pmid: "40431355"
title: ""
authors: "Wang G, Gong H, Zou Y, Zhang H, Mao X"
journal: "Nutrients"
pubdate: "2025 May 08"
doi: "10.3390/nu17101610"
source: "PMC Full Text"

Autores

Wang G, Gong H, Zou Y, Zhang H, Mao X

Periodico

Nutrients (2025 May 08)

Conteudo

Bifidobacterium animalis subsp. lactis PB200 Melhora a Função de Barreira Intestinal e o Distúrbio da Flora em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos

Contexto/Objetivos: O uso excessivo ou inadequado de antibióticos pode causar efeitos adversos como disbiose da microbiota intestinal e disfunção da barreira intestinal. A intervenção probiótica pode aliviar efetivamente esses sintomas. No entanto, a eficácia precisa do Bifidobacterium animalis subsp. lactis PB200 (B. lactis PB200) na mitigação da lesão intestinal induzida por antibióticos ainda não está clara. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar sistematicamente os efeitos do B. lactis PB200 na lesão da barreira intestinal e na disbiose da microbiota intestinal em um modelo murino de lesão intestinal induzida por antibióticos. Métodos: Camundongos BALB/c receberam ceftriaxona sódica por gavagem oral durante sete dias consecutivos, seguido de intervenção probiótica diária por gavagem gástrica durante 4 semanas. Resultados: Os resultados indicaram que o B. lactis PB200 desempenhou um papel positivo no aprimoramento da função de barreira intestinal, evidenciado pela morfologia intestinal restaurada e pelo aumento da expressão de junções estreitas, incluindo ZO-1, Claudina-4 e Ocludina (2,76 vezes, 4,39 vezes e 2,61 vezes, respectivamente) em comparação ao grupo Modelo. O B. lactis PB200 normalizou os níveis de fatores pró e anti-inflamatórios séricos, incluindo IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10, e elevou a diversidade e riqueza da microbiota intestinal. O B. lactis PB200 elevou significativamente os níveis de ácido propiônico e ácido butírico, com aumentos de 1,67 vezes e 2,82 vezes, respectivamente, em comparação ao grupo Modelo. Notavelmente, o B. lactis PB200 reduziu a abundância de Enterocloster e aumentou a abundância de Parabacteroides, promovendo o reequilíbrio da microbiota intestinal. Conclusões: Em conjunto, esses achados destacaram o potencial significativo do B. lactis PB200 em aliviar os danos à barreira intestinal e restaurar o equilíbrio da microbiota intestinal causados por um antibiótico.

1. Introdução

Os antibióticos são comumente usados no tratamento clínico de doenças causadas por bactérias patogênicas. No entanto, eles também podem esgotar micróbios comensais e perturbar a microecologia intestinal, o que leva a efeitos adversos na homeostase intestinal. A ceftriaxona sódica, um antibiótico β-lactâmico, demonstrou induzir disbiose da microbiota intestinal após administração de curto e longo prazo. Tais perturbações resultaram no crescimento excessivo de patógenos oportunistas, danos à barreira intestinal e disfunção imunológica. Essas consequências prejudicam significativamente a saúde intestinal geral. Portanto, é necessário compreender os mecanismos pelos quais os antibióticos comprometem a integridade da barreira intestinal para facilitar o desenvolvimento de intervenções nutricionais seguras e eficazes.
Manter a homeostase intestinal é fundamental para a saúde geral, e a barreira intestinal desempenha um papel indispensável nesse processo. A idade, a dieta e o uso de antibióticos podem ter impacto sobre a microbiota intestinal, que se encontra em estado de equilíbrio dinâmico. A microbiota intestinal é essencial para manter a homeostase intestinal. Ao produzir metabólitos bioativos, como os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), os microrganismos comensais inibem competitivamente a colonização patogênica, ao mesmo tempo que reforçam a integridade da barreira intestinal. Além disso, o butirato melhorou a barreira epitelial intestinal ao aumentar a expressão de Claudina-1 e reverteu a expressão reduzida de ZO-1 e Ocludina. No entanto, camundongos tratados com antibióticos apresentaram uma redução acentuada na expressão de junções oclusivas (tight junctions, TJs). Antibióticos de amplo espectro podem afetar a abundância da microbiota intestinal, levando a alterações adversas na estrutura da microbiota intestinal e reduções evidentes na riqueza e diversidade taxonômicas. Essa ruptura da barreira intestinal subsequentemente aumentou a permeabilidade das camadas de células epiteliais. A barreira intestinal comprometida permite que toxinas ou bactérias entrem na circulação sistêmica, resultando em inflamação e infecção. O desequilíbrio do microbioma intestinal está associado a uma variedade de condições adversas, incluindo doença inflamatória intestinal (DII), diarreia associada a antibióticos (DAA), infecção por Clostridioides difficile (ICD), obesidade e outras doenças, contribuindo para uma baixa qualidade de vida e altos custos médicos. Portanto, é urgente restaurar a homeostase intestinal o mais rápido possível.
Para aliviar os efeitos colaterais associados ao tratamento com antibióticos, intervenções eficazes são necessárias. Utilizar probióticos apropriados para regular a disbiose intestinal e distúrbios relacionados representa uma estratégia fundamental para enfrentar esses desafios. Relatos anteriores mostraram que espécies de Bifidobacterium têm a função de aliviar a DAA, restaurar a homeostase da microbiota intestinal e promover a produção de AGCCs. Além disso, B. lactis NFBAL23 aliviou marcadamente a inflamação induzida por LPS em ratos neonatos. Obtivemos uma bactéria denominada Bifidobacterium animalis subsp. lactis PB200 (B. lactis PB200), que possui uma boa característica de cultura de alta densidade e efeito inibitório sobre bactérias patogênicas in vitro. Notavelmente, B. lactis PB200 foi relatada por melhorar a imunidade e a flexibilidade cognitiva. No entanto, seu potencial para regular a composição da microbiota intestinal e aliviar danos intestinais após lesão induzida por antibióticos permanece insuficientemente explorado. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar sistematicamente os efeitos de B. lactis PB200 sobre a inflamação sistêmica, a integridade da barreira intestinal, a diversidade e composição da microbiota intestinal, bem como a produção bacteriana de AGCCs em um modelo murino de lesão intestinal induzida por antibióticos. Além disso, análises de correlação entre microbiota intestinal, fatores inflamatórios e níveis de AGCCs foram realizadas para elucidar melhor os mecanismos subjacentes. Compreender esses efeitos de B. lactis PB200 pode fornecer importantes insights para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas baseadas em probióticos para mitigar distúrbios intestinais associados a antibióticos em humanos.

2. Materiais e Métodos

2.1. Materiais

Kits de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para LPS, IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 foram adquiridos da Meimian Industrial Co., Ltd. (Yancheng, China). Caldo de Man, Rogosa e Sharpe (MRS), ágar MRS e cloridrato de L-cisteína foram adquiridos da Hope Bio-technology Co., Ltd. (Qingdao, China). Um kit de quantificação de proteínas BCA foi obtido da Solarbio (Beijing, China). Anticorpos primários contra ZO-1 (Cat.: 61-7300), Ocludina (Cat.: 40-4700), Claudina-4 (Cat.: 36-4800) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, EUA). O anticorpo primário contra β-actina (Cat.: bsm-63325R) foi obtido da Bioss Inc. (Beijing, China). Anticorpos secundários, tampão de lise RIPA, inibidor de protease e fosfatase foram adquiridos da Beyotime Biotechnology (Xangai, China). A membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) foi adquirida da Millipore Corp. (Bedford, MA, EUA).
A cepa bacteriana Bifidobacterium animalis subsp. lactis PB200 (CGMCC No.30390, Centro de Coleções de Culturas Microbiológicas Gerais da China, Pequim, China) foi cultivada anaerobicamente em caldo MRS suplementado com 0,05% (p/v) de cloridrato de L-cisteína a 37 °C por 48 h. Antes do uso, B. lactis PB200 foi subcultivada duas vezes. As células bacterianas foram então colhidas por centrifugação a 4000× g por 10 min a 4 °C e lavadas duas vezes com solução salina estéril. Além disso, no pré-experimento para avaliar as concentrações aproximadas de bactérias viáveis, diluições adequadas da cultura foram plaqueadas em ágar MRS contendo 0,05% (p/v) de cloridrato de L-cisteína e incubadas anaerobicamente a 37 °C por 48 h. Subsequentemente, a cepa bacteriana foi diluída em solução salina estéril para preparar suspensões bacterianas com contagem viável de 5 × 1010, 5 × 108 e 5 × 106 UFC/mL, respectivamente.

2.3. Animais e Delineamento Experimental
Camundongos BALB/c machos de cinco semanas de idade (18 ± 2 g, grau SPF) foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pequim, China). Todos os animais foram mantidos em ambiente livre de patógenos específicos (22 ± 2 °C, umidade constante 55 ± 5%, ciclo claro/escuro de 12 h). Todos os animais foram alojados em gaiolas de Plexiglas transparentes (37 cm × 16 cm × 13,5 cm) e receberam comida à vontade (Research Diets, New Brunswick, NJ, EUA) e água, e foram aclimatados por 1 semana antes do experimento.
Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos, com 10 camundongos em cada grupo: grupo controle (CON), grupo ceftriaxona sódica (Model), grupo ceftriaxona sódica + suspensão bacteriana de baixa concentração (L-B. lactis), grupo ceftriaxona sódica + suspensão bacteriana de média concentração (M-B. lactis), grupo ceftriaxona sódica + suspensão bacteriana de alta concentração (H-B. lactis). Um total de 50 camundongos foram envolvidos. O esquema do delineamento do estudo é mostrado na Figura 1A. O grupo CON recebeu gavagem diária de solução salina normal dos dias 0 a 35. O grupo Modelo recebeu ceftriaxona sódica (2,5 g/kg de peso corporal) dos dias 0 a 7, seguido por gavagem de solução salina normal dos dias 7 a 35 para observar a restauração natural. O grupo L-B. lactis, grupo M-B. lactis e grupo H-B. lactis receberam gavagem gástrica de ceftriaxona sódica (2,5 g/kg de peso corporal) por um período contínuo de 7 dias, seguido por 0,2 mL das suspensões de B. lactis (1 × 106, 1 × 108 e 1 × 1010 UFC por dia) dos dias 7 a 35, respectivamente. Para minimizar possíveis fatores de confusão, como viés espacial e temporal, as posições das gaiolas foram rotacionadas diariamente e as coletas de amostras foram realizadas em ordem balanceada. Após jejum noturno, todos os camundongos foram totalmente anestesiados com isoflurano e depois eutanasiados por deslocamento cervical; amostras de sangue, tecidos e amostras fecais foram coletadas para análise.
Os índices esplênico, tímico e cecal foram calculados usando as seguintes fórmulas (1), (2) e (3):
O experimento animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Agrícola da China (o número de registro de revisão ética é AW41213202-4-2).
2.4. Medição de Citocinas no Soro
Amostras de sangue foram coletadas do seio orbital sob anestesia, seguidas de centrifugação (4 °C, 3500 rpm, 10 min) para obtenção do soro. Os níveis de biomarcadores, incluindo lipopolissacarídeo (LPS), interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α), foram medidos por kits de ELISA comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras de soro foram diluídas antes da determinação. Após uma série de etapas de incubação e lavagem, uma solução de substrato foi adicionada, que reagiu com a enzima conjugada ao anticorpo. Subsequentemente, a absorbância foi detectada em um comprimento de onda específico de 450 nm usando um Leitor de Microplacas (Bio-Rad Laboratories, Kyoto, Japão) dentro de 15 min após a adição de uma solução de parada.
2.5. Análise Histológica do Tecido do Cólon
A avaliação histopatológica da arquitetura do cólon foi realizada por coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E), conforme descrito anteriormente. Os tecidos do cólon distal (10 mm) dos camundongos foram coletados e fixados imediatamente em solução de paraformaldeído a 4%. Após desidratação, os tecidos foram embebidos em parafina e cortados em seções de 4 μm de espessura. Subsequentemente, as seções de tecido foram coradas com H&E. As imagens foram capturadas em um microscópio (Axio Vert.A1, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Oberkochen, Alemanha), e pelo menos 3 imagens por seção foram analisadas. De acordo com a gravidade do edema tecidual (0-4), dano às criptas (0-4), descamação de células epiteliais (0-4) e infiltração de células inflamatórias (0-4), o escore histológico foi determinado.
2.6. Análise de Western Blot
O Western blot foi utilizado para quantificar o nível de junções estreitas, especificamente ZO-1, Claudina-4 e Ocludina. Amostras do cólon foram homogeneizadas com tampão de lise RIPA que continha inibidor de protease e fosfatase. Dez microgramas de cada amostra foram separados por SDS-PAGE a 10% e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após bloqueio com leite desnatado a 5%, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários específicos contra ZO-1 (1:1000), Ocludina (1:1000), Claudina-4 (1:1000) e β-actina (1:5000). Subsequentemente, os anticorpos secundários correspondentes (1:1000) foram incubados por 60 min. As bandas imunorreativas foram visualizadas usando reagentes quimioluminescentes aprimorados. As imagens foram obtidas pelo sistema de imagem Tanon (Tanon, Xangai, China), e as intensidades das bandas foram quantificadas com o software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).
2.7. Extração de DNA Microbiano e Sequenciamento do Gene 16S rRNA
O DNA genômico microbiano de amostras fecais foi extraído utilizando o Kit de DNA E.Z.N.A.® (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EUA) de acordo com um protocolo recomendado. As concentrações de DNA foram detectadas usando o espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA), seguido por uma avaliação da qualidade da extração de DNA. Subsequentemente, o DNA genômico foi empregado para amplificar as regiões V3 a V4 dos genes 16S rRNA. O sequenciamento paired-end foi conduzido na plataforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA).
2.8. Análise de Bioinformática
Os dados da microbiota foram processados e analisados pelo QIIME2 (versão 2019.4). Resumidamente, os dados brutos de sequência foram demultiplexados e filtrados por qualidade pelo QIIME, seguido pela remoção de ruído com DADA2. Subsequentemente, o banco de dados Greengenes (Versão 13.8) foi utilizado para anotar informações taxonômicas. De acordo com a distribuição de ASV em diferentes amostras, a diversidade alfa em cada grupo foi avaliada. Para avaliar a diversidade beta, a análise de componentes principais (PCA) em ASV foi estimada pelo software R. Em seguida, ASVs notavelmente diferentes em cada nível taxonômico (Filo, Classe, Ordem, Família, Gênero) foram realizadas usando o MetagenomeSeq do software R. As correlações entre a microbiota intestinal e os parâmetros bioquímicos séricos e os SCFAs fecais foram obtidas usando a análise de correlação de Spearman e o procedimento de Benjamini–Hochberg foi aplicado para correções múltiplas. Os perfis de funcionalidade microbiana foram previstos com base no PICRUSt2 (Investigação Filogenética de Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados) para gerar a via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG).
2.9. Análise de Ácidos Graxos de Cadeia Curta Fecais
As concentrações de SCFAs fecais foram quantificadas conforme relatado anteriormente. Resumidamente, as amostras fecais foram homogeneizadas em 500 μL de água ultrapura, e então 200 μL do sobrenadante foram extraídos com 100 μL de ácido fosfórico a 15% (v/v) e 280 μL de éter. Subsequentemente, as amostras foram submetidas à centrifugação (12.000 rpm, 4 °C por 10 min), o sobrenadante foi coletado e medido por um cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas (Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, EUA).
2.10. Análise Estatística
O software IBM SPSS (versão 26.0, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para análise estatística. Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada com ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey (p < 0,05).
3. Resultados
3.1. Efeitos de B. lactis no Peso Corporal e Índices de Órgãos Imunes em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos
O peso corporal dos camundongos e seu consumo de alimento foram observados durante todo o experimento. Os pesos corporais e a ingestão alimentar média diária dos camundongos nos grupos Modelo, L-B. lactis, M-B. lactis e H-B. lactis diminuíram significativamente na segunda semana (p < 0,05). O grupo Modelo apresentou peso menor do que o CON ao final do experimento. No entanto, o tratamento probiótico recuperou o peso corporal e a ingestão de alimento dos camundongos para o nível normal, e não houve diferença significativa no peso corporal dos camundongos entre o CON e os grupos L-B. lactis, M-B. lactis e H-B. lactis (Figura 1B e Figura S1). Os índices de timo e baço foram apresentados na Figura 1C,D. Em comparação ao CON, os índices de timo e baço do grupo Modelo foram reduzidos notavelmente (p < 0,05), os quais foram revertidos pelo tratamento probiótico (p < 0,05). Como mostrado na Figura 1E–G, o grupo Modelo apresentou um índice cecal maior do que o CON, enquanto o comprimento do cólon no grupo Modelo foi significativamente menor em comparação ao CON (p < 0,05). No entanto, os índices cecais nos grupos L-B. lactis, M-B. lactis e H-B. lactis diminuíram drasticamente em comparação ao grupo Modelo, e os comprimentos do cólon dos camundongos no grupo M-B. lactis e no grupo H-B. lactis foram semelhantes aos do CON (p > 0,05).
3.2. B. lactis Suprimiu a Resposta Inflamatória em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos
Em comparação ao CON, os camundongos do grupo Modelo apresentaram níveis notavelmente aumentados de diferentes citocinas pró-inflamatórias (p < 0,05), incluindo IL-1β, IL-6 e TNF-α, juntamente com LPS, e redução de IL-10, como mostrado na Figura 2. Notavelmente, o tratamento com B. lactis PB200 normalizou os níveis dessas citocinas pró-inflamatórias e mitigou o aumento das concentrações de LPS (p < 0,05). Além disso, os grupos L-B. lactis, M-B. lactis e H-B. lactis tiveram níveis mais altos de IL-10 em comparação ao grupo Modelo (p < 0,05). B. lactis PB200 recuperou os padrões séricos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios desafiados por um antibiótico.
3.3. Efeitos de B. lactis na Integridade da Barreira Intestinal em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos
A morfologia histológica do cólon dos camundongos foi avaliada por coloração H&E. Conforme mostrado na Figura 3A, nem o tratamento com antibióticos nem a suplementação com probióticos afetaram significativamente a arquitetura das criptas do cólon. Além disso, o exame da estrutura da mucosa revelou uma notável ausência de infiltração de células inflamatórias na lâmina própria. Os camundongos do grupo Modelo apresentaram descamação das células epiteliais do cólon e os limites da mucosa estavam frouxos e irregulares (Figura 3A; ver setas azuis). O espaço entre a submucosa e a camada muscular aumentou ligeiramente (Figura 3A, ver a seta amarela), indicando que a intervenção com ceftriaxona sódica pode afetar a barreira mecânica intestinal. No entanto, em comparação com o grupo Modelo, a suplementação com B. lactis PB200 restaurou efetivamente a integridade da barreira intestinal, com reduções significativas nos escores histológicos (p < 0,05 em todos os três grupos probióticos, Figura 3B). Investigamos ainda os efeitos do tratamento com antibióticos na barreira mecânica intestinal, e a expressão de ZO-1, Ocludina e Claudina-4 foi avaliada por Western Blot. Conforme mostrado na Figura 3B,C, a expressão de ZO-1, Ocludina e Claudina-4 no cólon do grupo Modelo foi regulada negativamente em comparação com o CON (p < 0,05). No entanto, a expressão de ZO-1 e Claudina-4 nos tecidos do cólon aumentou acentuadamente após a suplementação com probióticos (p < 0,05).
3.4. Efeitos de B. lactis nos Níveis de Ácidos Graxos de Cadeia Curta (AGCC) Fecais em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos
Conforme mostrado na Figura 4A–E, o conteúdo de ácido propiônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico e ácido isovalérico nas fezes foi significativamente reduzido no grupo Modelo em comparação com o CON (p < 0,05). No entanto, a suplementação com B. lactis PB200 reverteu a redução desses AGCC fecais (p < 0,05).
3.5. Efeitos de B. lactis na Diversidade da Microbiota em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos
3.5.1. Diversidade Alfa
Conforme mostrado na Figura 5A,B, o índice de Chao1 e o índice de Shannon no grupo Modelo foram significativamente diminuídos em comparação com o CON, sugerindo que a diversidade microbiana foi significativamente reduzida no grupo Modelo (p < 0,05). Enquanto esses índices aumentaram significativamente após o tratamento com probióticos (p < 0,05), o índice de Chao1 aumentou de 4,64 ± 0,12 para 5,62 ± 0,15 e o índice de Shannon aumentou de 153,41 ± 14,43 para 217,91 ± 20,72. Esses resultados sugeriram que o tratamento com probióticos teve um efeito protetor sobre a diversidade microbiana.
3.5.2. Diversidade Beta
A análise de PCA revelou que as comunidades microbianas estavam nitidamente separadas entre todos os grupos, assim como as amostras nos grupos que se agruparam com sucesso em um determinado intervalo. A variação percentual do PC1 explicou 52,7% e a variação percentual do PC2 explicou 24,3%. A distância entre CON e o grupo Modelo foi maior, enquanto a distribuição das amostras do grupo M-B. lactis foi mais próxima daquela do CON (Figura 5C). Esses achados demonstraram a capacidade do B. lactis PB200 de melhorar a disbiose induzida por antibióticos por meio da reconstituição estrutural da microbiota intestinal.

3.6. B. lactis Modulou a Composição da Microbiota Intestinal em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos

O perfil de ASV foi estimado em diferentes resoluções taxonômicas e diferenças relevantes entre os grupos foram reveladas. No nível de filo, em comparação com o CON, o grupo Modelo apresentou um aumento acentuado na abundância de Proteobacteria (p < 0,05). No entanto, a abundância relativa de Proteobacteria diminuiu, enquanto a abundância de Actinobacteorita aumentou após a intervenção probiótica (p < 0,05). (Figura 6A,B). No nível de gênero, o grupo Modelo mostrou enriquecimento de Enterocloster e Blautia_A em comparação com o CON. No entanto, a suplementação com B. lactis PB200 reduziu significativamente a abundância relativa de Enterocloster e Blautia_A (p < 0,05), e a abundância relativa de Parabacteroides_B e Alistipes_A foi significativamente elevada (Figura 6C,D). Além disso, a abundância relativa de Bifidobacterium foi significativamente aumentada nos grupos H-B. lactis. A análise de tamanho de efeito da discriminação linear (LEfSe) também foi realizada com o limiar de escore LDA de 2,0. Conforme mostrado na Figura 6E,F, havia dezenove gêneros significativamente diferentes principais no CON, pertencentes principalmente a Firmicutes_A, Lachnospiraceae, Rikenellaceae, Oscillospiraceae e Ruminococcaceae. Dez gêneros principais de Proteobacteria, Firmicutes_D e Bacteroidaceae foram enriquecidos no grupo Modelo. O grupo L-B. lactis teve seis gêneros distintos significativos, que pertenciam principalmente a Tannerellaceae, Eggerthellaceae e Coriobacteriia. Havia quatro gêneros bacterianos notavelmente diferentes de Muribaculaceae e Erysipelotrichaceae no grupo M-B. lactis. Além disso, Bacteroidota e Actinobacteriota eram mais abundantes no grupo H-B. lactis. A análise da via metabólica KEGG na comunidade microbiana foi realizada pela análise PICRUSt2. Conforme mostrado na Figura 6G, a análise da via metabólica KEGG destacou alterações notáveis entre o grupo Modelo e o grupo M-B. lactis. A abundância de genes microbianos na via de sinalização de células epiteliais na infecção por Helicobacter pylori, infecção por Staphylococcus aureus, biossíntese de lipopolissacarídeos e via de sinalização do receptor NOD-like foi aumentada no grupo Modelo (p < 0,05). No entanto, após a suplementação com B. lactis PB200, a abundância das vias de sinalização diminuiu significativamente (p < 0,05).
3.7. Análise de Correlação da Microbiota Intestinal com Citocinas Inflamatórias Representativas e Ácidos Graxos de Cadeia Curta
A análise de correlação de 22 gêneros e fatores inflamatórios, bem como AGCCs, foi realizada com base na análise de correlação de Spearman. Os resultados na Figura 7 mostraram que Enterocloster e Robinsoniella demonstraram correlações positivas com IL-6 e TNF-α séricos (p < 0,05). Clostridium_Q demonstrou correlações positivas com IL-1β sérica (p < 0,05). Muribaculum, Prevotella e Eubacterium_G demonstraram correlações positivas com ácido butírico fecal (p < 0,05). Acetatifactor demonstrou correlações positivas com ácido propiônico fecal (p < 0,05). Kineothrix, Phocaeicola_A e Lactobacillus demonstraram correlações positivas com ácido valérico fecal (p < 0,05). Em contraste, Bifidobacterium e Phocaeicola_A mostraram associações negativas com LPS sérico (p < 0,05). Prevotella, Ventrimonas e Sporofaciens mostraram associações negativas com TNF-α sérico (p < 0,05). Enterocloster e Robinsoniella mostraram associações negativas com ácido butírico fecal e ácido valérico fecal (p < 0,05). Esses resultados indicaram que B. lactis PB200 teve um efeito melhorado na lesão intestinal induzida por antibióticos em camundongos, o que estava relacionado à otimização estrutural da microbiota intestinal.
4. Discussão
O uso generalizado de antibióticos não só aumenta significativamente a resistência aos medicamentos, mas também perturba a microecologia intestinal e induz danos intestinais. Além disso, estudos anteriores sugeriram que o tratamento com antibióticos levava ao retardo do crescimento e atrofia dos órgãos imunológicos em camundongos. No presente estudo, usamos ceftriaxona sódica para estabelecer com sucesso um modelo de lesão intestinal induzida por antibióticos em camundongos. Descobrimos que os camundongos no grupo Modelo apresentavam retardo no crescimento e menor índice do timo e índice do baço do que CON (Figura 1A–C). O ceco dos camundongos estava notavelmente aumentado no grupo Modelo, com um índice cecal aumentado (Figura 1D,E). No entanto, todos esses sintomas foram restaurados após a suplementação com B. lactis PB200, sugerindo que pode mitigar os efeitos adversos dos antibióticos na saúde intestinal. Nossos dados também demonstraram os efeitos anti-inflamatórios do B. lactis PB200 e seu potencial para restaurar a função de barreira intestinal e modular a disbiose da microbiota intestinal, sugerindo seu potencial como probiótico para a saúde intestinal.
4.1. B. lactis PB200 Melhorou a Integridade da Barreira Intestinal e a Disbiose da Microbiota Intestinal em Camundongos com Lesão Intestinal Induzida por Antibióticos
A barreira mecânica é composta principalmente por uma camada de células epiteliais intestinais e junções estreitas entre as células. Após o tratamento com antibióticos, a morfologia histológica do intestino em camundongos mudou significativamente. Por exemplo, a camada submucosa dos intestinos em camundongos apresentou inchaço e edema, levando a um espaço maior entre a mucosa e a submucosa, sugerindo que a mucosa intestinal estava danificada. Da mesma forma, nossos resultados mostraram que o epitélio intestinal dos camundongos no grupo Modelo foi danificado e o espaço entre a submucosa e a camada muscular aumentou (Figura 3A). Estudos anteriores mostraram que a barreira epitelial intestinal estava prejudicada em pacientes após o tratamento com antibióticos β-lactâmicos. Os antibióticos diminuíram a expressão de junções estreitas e aumentaram a permeabilidade paracelular intestinal. Neste estudo, a suplementação com B. lactis PB200 levou a um aumento significativo na expressão de ZO-1, Ocludina e Claudina-4, em comparação com o grupo Modelo. Esses resultados indicaram que B. lactis PB200 pode contribuir para a manutenção da integridade intestinal e melhora da função da barreira intestinal.
Bacteroidota pode produzir SCFAs e desempenhar um papel potencial na promoção da saúde do hospedeiro. Proteobacteria, um marcador microbiológico de disbiose da microbiota intestinal, tem sido relacionada a distúrbios metabólicos, desregulação imunológica e inflamação intestinal. Nossos resultados mostraram que a diversidade e a riqueza da microbiota intestinal no grupo Modelo foram notavelmente reduzidas (Figura 5). Além disso, a redução em Bacteroidota juntamente com o enriquecimento anormal de Proteobacteria nos camundongos do grupo Modelo refletiram coletivamente o desequilíbrio da microbiota intestinal e a ruptura da homeostase intestinal. No entanto, a suplementação com B. lactis PB200 aumentou a diversidade e a riqueza da microbiota intestinal. B. lactis PB200 aumentou a abundância relativa de Bacteroidota e restaurou a abundância relativa de Proteobacteria para um nível normal (Figura 6A,B), indicando que a suplementação com B. lactis PB200 aliviou a disbiose da microbiota intestinal. Além disso, Enterocloster é um patógeno que tem sido associado à disbiose da microbiota intestinal e a doenças humanas como DII. A colonização de Enterocloster nos intestinos de camundongos foi evidente após o tratamento com antibióticos. Foi descoberto que Blautia estava significativamente associada positivamente com IL-6, IL-1β e TNF-α, e foi considerada um potencial biomarcador de AAD.
Relatos anteriores sugeriram que Parabacteroides reduzia a inflamação e fortalecia a função de barreira intestinal, sendo considerado um “probiótico de próxima geração”. Além disso, antibióticos β-lactâmicos reduziram a abundância de Bifidobacterium e Parabacteroides em neonatos a termo. Em camundongos com lesão por LPS, a abundância relativa de Alistipes foi significativamente reduzida. Além disso, Grazul H et al. descobriram que os probióticos não pareciam colonizar o intestino por si próprios. No entanto, a suplementação probiótica alterou significativamente os tipos de bactérias no intestino dos camundongos. Consistentes com esses achados, observamos que as abundâncias de Enterocloster e Blautia_A aumentaram no grupo Modelo (Figura 6E,F). Por outro lado, essas alterações foram revertidas com a suplementação de B. lactis PB200, juntamente com um aumento significativo em Parabacteroides_B, Bifidobacterium e Alistipes_A (Figura 6C,D).

No entanto, confiar apenas na análise de amostras fecais é insuficiente para avaliar de forma abrangente a colonização de Bifidobacterium lactis PB200 no trato intestinal. Investigações futuras poderiam empregar técnicas moleculares, como a marcação com proteínas fluorescentes, para observar a adesão e distribuição de B. lactis PB200 na mucosa intestinal murina.
4.2. B. lactis PB200 Pode Restaurar a Homeostase Intestinal ao Promover Bactérias Produtoras de SCFAs e Aumentar os SCFAs Fecais

A microbiota intestinal e seus SCFAs derivados desempenham um papel crucial na homeostase intestinal. A ruptura da barreira biológica intestinal impacta indiretamente a função da barreira mecânica intestinal, resultando em uma diminuição da integridade da barreira intestinal. Evidências existentes demonstram que antibióticos de amplo espectro prejudicam significativamente a integridade da barreira intestinal ao reduzir a regulação das junções estreitas (ZO-1 e Ocludina) e diminuir os SCFAs fecais. Estudos utilizando modelos de camundongos pseudo-livres de germes e transplante de microbiota fecal (FMT) revelaram que Bifidobacterium breve CCFM683 elevou a abundância de Odoribacter splanchnicus, uma bactéria produtora de butirato. Essa mudança microbiana melhorou a expressão das junções estreitas, provavelmente mediada pelo aumento da disponibilidade de butirato. A adição do probiótico causou uma mudança metabólica e a resposta transcricional da microbiota intestinal foi modulada. Notavelmente, Alistipes, um produtor reconhecido de SCFAs, apresentou fortes correlações positivas com os níveis de butirato, destacando seu potencial papel na manutenção da barreira. Foi relatado que Alistipes está negativamente ligado à DII e modula o lipidoma do hospedeiro para suprimir a colite em um modelo de camundongo deficiente em IL-10. Em linha com essas observações, nosso estudo identificou correlações positivas significativas entre o conteúdo de SCFAs fecais e as abundâncias relativas de Prevotella, Acetatifactor e Lactobacillus. O tratamento com antibióticos no grupo Modelo reduziu marcadamente as concentrações de SCFAs. No entanto, a suplementação com Bifidobacterium lactis PB200 reverteu esse declínio (Figura 4), potencialmente através do enriquecimento de táxons produtores de SCFAs, como Alistipes e Prevotella. Estudos sobre os impactos dessas bactérias específicas na saúde intestinal são necessários. Esses achados sugeriram que B. lactis PB200 melhorou a disfunção da barreira intestinal induzida por antibióticos ao restaurar a homeostase da microbiota intestinal, promovendo bactérias produtoras de SCFAs e aumentando os SCFAs fecais para melhorar a integridade das junções estreitas. Embora esses dados impliquem a produção de SCFAs mediada pela microbiota nos efeitos protetores do PB200, estudos adicionais são necessários. O perfil metagenômico direcionado e modelos de camundongos livres de germes poderiam esclarecer se táxons específicos medeiam diretamente a reparação da barreira através da síntese de SCFAs.

4.3. B. lactis PB200 Tinha o Potencial de Inibir Vias Inflamatórias para Aliviar a Lesão Intestinal
A microbiota intestinal afeta a saúde intestinal ao regular a expressão de vias de sinalização inflamatória e proteínas-chave associadas. Em nosso estudo, a análise de enriquecimento KEGG indicou que as abundâncias gênicas na via de biossíntese de lipopolissacarídeos e na via de sinalização do receptor NOD-like foram significativamente diferentes entre o grupo Modelo e o grupo M-B. lactis. O lipopolissacarídeo (LPS) tem efeitos prejudiciais sobre a função da barreira intestinal. Os receptores Toll-like (TLRs) são amplamente expressos no epitélio intestinal. O LPS poderia ativar o TLR4, resultando na geração de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias que comprometiam a integridade da barreira epitelial intestinal. A exposição a antibióticos de amplo espectro levou a um aumento notável na reatividade do TLR4 na mucosa intestinal. No entanto, probióticos como B. dentium N8 aumentaram significativamente os níveis de expressão de mRNA de ZO-1 e Ocludina, ao mesmo tempo que reduziram o nível de expressão de mRNA de TLR4. Neste estudo, descobrimos que o conteúdo de LPS sérico aumentou significativamente e os níveis de fatores inflamatórios séricos, nomeadamente IL-1β, IL-6 e TNF-α, aumentaram significativamente após o tratamento com ceftriaxona sódica (Figura 2). O inflamassoma NLRP3 foi ativado tanto no modelo de células Caco-2 tratado com antibiótico de amplo espectro quanto em camundongos, resultando em diminuição da expressão de Claudina e destruição morfológica de ZO-1. A redução de SCFAs é indispensável para a ativação do inflamassoma NLRP3 e a produção de IL-1β. A disbiose da microbiota intestinal resultou em ativação excessiva de NF-κB, contribuindo para a inflamação crônica. A sinalização de TLRs ativou a via de sinalização inflamatória NF-κB, regulando positivamente NLRP3 e pro-IL-1β. No entanto, a suplementação com B. lactis PB200 modulou a disbiose da microbiota intestinal, diminuiu os níveis séricos de LPS e aumentou os níveis de SCFAs fecais. Nós levantamos a hipótese de que B. lactis PB200 potencializou transitoriamente funções que poderiam promover vias anti-inflamatórias dos micróbios residentes. Houve certas limitações em nossa pesquisa; investigações adicionais são necessárias para determinar se B. lactis PB200 melhorou a lesão intestinal induzida por antibióticos ao bloquear a ativação do inflamassoma NLRP3, bem como a via de sinalização NF-κB.
Em conjunto, os resultados da pesquisa descobriram que houve um efeito dose-dependente da suplementação com B. lactis PB200 na lesão intestinal induzida por um antibiótico. Notavelmente, a suplementação com dose média de B. lactis PB200 demonstrou eficácia superior no aumento do peso corporal e na restauração da diversidade da microbiota intestinal em camundongos, em comparação com a dose baixa. Embora a dose alta de B. lactis PB200 tenha tido um efeito protetor mais significativo na barreira intestinal, seu impacto na redução da resposta inflamatória e na modulação da microbiota intestinal foi comparável ao da dose média. Portanto, a dose média de B. lactis PB200 poderia alcançar um efeito de melhoria geral preferível. Estudos clínicos são necessários para confirmar os efeitos benéficos da B. lactis PB200. Além disso, não exploramos os efeitos de longo prazo da suplementação com B. lactis PB200, nem examinamos seu potencial para melhorar outras doenças intestinais. Pesquisas futuras devem abordar esses aspectos para avaliar completamente o potencial clínico da B. lactis PB200.
5. Conclusões
Em conclusão, o tratamento com antibióticos perturbou seriamente a estrutura e a composição da microbiota intestinal, levando a inflamação sistêmica e comprometimento da integridade da barreira intestinal. A B. lactis PB200 exibiu eficácia notável na melhora dos efeitos adversos gastrointestinais induzidos por antibióticos e na restauração do equilíbrio da microbiota intestinal. Nossos dados sugeriram que a melhora da lesão intestinal induzida por antibióticos após a suplementação com B. lactis PB200 foi atribuída coletivamente a vários mecanismos: a regulação da resposta inflamatória, a regulação positiva da expressão de junções apertadas, a modulação da microbiota intestinal e o aumento da produção de ácidos graxos de cadeia curta. Os resultados apoiam a ideia de que a B. lactis PB200 poderia servir como um novo probiótico para aliviar a lesão intestinal induzida por antibióticos. Estudos futuros devem explorar a base mecanicista usando modelos livres de germes ou knockout. Além disso, dado que as respostas fisiológicas observadas em experimentos com animais não podem ser totalmente extrapoladas para humanos, a função benéfica da B. lactis PB200 na saúde humana precisa de verificação clínica adicional.
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Materiais Suplementares
As seguintes informações de suporte podem ser baixadas em , Figura S1: A ingestão média diária de alimentos em cada grupo.
Contribuições dos Autores
Conceituação, G.W., H.G. e X.M.; Metodologia, G.W., H.G., H.Z. e Y.Z.; Análise Formal, G.W.; Redação—Preparação do Rascunho Original, G.W.; Redação—Revisão e Edição, G.W., H.G. e X.M.; Supervisão, X.M.; Aquisição de Financiamento, X.M. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
O experimento animal foi conduzido de acordo com as diretrizes relevantes e requisitos legais e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Animais da Universidade Agrícola da China (o número de série da revisão ética é AW41213202-4-2, 14 de dezembro de 2023).
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Conflitos de Interesse
Yang Zou e Haijiao Zhang são afiliados à Tianjin Haihe Dairy Co., Ltd., uma empresa cuja principal área de pesquisa é a ciência de laticínios. Seu envolvimento neste estudo foi o desenho experimental. Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Referências
Perturbações antibióticas no microbioma intestinal
Efeito bactericida aprimorado do fármaco ceftriaxona encapsulado em carreador lipídico nanoestruturado contra bactérias Escherichia coli gram-negativas: Formulação do fármaco, otimização e estudo de cultura celular
O uso de curto prazo de ceftriaxona sódica leva à ruptura da barreira intestinal e alterações ultraestruturais do rim em ratos SD
Disbiose de longo prazo e flutuações do microbioma intestinal em prematuros tratados com antibióticos
Revisitar a microbiota intestinal e seu impacto na saúde e doença humana
Efeito protetor do butirato de sódio no dano à barreira intestinal e redução do ácido úrico em camundongos com hiperuricemia
O butirato protege contra a resposta inflamatória induzida por ácido γ-d-glutamil-meso-diaminopimélico e a ruptura das junções apertadas através da inibição da histona desacetilase 3 em células epiteliais mamárias bovinas
A farinha de banana verde contribui para a recuperação da microbiota intestinal e melhora a integridade da barreira do cólon em camundongos após perturbação antibiótica
Os efeitos abrangentes de um antibiótico na microbiota intestinal humana, conforme revelado pelo sequenciamento profundo de 16S rRNA
Um mecanismo pelo qual a microbiota intestinal aumenta a permeabilidade e a inflamação em camundongos obesos/diabéticos e no intestino humano
Características da microbiota intestinal em camundongos com diarreia associada a antibióticos
Disbiose intestinal e infecção por Clostridioides difficile em neonatos e adultos
Importância da microbiota intestinal em pacientes com doença inflamatória intestinal
Microbiota intestinal na saúde metabólica e doença humana
Bifidobacterium animalis subsp. lactis XLTG11 melhora a diarreia relacionada a antibióticos ao aliviar a inflamação, melhorar a função da barreira intestinal e regular a flora intestinal
Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 protege contra alterações funcionais e composicionais induzidas por antibióticos no microbioma fecal humano
O eixo microbiota-intestino-cérebro: uma via imunomoduladora crucial para a resiliência do Bifidobacterium animalis subsp. lactis contra o tratamento com LPS em ratos neonatos
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Novos peptídeos de selênio obtidos de Cordyceps militaris enriquecido com selênio aliviam a neuroinflamação e a disbacteriose da microbiota intestinal em camundongos lesionados por LPS
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Efeito do Lactobacillus rhamnosus MN-431 Produtor de Derivados de Indol na Diarreia Induzida por Alimentação Complementar em Filhotes de Ratos Através do Aprimoramento da Função de Barreira Intestinal
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A alteração do microbioma intestinal e do metaboloma pelo Clostridium butyricum pode reparar a disbiose intestinal causada por antibióticos em camundongos
O Bifidobacterium inibe a progressão da tumorigênese colorretal em camundongos através da isomerização de ácidos graxos e modulação da microbiota intestinal
Dinâmica funcional do microbioma intestinal em idosos durante o consumo de probióticos
O gênero Alistipes: Bactérias intestinais com implicações emergentes para inflamação, câncer e saúde mental
O comensal intestinal humano Alistipes timonensis modula o lipidoma do hospedeiro e libera vesículas de membrana externa anti-inflamatórias para suprimir a colite em um modelo de camundongo deficiente em Il10
LPS induz hiperpermeabilidade das células epiteliais intestinais
Proteção contra sepse bacteriana gram-negativa letal ao direcionar o receptor Toll-like 4
O envelhecimento amplifica uma assinatura imunogênica da microbiota intestinal ligada ao aumento da inflamação
Bifidobacterium dentium N8 com características probióticas potenciais previne lesão da barreira intestinal induzida por LPS ao aliviar a resposta inflamatória e regular a junção oclusiva em monocamadas de células Caco-2
A disfunção da barreira de junção oclusiva intestinal induzida por antibióticos está associada à disbiose da microbiota, inflamassoma NLRP3 ativado e autofagia
O papel crítico dos ácidos graxos de cadeia curta na saúde e na doença: Um foco sutil no eixo doença cardiovascular-inflamassoma NLRP3-angiogênese
O papel da anexina A1 na modulação do inflamassoma NLRP3
Efeitos do B. lactis no peso corporal e nos índices de órgãos imunológicos em camundongos. (A) Esboço do desenho do estudo. (B) Peso corporal dos camundongos. (C–E) Efeitos do B. lactis nos índices do baço, índices do timo e índices do ceco em camundongos. (E–G) Efeitos do B. lactis na morfologia do ceco e no comprimento do cólon em camundongos. Os resultados foram expressos como média ± EPM, n = 6. Valores com diferentes letras minúsculas são significativamente diferentes (p < 0.05).
Efeitos do B. lactis nos biomarcadores séricos em camundongos. (A) LPS, (B) IL-1β, (C) IL-6, (D) TNF-α, (E) IL-10. Os resultados foram expressos como média ± EPM. n = 6. Valores com diferentes letras minúsculas são significativamente diferentes (p < 0.05).
B. lactis melhorou a função de barreira intestinal em camundongos. (A) Análise histopatológica com coloração H&E foi realizada nas secções do cólon (n = 3). As imagens foram obtidas com aumento de 20×. Barras de escala: 100 μm. A seta azul mostrou as células epiteliais da mucosa (necróticas e esfoliadas), e a seta amarela mostrou o espaço entre a mucosa e a submucosa. (B) Escore histológico. (C,D) Expressão proteica de ZO-1, Ocludina, Claudina-4. Os resultados foram expressos como média ± EPM, n = 6. Valores com letras minúsculas diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05).
Efeitos de B. lactis nos níveis fecais de AGCC em camundongos. Concentrações de (A) ácido propanóico, (B) ácido butírico, (C) ácido isobutírico, (D) ácido valérico e (E) ácido isovalérico. Os resultados foram expressos como média ± EPM, n = 6. Valores com letras minúsculas diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05).
Efeitos de B. lactis na diversidade da microbiota em camundongos. Análise da diversidade alfa incluindo (A) índice Chao 1 e (B) índice Shannon. (C) Diversidade beta apresentada como análise de componentes principais (PCA). Os resultados foram expressos como média ± EPM, n = 6. Valores com letras minúsculas diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05).
B. lactis modulou a composição da microbiota intestinal em camundongos. Diversidade taxonômica geral das bactérias intestinais analisada por LEfSe. (A) Composição da microbiota intestinal no nível de Filo. (B) Abundância relativa de Bacteroides, Firmicutes, Verrucomicrobiota, Proteobacteria e Actinobacteriota. (C) Composição da microbiota intestinal no nível de Gênero. (D) Abundância relativa de Enterocloster, Parabacteroides, Alistipes, Blautia e Bifidobacterium. (E) Gráfico de cladograma taxonômico da análise LEfSe. (F) Gráfico de escore LDA. Um escore LDA >2,0 foi considerado significativo (p < 0,05). (G) Comparação da predição da função da microbiota intestinal com base na via KEGG entre os grupos Modelo e M-B. lactis. Os resultados foram expressos como média ± EPM, n = 6. Valores com letras minúsculas diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05).
Mapa de calor da correlação de Spearman da microbiota intestinal, fatores inflamatórios representativos e ácidos graxos de cadeia curta. Vermelho representa uma correlação positiva, enquanto azul representa uma correlação negativa. Correlações significativas foram indicadas por 0,01 < p ≤ 0,05 *, 0,001 < p ≤ 0,01 **, p ≤ 0,001 ***, após ajuste usando o procedimento de Benjamini–Hochberg. n = 4.