 6 semanas. O grupo tratado com Riluzole recebeu Riluzole via i.p. na dose de 10 mg/kg de peso corporal diariamente. O grupo tratado com butirato de sódio recebeu 2% de butirato de sódio em água potável filtrada (Figura 1A). A data de início da doença é definida como o primeiro dia em que um camundongo falha na tarefa do rotarod a 15 rpm e começa a apresentar tremores musculares nos membros posteriores (Ito et al. ; Xu et al. ). O peso corporal será monitorado diariamente durante o período de tratamento. O peso corporal máximo é um determinante razoável e consistente do início, particularmente em combinação com uma medida de escore neurológico (Ludolph et al. ; Scott et al. ). As alterações no peso corporal são mostradas na Figura 1B. A partir da idade de 13–14 semanas, os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzole, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzole e butirato de sódio mostram leve perda de peso sem significância estatística, em comparação com os camundongos SOD1G93A sem tratamento. A partir da idade de 14–15 semanas, o tratamento com a combinação de Riluzole/butirato de sódio mostrou uma leve perda de peso sem significância estatística, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzole ou apenas com butirato de sódio. Na idade de 15–16 semanas, a combinação de Riluzole e butirato de sódio mostrou significativamente menos perda de peso em comparação com os camundongos SOD1G93A sem tratamento.
A combinação de Riluzol e butirato de sódio mostrou um progresso da doença significativamente retardado em comparação com o tratamento apenas com Riluzol ou apenas butirato de sódio.
(A) Visão esquemática dos camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol, butirato de sódio ou a combinação de Riluzol e butirato de sódio em camundongos SOD1G93A (com 9 a 10 semanas de idade). Riluzol foi administrado por via I.P. na dose de 10 mg/kg de peso corporal diariamente. Butirato de sódio a 2% foi administrado em água potável filtrada. Os tratamentos duraram 6 semanas.
(B) Alterações no peso corporal dos camundongos SOD1G93A. Aos 15–16 semanas de idade, a combinação de Riluzol e butirato de sódio mostrou uma perda de peso significativamente menor, em comparação com os camundongos SOD1G93A sem tratamento. Os dados são expressos como média ± EPM. n = 8–10, teste ANOVA de duas vias.
(C) Os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio tiveram um tempo de rotarod significativamente maior em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Os dados são expressos como média ± DP. n = 8–10, teste ANOVA de duas vias.
(D) A combinação de Riluzol e butirato de sódio levou a um aumento significativo na força de preensão dos membros anteriores e (E) na força de preensão dos membros posteriores, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. A partir dos 12–13 semanas de idade, os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio todos tiveram um aumento significativo na força de preensão dos membros anteriores e na força de preensão dos membros posteriores em comparação com os camundongos controle. Aos 15–16 semanas de idade, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio tiveram um aumento significativo na força de preensão dos membros anteriores e na força de preensão dos membros posteriores, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Os dados são expressos como média ± DP. n = 8–10, teste ANOVA de duas vias. Todos os valores de p são mostrados nas figuras.
Os camundongos SOD1G93A foram testados em um rotarod acelerado (Xu et al. ) para examinar o desempenho da atividade neuromuscular. Os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio tiveram um tempo de rotarod significativamente aumentado, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio (Figura 1C). A partir da idade de 12–13 semanas, os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio todos tiveram um tempo de rotarod significativamente aumentado, em comparação com os camundongos controle sem tratamento. Na idade de 15–16 semanas, o grupo de combinação teve um tempo de rotarod significativamente aumentado, em comparação com os camundongos SOD1G93A com apenas Riluzol ou butirato de sódio. Os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio tiveram uma força de preensão dos membros anteriores (Figura 1D) e dos membros posteriores (Figura 1E) significativamente aumentada, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. A partir da idade de 12–13 semanas, os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio todos tiveram uma força de preensão dos membros anteriores e dos membros posteriores significativamente aumentada, em comparação com os camundongos controle sem tratamento. Na idade de 15–16 semanas, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio tiveram uma força de preensão dos membros anteriores e dos membros posteriores significativamente aumentada, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. A data da morte é definida como o dia em que o camundongo não consegue se virar dentro de 30 s após ser colocado de costas (Xu et al. ). Não realizamos a curva de sobrevivência dos camundongos SOD1G93A com e sem o tratamento na progressão da ELA devido às restrições do protocolo animal. No geral, nossos dados sugeriram que a combinação de Riluzol e butirato de sódio teve um efeito protetor significativo contra a progressão da doença em camundongos SOD1G93A.
O Tratamento Combinado de Riluzol e Butirato de Sódio Preservou a Permeabilidade e Reduziu a Agregação de h-SOD1G93A nos Camundongos SOD1G93A
O aumento da permeabilidade intestinal foi relatado em camundongos SOD1G93A (Zhang et al.; Martin et al.). Em seguida, examinamos se o tratamento retarda a disfunção intestinal durante a progressão da ELA. A permeabilidade intestinal foi reduzida em todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol, butirato de sódio ou a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma permeabilidade intestinal significativamente reduzida, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio (Figura 2A). A permeabilidade intestinal foi regulada pelas junções estreitas (TJs). Em seguida, examinamos a expressão das proteínas das junções estreitas. A ZO-1 e a Claudina-5, detectadas por Western Blot (WB), estavam aumentadas nos intestinos dos camundongos tratados com Riluzol, butirato de sódio ou a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle sem tratamento. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram o aumento mais significativo na expressão de ZO-1 e Claudina-5 no cólon, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio (Figura 2B). As expressões de ZO-1 e Claudina-5 aumentaram no cólon de todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol/butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO-1 e Claudina-5 no cólon, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio, conforme determinado pela coloração por imunofluorescência (IF) (Figura 2C,D). A agregação da proteína mutada h-SOD1 foi testada como um indicador da progressão da ELA. Também observamos uma diminuição na agregação de h-SOD1G93A no cólon dos grupos tratados com Riluzol, butirato de sódio ou a combinação de Riluzol/butirato de sódio, em comparação com camundongos controle sem tratamento. Como esperado, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram a redução mais significativa na agregação de h-SOD1G93A intestinal, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio (Figura 2E).
Diminuição da permeabilidade, redução da agregação de h‐SOD1G93A e aumento da expressão de proteínas de junção apertada no cólon de camundongos SOD1G93A com tratamento combinado de Riluzol/butirato de sódio. (A) A permeabilidade intestinal foi reduzida em todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com os camundongos controle. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma permeabilidade intestinal significativamente reduzida, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Os dados são expressos como média ± DP. n = 6–9, teste ANOVA de uma via. (B) A expressão das proteínas de junção apertada, ZO‑1 e Claudina‑5, aumentou no cólon de todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com os camundongos controle. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO‑1 e Claudina‑5 no cólon, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio, conforme WB. Os dados são expressos como média ± DP. n = 4, teste ANOVA de uma via. (C) As expressões de ZO‑1 e (D) Claudina‑5 aumentaram nos intestinos de todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com os camundongos controle, conforme determinado por coloração IF. A intensidade de fluorescência relativa foi quantificada com o ImageJ contando 3 imagens para cada amostra. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3 por grupo, teste ANOVA de uma via. (E) Redução da agregação de h‑SOD1G93A no cólon de camundongos SOD1G93A com Riluzol, apenas butirato de sódio ou combinação, em comparação com camundongos controle sem tratamento. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma redução significativa da h‑SOD1G93A agregada, em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. A agregação da proteína h‑SOD1G93A foi quantificada com o AggreCount contando 3 imagens para cada amostra. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3 por grupo, teste ANOVA de uma via. Todos os valores de p são mostrados nas figuras.
Na medula espinhal lombar, o tratamento combinado de Riluzol e butirato de sódio reduziu a agregação de h‑SOD1G93A e aumentou a expressão de proteínas TJ em camundongos SOD1G93A.
Examinamos adicionalmente as proteínas TJ na medula espinhal. Conforme mostrado na Figura 3A, a expressão das proteínas TJ, ZO-1 e Claudina-5, aumentou na região lombar da medula espinhal de todos os grupos tratados com Riluzol, butirato de sódio ou a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos SOD1G93A controle. Enquanto isso, a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentou o aumento mais significativo na expressão de ZO-1 e Claudina-5 por WB. A distribuição e densidade de ZO-1 (Figura 3B) e Claudina-5 (Figura 3C) tiveram o maior aumento na região lombar da medula espinhal de camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol e butirato de sódio, conforme determinado por coloração IF. A h-SOD1G93A agregada diminuiu na região lombar da medula espinhal de todos os grupos tratados com Riluzol, butirato de sódio ou a combinação, em comparação com camundongos controle (Figura 3D). Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram a diminuição mais significativa na h-SOD1G93A agregada na região lombar da medula espinhal, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio.
Redução da agregação de h-SOD1G93A e aumento da expressão de ZO-1 e Claudina-5 na região lombar da medula espinhal de camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol/butirato de sódio. (A) As expressões de ZO-1 e Claudina-5 aumentaram na medula espinhal de todos os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO-1 e Claudina-5 na região lombar da medula espinhal, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio por WB. Os dados são expressos como média ± DP. n = 4, teste ANOVA de uma via. (B) As expressões de ZO-1 e (C) Claudina-5 aumentaram na região lombar da medula espinhal de todos os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO-1 e Claudina-5 na região lombar da medula espinhal, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol e apenas com butirato de sódio, conforme determinado por coloração IF. A intensidade de fluorescência relativa foi quantificada com ImageJ contando 3 imagens para cada amostra. Os dados são mostrados como média ± DP, n = 3 por grupo, teste ANOVA de uma via. (D) A h-SOD1G93A agregada diminuiu na região lombar da medula espinhal dos grupos tratados com Riluzol, butirato de sódio ou combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. A agregação da proteína h-SOD1G93A foi quantificada com AggreCount contando 3 imagens para cada amostra. Os dados são mostrados como média ± DP, n = 3 por grupo, teste ANOVA de uma via. Todos os valores de p são mostrados nas figuras.
Camundongos SOD1G93A Tratados com a Combinação de Riluzol e Butirato de Sódio Apresentaram Redução na Agregação de h-SOD1G93A e Aumento de ZO-1 e Claudina-5 no Córtex Cerebral
Para testar a hipótese de que o tratamento combinado de Riluzol e butirato de sódio reduz melhor a agregação da proteína mutada h‐SOD1 e restaura a função da barreira intestino-cérebro, retardando assim o início da ELA, examinamos ZO-1 e Claudina-5 no córtex do tecido cerebral. A combinação de Riluzol e butirato de sódio aumentou significativamente as expressões de ZO-1 e Claudina-5 no córtex cerebral, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou butirato de sódio, conforme WB (Figura 4A). Como esperado, camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO-1 e Claudina-5 no córtex cerebral, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio, conforme determinado por coloração IF (Figura 4B,C). A expressão de Claudina-1 não apresentou alteração no córtex cerebral. Enquanto isso, a agregação da proteína h‐SOD1G93A foi quantificada com AggreCount. Camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma diminuição significativa na agregação de h‐SOD1G93A no córtex cerebral, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio (Figura 4D).
Reduzida agregação de h‐SOD1G93A e aumento da expressão de ZO‐1 e Claudin‐5 no córtex cerebral de camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol/butirato de sódio. (A) As expressões de ZO‐1 e Claudin‐5 foram aumentadas no córtex cerebral dos grupos tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO‐1 e Claudin‐5 no córtex cerebral, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio, por WB. Os dados são expressos como média ± DP. n = 4, teste ANOVA de uma via. (B) A expressão de ZO‐1 e (C) Claudin‐5 aumentaram no córtex cerebral de todos os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram um aumento significativo na expressão de ZO‐1 e Claudin‐5 no córtex cerebral, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio, conforme determinado por coloração por IF. A intensidade relativa de fluorescência foi quantificada com ImageJ pela contagem de 3 imagens para cada amostra. Os dados são mostrados como média ± DP, n = 3 por grupo, teste ANOVA de uma via. (D) A agregação de h‐SOD1G93A foi reduzida no córtex cerebral de todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos controle. Enquanto isso, camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma diminuição significativa no córtex cerebral da agregação de h‐SOD1G93A, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou butirato de sódio. A agregação da proteína h‐SOD1G93A foi quantificada com AggreCount pela contagem de 3 imagens para cada amostra. Os dados são mostrados como média ± DP, n = 3 por grupo, teste ANOVA de uma via. Todos os valores de p são mostrados nas figuras.
O Tratamento Combinado de Riluzol e Butirato de Sódio Reduziu o LPS Sênico e as Citocinas Inflamatórias em Camundongos SOD1G93A
O vazamento intestinal desencadeia a passagem de LPS bacteriano para o sangue. Assim, o LPS sérico pode ser testado por ELISA (Liu et al.; Lu et al.). Conforme mostrado na Figura 5A, os níveis de LPS diminuíram em todos os camundongos tratados. A expressão da citocina inflamatória sérica IL-17 diminuiu nos grupos Riluzol, butirato de sódio ou na combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com os camundongos controle (Figura 5B). Enquanto isso, a combinação de Riluzol e butirato de sódio em camundongos SOD1G93A reduziu significativamente o LPS sérico e a expressão de IL-17, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Os níveis das citocinas inflamatórias séricas IL-6 (Figura 5C) e IFN-γ (Figura 5D) mostraram uma ligeira diminuição sem significância estatística nos grupos tratados com Riluzol e butirato de sódio, em comparação com camundongos SOD1G93A sem qualquer tratamento. Mas os camundongos com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma diminuição significativa na IL-6 e IFN-γ séricos, em comparação com os camundongos SOD1G93A não tratados. No entanto, as citocinas séricas IL-4 e IP-10 não se alteraram em todos os grupos (Figura 5E,F), sugerindo que o papel da combinação de Riluzol e butirato de sódio pode ser específico para certas citocinas inflamatórias.
Redução do LPS sérico, IL-17, IL-6 e IFN-γ em camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol/butirato de sódio. A expressão das citocinas inflamatórias séricas (A) LPS e (B) IL-17 diminuiu em todos os grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol, apenas com butirato de sódio ou com a combinação de Riluzol e butirato de sódio, em comparação com os camundongos controle. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma diminuição significativa na expressão de LPS sérico e IL-17 em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Os dados são expressos como média ± DP. n = 6, teste ANOVA de uma via. A expressão das citocinas inflamatórias séricas (C) IL-6 e (D) IFN-γ mostrou uma ligeira diminuição sem significância estatística nos grupos de camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol e apenas com butirato de sódio, em comparação com camundongos SOD1G93A sem qualquer tratamento. Mas os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma diminuição significativa na expressão de IL-6 e IFN-γ séricos em comparação com os camundongos SOD1G93A não tratados. Enquanto isso, os camundongos SOD1G93A tratados com a combinação de Riluzol e butirato de sódio apresentaram uma diminuição significativa na expressão de IL-6 e IFN-γ séricos em comparação com os camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Os dados são expressos como média ± DP. n = 6, teste ANOVA de uma via. A expressão das citocinas inflamatórias séricas (E) IL-4 e (F) IP-10 não se alterou em todos os grupos. Os dados são expressos como média ± DP. n = 6, teste ANOVA de uma via. Todos os valores de p são mostrados nas figuras.
Discussão
No presente estudo, investigamos os papéis combinados do Riluzol e do butirato de sódio na terapia da ELA e exploramos novos alvos terapêuticos para a ELA por meio da restauração das funções de barreira através do eixo intestino-cérebro. Camundongos SOD1G93A tratados com Riluzol e butirato de sódio apresentaram tempo de rotarod significativamente maior, maior força de preensão e melhores barreiras pelas junções estreitas, em comparação com o tratamento apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. A agregação da proteína mutada h-SOD1 foi testada como indicador da progressão da ELA. Uma redução maior da agregação de SOD1G93A foi observada no cólon, medula espinhal lombar e córtex cerebral com o tratamento combinado de Riluzol e butirato, em comparação com o tratamento apenas com Riluzol ou apenas com butirato. A expressão das proteínas de junção estreita (ZO-1 e Claudina-5) aumentou significativamente no cólon, medula espinhal lombar e córtex cerebral com o tratamento combinado de Riluzol e butirato, em comparação com o tratamento apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Um medicamento existente para ELA e seus efeitos sinérgicos com o butirato de sódio fornecem insights sobre a função de barreira e a progressão da ELA.
O mecanismo do Riluzol na proteção do intestino na ELA é desconhecido (Kieran et al. ; Park et al. ). Nossos dados não apenas mostraram o papel combinado do Riluzol e do butirato de sódio em retardar a progressão da doença por meio da preservação da função de barreira e inibição da inflamação, mas também demonstraram que apenas o Riluzol tem impactos benéficos nas barreiras intestinal e hematoencefálica.

Um estudo anterior utilizou tratamento I.P. de Riluzol e fenilbutirato de sódio (NaPB) em camundongos com ELA (Del Signore et al. ). Mostrou que a administração de Riluzol/NaPB aumentou a acetilação em H4 e aumentou a translocação de NF‐κB p50 para o núcleo em camundongos SOD1G93A. No entanto, o Riluzol e o butirato de sódio não foram testados. No presente estudo, o papel combinado do Riluzol e do butirato de sódio nas funções de barreira e TJs foi investigado através do eixo intestino‐cérebro.

As TJs controlam a passagem paracelular de substratos através da barreira hematoencefálica (BHE). Qualquer dano às proteínas TJ pode resultar em aumento da permeabilidade. A combinação de Riluzol e butirato de sódio não apenas melhora a função de barreira intestinal, conforme evidenciado pela diminuição da permeabilidade e aumento da expressão das proteínas TJ, Claudina 5 e ZO‐1, no intestino, mas também aumenta a Claudina 5 e ZO‐1 na medula espinhal e no cérebro. A redução do LPS sérico e das citocinas inflamatórias também explica a influência da combinação de Riluzol e butirato de sódio na restauração dos danos à barreira e na função dos neurônios motores da medula espinhal e das estruturas neuromusculares na progressão da ELA.

Aumento de citocinas inflamatórias séricas (Joyce et al. ), LPS (Joyce et al. ) e microbioma aberrante foram relatados em estudos anteriores de ELA humana (Zhang et al. ). De fato, o aumento das citocinas inflamatórias IL‐17 e IL‐23 foi relatado no soro e no líquido cefalorraquidiano de pacientes com ELA (Zhang et al. ). Anteriormente, demonstramos aumento do IL‐17 sérico em camundongos SOD1G93A com ELA, em comparação com camundongos do tipo selvagem (Rentzos et al. ). A combinação de Riluzol e butirato de sódio resultou em uma diminuição significativa do LPS sérico e IL‐17 e uma redução ligeira de IL‐6 e IFN‐γ em nosso estudo atual. Acreditamos que a combinação de Riluzol e butirato de sódio foi capaz de manter as funções de barreira intestinal por meio da redução do LPS sérico e das citocinas inflamatórias e do aumento das proteínas TJ.
Estudos anteriores em doença inflamatória intestinal mostraram que o butirato pode contribuir para a restauração da barreira de junção oclusiva (tight junction) ao afetar a expressão de Claudina‐2, Ocludina, Cingulina, ZO‐1 e ZO‐2 [revisado por Ploger et al.]. Os mecanismos são por meio da inibição da histona desacetilase e redução de citocinas inflamatórias (por exemplo, fator de necrose tumoral α e interleucina 13). O butirato é relatado como protetor das TJs, por exemplo, por meio de vias de sinalização celular como a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) (Jan e Harm‐Jan), proteína quinase B (também conhecida como Akt) (Yan e Ajuwon) e proteína quinase C β (Miao et al.). Um estudo recente mostrou que o n‐butirato aumenta a expressão de Claudina‐23 por meio do fator de transcrição SP1 e da via AMPK no intestino (Xu et al.). O mecanismo subjacente aos efeitos sinérgicos do Riluzol e do butirato de sódio na regulação da expressão de TJ permanece desconhecido. Especulamos que os principais impactos ocorrem por meio da inibição da histona desacetilase e redução de citocinas inflamatórias por ambos, Riluzol e butirato de sódio. Além disso, a combinação de Riluzol e butirato de sódio teve um impacto significativo na diminuição do h‐SOD1G93A agregado no intestino, medula espinhal e córtex cerebral, em comparação com camundongos SOD1G93A tratados apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio. Será um tópico de pesquisa futura entender melhor os mecanismos moleculares dos efeitos sinérgicos do Riluzol e do butirato de sódio na função de barreira e na progressão da doença ELA através do eixo intestino‐neurônio.

Evidências emergentes sugerem que alterações no microbioma contribuem para o desenvolvimento ou progressão da ELA (Zhang et al.; Martin et al.; Rowin et al.). Pacientes com ELA exibiram uma mudança notável em seu microbioma intestinal, caracterizada principalmente por uma diversidade significativamente menor de bactérias em comparação com indivíduos saudáveis (Rowin et al.; Blacher et al.). Pacientes com ELA com anormalidades na microbiota intestinal podem ter um possível efeito na gravidade da doença, com menor sobrevida em pacientes com ELA com uma maior proporção de Firmicutes para Bacteroides (Lee et al.). Camundongos SOD1G93A mostraram um perfil de microbioma anormal com uma população reduzida de bactérias produtoras de butirato (Zhang et al.). Em camundongos SOD1G93A alimentados com butirato de sódio, a homeostase microbiana intestinal foi restaurada, a integridade intestinal foi melhorada e o tempo de vida foi prolongado, em comparação com aqueles em camundongos sem tratamento (Zhang et al.). O Riluzol foi relatado como sendo significativamente metabolizado por 40 linhagens de bactérias selecionadas (Zimmermann et al.; Boddy et al.), afetando o microbioma intestinal através do metabolismo e da circulação (Gotkine et al.). Se o tratamento apenas com butirato de sódio ou apenas com Riluzol pode alterar o perfil e a função do microbioma intestinal, a combinação de Riluzol e butirato de sódio provavelmente impacta o microbioma intestinal. Investigar alterações específicas do microbioma após o tratamento combinado pode ser nosso tópico de pesquisa futura.
Em conjunto, nossos dados sugerem que a combinação de Riluzol e butirato de sódio é mais eficiente e eficaz do que o tratamento apenas com Riluzol ou apenas com butirato de sódio para retardar a progressão da ELA. Restaurar a função de barreira e inibir a inflamação crônica no intestino, medula espinhal e cérebro fornece uma potencial estratégia terapêutica para a ELA. Nosso estudo abre um novo caminho para direcionar o eixo intestino-neurônio no tratamento da ELA.
Contribuições dos Autores
Y.Z. realizou os estudos celulares e animais, as análises detalhadas dos resultados; Y.Z. e K.R. realizaram estudos animais; Y.Z. e J.S. prepararam as Figuras e o texto do rascunho; Y.X. contribuiu para a análise estatística dos dados e o texto do rascunho; e J.S. obteve fundos, delineou o estudo e dirigiu o projeto. Todos os autores contribuíram para a redação do manuscrito.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Todos os dados relacionados a este artigo estão depositados em DOI: 10.5281/zenodo.15098540.
Referências
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