pmid: "37117223"
title: "Toxinas de urtiga que causam dor têm como alvo TMEM233 para modular Na"
authors: "Jami S, Deuis JR, Klasfauseweh T, Cheng X, Kurdyukov S, Chung F, Okorokov AL, Li S, Zhang J, Cristofori-Armstrong B, Israel MR, Ju RJ, Robinson SD, Zhao P, Ragnarsson L, Andersson Å, Tran P, Schendel V, McMahon KL, Tran HNT, Chin YK, Zhu Y, Liu J, Crawford T, Purushothamvasan S, Habib AM, Andersson DA, Rash LD, Wood JN, Zhao J, Stehbens SJ, Mobli M, Leffler A, Jiang D, Cox JJ, Waxman SG, Dib-Hajj SD, Neely GG, Durek T, Vetter I"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2023 Apr 28"
doi: "10.1038/s41467-023-37963-2"
source: "PMC Full Text"
Toxinas de urtiga que causam dor têm como alvo TMEM233 para modular Na
Autores
Jami S, Deuis JR, Klasfauseweh T, Cheng X, Kurdyukov S, Chung F, Okorokov AL, Li S, Zhang J, Cristofori-Armstrong B, Israel MR, Ju RJ, Robinson SD, Zhao P, Ragnarsson L, Andersson Å, Tran P, Schendel V, McMahon KL, Tran HNT, Chin YK, Zhu Y, Liu J, Crawford T, Purushothamvasan S, Habib AM, Andersson DA, Rash LD, Wood JN, Zhao J, Stehbens SJ, Mobli M, Leffler A, Jiang D, Cox JJ, Waxman SG, Dib-Hajj SD, Neely GG, Durek T, Vetter I
Periodico
Nature communications (2023 Apr 28)
Conteudo
Toxinas de urtiga que causam dor têm como alvo o TMEM233 para modular a função do NaV1.7
Os canais de sódio dependentes de voltagem (NaV) são reguladores críticos da excitabilidade neuronal e são alvos de muitas toxinas que interagem diretamente com a subunidade α formadora do poro, tipicamente por meio das alças extracelulares dos domínios sensores de voltagem ou de resíduos que fazem parte do domínio do poro. A Excelsatoxina A (ExTxA), uma toxina knottin causadora de dor da árvore urticante australiana Dendrocnide excelsa, é a primeira toxina peptídica moduladora de canais NaV derivada de plantas relatada. Aqui, mostramos que o TMEM233, um membro da família dispanina de proteínas transmembrana expressas em neurônios sensoriais, é essencial para a atividade farmacológica da ExTxA nos canais NaV, e que a coexpressão do TMEM233 modula as propriedades de abertura e fechamento do NaV1.7. Essas descobertas identificam o TMEM233 como uma proteína de interação com o NaV1.7 anteriormente desconhecida, posicionam o TMEM233 e as dispaninas como proteínas acessórias indispensáveis para os efeitos mediados por toxinas na abertura e fechamento dos canais NaV e fornecem insights importantes sobre a função dos canais NaV em neurônios sensoriais.
Os canais de sódio dependentes de voltagem funcionam como complexos de sinalização multiproteicos. Aqui, os autores mostram que a dispanina TMEM233 é essencial para a atividade das toxinas de urtiga e que a coexpressão do TMEM233 modula as propriedades de abertura e fechamento do NaV1.7.
Introdução
Os canais de sódio dependentes de voltagem (NaV) são proteínas transmembrana formadoras de poros que são críticas para iniciar e propagar potenciais de ação em células excitáveis. Em neurônios sensoriais, pelo menos cinco das nove isoformas de mamíferos NaV1.1-NaV1.9 são expressas, onde contribuem para a excitabilidade neuronal fisiológica e patológica. Consequentemente, os canais NaV são alvos importantes para a dor, em particular o NaV1.7 sensível à tetrodotoxina, bem como o NaV1.8 e o NaV1.9 resistentes à tetrodotoxina, cuja expressão é amplamente restrita aos nociceptores.
Os canais NaV são compostos por uma subunidade α condutora de íons Na+ que pode se associar a uma ou mais subunidades β acessórias e respondem a mudanças na voltagem transmembrana com rearranjos conformacionais que levam à abertura do poro do canal. Dado seu papel central na função das células excitáveis em todos os filos, não é surpreendente que numerosas toxinas tenham evoluído para ter como alvo os canais NaV. Esses compostos tipicamente interagem diretamente com a subunidade α, seja no poro ou por meio das alças extracelulares dos domínios sensores de voltagem, e pertencem a classes estruturalmente diversas que inibem (por exemplo, as µ-conotoxinas ou µ-terafotoxinas) ou potencializam (por exemplo, as δ-terafotoxinas, ί-conotoxinas ou α-toxinas de escorpião) a função do canal. Esses peptídeos forneceram insights consideráveis sobre a estrutura e função dos canais NaV, bem como o papel de isoformas específicas dos canais NaV na função neuronal e na sinalização da dor.
Recentemente, identificamos uma nova família de toxinas derivadas de venenos vegetais que visam canais NaV, chamadas gympietídeos, de membros da família Urticaceae nativos da Austrália, incluindo as árvores urticantes australianas (gênero Dendrocnide). Essas urtigas são conhecidas por infligir picadas extremamente dolorosas, caracterizadas por sensações agudas semelhantes a choque elétrico, perfurantes, cortantes e queimantes que duram muitas horas, seguidas por crises dolorosas intermitentes e alodinia que persiste por dias ou até semanas. Os gympietídeos, encontrados nos tricomas urticantes preenchidos por fluido que cobrem as folhas e caules desses membros da família das urtigas, foram identificados como os principais agentes causadores da descarga espontânea de potencial de ação, do reflexo axonal de rubor e dos comportamentos nocifensivos in vivo. Esses peptídeos notáveis são caracterizados por uma sequência de aminoácidos primária única e uma estrutura terciária que se assemelha muito aos peptídeos de nó de cistina inibitórios tipicamente encontrados em venenos animais. Consistente com essa alta homologia estrutural, gympietídeos sintéticos inibem a inativação dos canais NaV em neurônios dissociados do gânglio da raiz dorsal (DRG), análogos aos efeitos causados por peptídeos de nó de cistina inibitórios que visam canais NaV de venenos de caramujos-cone ou aranhas. No entanto, o mecanismo pelo qual a excelsatoxina A (ExTxA), o primeiro gympietídeo identificado, exerce seu efeito sobre os canais NaV, e a especificidade dessa interação entre os membros da família de canais NaV, não são conhecidos.
Neste estudo, procuramos investigar os determinantes moleculares subjacentes à atividade desta classe de peptídeos moduladores de NaV. Relatamos que a remoção induzida por ExTxA da inativação rápida das correntes Nav não é observada ao aplicar ExTxA em subunidades α Nav sozinhas ou quando co-expressas com subunidades β. Em vez disso, a atividade da toxina requer a co-expressão de TMEM233, um membro pouco descrito da família das dispaninas que descobrimos ser altamente expresso em neurônios sensoriais, e que pode associar-se ao NaV1.7 para modificar sutilmente as propriedades de inativação. Esses resultados fornecem insights importantes sobre a função dos canais NaV em neurônios sensoriais, identificam o TMEM233 como uma proteína de interação com NaV1.7 anteriormente desconhecida e descrevem as dispaninas como proteínas bifuncionais que causam mudanças alostéricas na abertura do canal após a ligação de peptídeos de veneno causadores de dor.
Resultados
ExTxA inibe a inativação do NaV1.7 em neurônios sensoriais, mas não em sistemas de expressão heteróloga
ExTxA inibe a inativação do NaV1.7 em neurônios e células TE-671.
a Corrente persistente total de NaV em neurônios do DRG após perfusão de controle com tampão (0,1% BSA), ExTxA (100 nM) e ExTxA + TTX (1 μM). ExTxA induz correntes persistentes de NaV que são bloqueadas por TTX. b Registro representativo de um neurônio do DRG mostrando grande corrente persistente sensível a TTX induzida por ExTxA (100 nM). c Alteração na corrente persistente de NaV1.8 (ΔI40 ms/Ipico; pré e pós-perfusão com controle de tampão (0,1% BSA) e ExTxA (100 nM)) em neurônios do DRG de camundongos NaV1.9−/− na presença de TTX (1 μM). ExTxA aumentou ligeiramente as correntes persistentes dos canais NaV1.8. d Correntes normalizadas representativas de NaV1.8 de neurônios do DRG de camundongos NaV1.9−/− tratados com controle de tampão (0,1% BSA) e ExTxA (100 nM). e Alteração na corrente persistente de NaV1.9 (ΔI90 ms/Ipico; pré e pós-perfusão com controle de tampão (0,1% BSA) e ExTxA (1 μM)) em neurônios do DRG de camundongos NaV1.8−/− na presença de TTX (1 μM). ExTxA não afetou as correntes persistentes dos canais NaV1.9. f Correntes normalizadas representativas de NaV1.9 de neurônios do DRG de camundongos NaV1.8−/− tratados com controle de tampão (0,1% BSA) e ExTxA (1 μM). g Efeito do ExTxA (100 nM) na corrente de NaV1.7 em neurônios sensoriais derivados de iPSC humanos. *p < 0,05 (controle vs ExTxA); #p < 0,05 (ExTxA vs ExTxA +Pn3a). h Corrente de NaV representativa em neurônios sensoriais derivados de iPSC humanos mostrando o efeito do ExTxA (100 nM) bem como a inibição pelo bloqueador seletivo de NaV1.7 Pn3a (100 nM) e TTX (1 µM). i Efeito do ExTxA (100 nM) na corrente persistente (I40ms/IPico) em células TE-671 que expressam endogenamente NaV1.7 sensível a Pn3a. j Traços de corrente representativos dos efeitos induzidos por ExTxA em NaV1.7 expresso endogenamente em células TE-671. k Comportamentos nocifensivos (lambidas e contrações cumulativas da pata ao longo de 60 min) induzidos pela injeção intraplantar de ExTxA (10 nM) em controles de tipo selvagem (wt) e camundongos NaV1.7Advill. Os valores de n e informações estatísticas estão detalhados na Tabela Suplementar 1. Os dados de origem estão incluídos como um arquivo de Dados de Origem.
ExTxA, o primeiro membro identificado da família de toxinas de urtiga gympietide, provoca comportamentos de dor espontânea e um reflexo axonal de rubor após administração intraplantar em camundongos, semelhante à sintomatologia experimentada por humanos após picadas de Dendrocnide excelsa ou D. moroides. Em neurônios DRG, um efeito importante do ExTxA é uma inibição acentuada da inativação do NaV, levando a correntes persistentes que provavelmente contribuem para o aumento da excitabilidade e a geração espontânea de potenciais de ação. Mostramos neste estudo que observamos consistentemente esse efeito mediado pelo ExTxA em correntes sensíveis à TTX em neurônios DRG (Fig. 1a, b). Efeitos menores, mas estatisticamente significativos, também foram observados em correntes resistentes à TTX mediadas pelo NaV1.8 (Fig. 1c, d). No entanto, praticamente nenhum efeito foi observado nas correntes persistentes conhecidas por serem mediadas pelo NaV1.9 (Fig. 1e, f). A atividade no NaV1.7, a principal isoforma TTX-s expressa em nociceptores, foi evidenciada pelos efeitos do ExTxA (100 nM) na corrente de NaV em neurônios sensoriais derivados de iPSC humanos, onde a corrente persistente induzida por ExTxA foi amplamente inibida pelo bloqueador seletivo de NaV1.7 Pn3a (100 nM) (Fig. 1g, h). As correntes persistentes sensíveis à TTX induzidas por ExTxA em células de neuroblastoma TE-671 também foram significativamente reduzidas pelo Pn3a, consistente com nossa observação anterior de que as células TE-671 expressam NaV1.7 como o subtipo predominante de NaV sensível à TTX (Fig. 1i, j). Além disso, as respostas nocifensivas induzidas pela injeção intraplantar (i.pl.) de ExTxA (10 nM) foram abolidas em camundongos knockout NaV1.7Advill (Fig. 1k). Isso é consistente com nossa observação anterior de que o Pn3a inibiu as respostas semelhantes à dor induzidas por ExTxA em camundongos, e apoia a evolução das gympietides como agentes defensivos causadores de dor específicos para vertebrados. Para avaliar a atividade do ExTxA em alvos invertebrados, avaliamos os efeitos do ExTxA em Drosophila melanogaster, onde a injeção da toxina (0,5 nmol)—em doses várias vezes maiores do que aquelas que induzem respostas nocifensivas em camundongos—não provocou paralisia (controle 1/25; ExTxA 2/52 após 15 min) ou morte (controle 0/25; ExTxA 1/52 após 2 h), consistente com a falta de atividade inseticida.
ExTxA não inibe a inativação do NaV1.7 sistemas de expressão heteróloga.
a Corrente persistente (I40 ms/Ipico) induzida por ExTxA (1 μM) em células TE-671, células HEK293 expressando estavelmente β1 e hNaV1.1, hNaV1.2, hNaV1.3, hNaV1.4, hNaV1.5, hNaV1.6, hNaV1.7 ou células CHO expressando hNaV1.8/β3, células ND7/23, células F11, células de neuroblastoma SH-SY5Y e oócitos de Xenopus expressando hNaV1.7. b Traçados de corrente normalizados representativos do controle (preto) e tratados com ExTxA (1 μM, colorido) dos dados mostrados em (a). A corrente foi elicitada por um passo despolarizante para −20 mV (−10 mV para oócitos) a partir de um potencial de manutenção de −90 mV. Barra de escala: todos 1 nA, 5 ms, exceto oócitos (1 µA, 5 ms). c Efeito de ExTxA (1 μM) sobre a corrente persistente (I40 ms/Ipico) em células CHO expressando hNaV1.7 com ou sem as subunidades β1, β2, β3 ou β4. d Traçados de corrente representativos do controle (preto) e tratados com ExTxA (1 μM, verde) dos dados mostrados em (c). Inserção: Expressão de GFP confirmando a transfecção bem-sucedida dos plasmídeos de subunidades β IRES-GFP. Barra de escala, 10 µm. Os dados são apresentados como média ± EPM; n.s., não significativo; *,#p < 0,05. Os valores de n e as informações estatísticas estão detalhados na Tabela Suplementar 1. Os dados de origem estão incluídos como um arquivo de Dados de Origem.
Em esforços subsequentes para definir melhor a seletividade de ExTxA em subtipos de canais NaV de mamíferos, ficamos surpresos que o efeito sobre a inativação de NaV observado em neurônios de DRG de camundongo, neurônios sensoriais derivados de iPSC humano e células de neuroblastoma TE-671 (Fig. 1a–k, Fig. 2a) não pôde ser reproduzido em células HEK293 ou CHO expressando estavelmente hNaV1.1–1.8, onde ExTxA (1 µM) não conseguiu induzir correntes persistentes (Fig. 2a, b). ExTxA também não teve efeito sobre hNaV1.7 expresso em oócitos de Xenopus laevis, ou sobre correntes NaV em linhagens celulares neuronais imortalizadas (F11, ND7/23, SH-SY5Y) conhecidas por expressar endogenamente NaV1.7 (Fig. 2a, b). Nós levantamos a hipótese de que a atividade de ExTxA poderia depender de subunidades acessórias de NaV expressas em neurônios de DRG e células TE-671, e avaliamos a atividade do peptídeo em células CHO expressando NaV1.7 e as subunidades NaV β1-β4. No entanto, embora a transfecção bem-sucedida com subunidades β tenha sido confirmada pela presença do marcador de transfecção GFP, ExTxA não afetou a inativação das correntes mediadas por NaV1.7 na presença da subunidade β1, β2, β3 ou β4 (Fig. 2c, d).
TMEM233 é necessário para a inibição induzida por ExTxA da inativação de NaV1.7
a Triagem LentiCRISPR-Cas9 TKOv3 mostrando depleção e enriquecimento de sgRNAs em células TE-671 controle (veratridina, 5 μM; ouabaína, 20 nM) e tratadas com ExTxA (ExTxA, 1 μM; veratridina, 5 μM; ouabaína, 20 nM). b Alteração da fluorescência do corante de potencial de membrana (ΔF/F0) induzida por ExTxA (1 μM) em células HEK293-NaV1.7 co-transfectadas com CRELD1, complexo GPI (GPAA1, PIGU, PIGS, PIGK, PIGT), LMAN2L, MMGT1, RNF121, STT3B e TMEM233. c Correntes persistentes (I40 ms; nA) induzidas por ExTxA (1 μM) em células HEK293-NaV1.7 (controle) e células HEK293-NaV1.7 co-transfectadas com TMEM233 (TMEM233). Painéis à direita, traçados de corrente representativos; despolarização para −20 mV a partir do potencial de manutenção de −90 mV. d Correntes persistentes normalizadas (I40 ms/Ipico) induzidas por ExTxA (1 μM) em células TE-671 do tipo selvagem (wt) e após knockdown de TMEM233 mediado por CRISPR/Cas9 (KO). Painéis à direita, traçados de corrente representativos; despolarização para −20 mV a partir do potencial de manutenção de −90 mV. e Corrente total persistente de NaV normalizada (I40 ms/Ipico) na presença de tampão (0,1% BSA; pré) e após ExTxA (30 nM) em neurônios DRG de camundongos selvagens e knockout Tmem233Cre/Cre. Painéis à direita, traçados de corrente representativos; despolarização para −20 mV a partir do potencial de manutenção de −80 mV. f Porcentagem de neurônios DRG cultivados de camundongos C57BL/6 selvagens (wt) e knockout Tmem233Cre/Cre (KO) ativados por ExTxA (20 nM). g Comportamentos de dor cumulativos (lambidas e contrações da pata ao longo de 40 min) após injeção intraplantar de ExTxA em camundongos C57BL/6 da mesma ninhada (wt) e knockout Tmem233Cre/Cre (KO). Os dados são apresentados como média ± EPM; *p < 0,05. Os valores de n e informações estatísticas estão detalhados na Tabela Suplementar 1. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Para identificar fatores que possam mediar a sensibilidade à ExTxA, em seguida realizamos um rastreamento de knockdown em escala genômica usando lentivírus-CRISPR em células TE-671 (Fig. Suplementar S1a), no qual a ExTxA inibe a inativação do NaV1.7 expresso endogenamente. Embora a exposição apenas à ExTxA (1 µM) não tenha causado toxicidade visível, a co-incubação com concentrações não citotóxicas de veratridina (5 µM) e ouabaína (20 nM) levou à morte celular mediada por ExTxA (1 µM) (Fig. Suplementar S1b). Essa citotoxicidade foi prevenida pelo knockdown de SCN9A (o gene que codifica a subunidade α do NaV1.7) bem como de outros dez genes (RNF121, GPAA1, PIGT, CRELD1, PIGK, STT3B, TMEM233, PIGS, MMGT1 e LMAN2L), e exacerbada pelo knockdown de SPAG5, TMEM161B e NEDD4L (Fig. 3a e Fig. Suplementar S1c). Em contraste, o tratamento apenas com veratridina e ouabaína não levou a qualquer enriquecimento ou depleção de sgRNA (Fig. Suplementar S1d). Além das E3-ubiquitina ligases RNF121 e NEDD4L, que afetam a degradação e a localização de membrana do NaV em vertebrados, nenhum desses genes foi previamente implicado na ligação à toxina ou na afetação da função do NaV. Assim, em seguida avaliamos se a superexpressão de algum desses genes poderia conferir sensibilidade à ExTxA em células HEK293-NaV1.7. De todos os 10 genes identificados em nosso rastreamento com TKOv3 lentivírus-CRISPR, apenas a expressão de TMEM233 conferiu sensibilidade à ExTxA em células HEK293 expressando NaV1.7 em um ensaio de potencial de membrana por fluorescência (Fig. 3b), sugerindo que TMEM233 é necessário para a inibição da inativação do NaV1.7 induzida por ExTxA. De fato, a coexpressão de TMEM233 e NaV1.7 em sistemas de expressão heterólogos recapitulou perfeitamente os efeitos da ExTxA na inativação da corrente de NaV observados em neurônios DRG e células TE-671 (Fig. 3c e Fig. Suplementar S1e, f). A expressão apenas de TMEM233 em células sem correntes de NaV endógenas não resultou em correntes dependentes de voltagem ou induzidas por ExTxA (Fig. Suplementar S1g, h). Além disso, a superexpressão de TMEM233 em células HEK293 expressando de forma estável NaV1.1-NaV1.6 também resultou em correntes persistentes mediadas por ExTxA (Fig. Suplementar S2a–g).
Por outro lado, os efeitos induzidos por ExTxA na inativação do NaV foram abolidos após o knockdown de TMEM233 mediado por CRISPR/Cas9 em células TE-671 (Fig. 3d). Da mesma forma, as correntes persistentes de NaV induzidas por ExTxA foram abrogadas em nociceptores de pequeno diâmetro derivados de camundongos knockout Tmem233Cre/Cre (Fig. 3e). O influxo de Ca2+ induzido pela toxina em neurônios DRG de camundongos KO Tmem233Cre/Cre também foi fortemente reduzido, sugerindo que TMEM233 é de fato importante para a geração de potenciais de ação evocados por ExTxA em neurônios sensoriais (Fig. 3f). Consequentemente, os comportamentos nocifensivos induzidos por ExTxA foram significativamente reduzidos em camundongos KO Tmem233Cre/Cre (Fig. 3g).
Os efeitos da ExTxA no NaV1.7 são mediados por uma interação direta da toxina com TMEM233
ExTxA interage diretamente com TMEM233.
a Porcentagem de células positivas para sinal de fluorescência, determinada por citometria de fluxo, após coloração com ExTxA biotinilada (1 μM) e estreptavidina conjugada com DyLight680 em células HEK293 e HEK293-NaV1.7 não transfectadas ou transfectadas com TMEM233. b Intensidade de fluorescência após coloração com ExTxA conjugada com Alexa488 (1–300 nM) em células HEK293 e HEK293-NaV1.7 transfectadas com mock ou TMEM233. c Imagem de microscopia confocal mostrando sinal de Alexa488-estreptavidina apenas em células que expressam TMEM233 após incubação com ExTxA biotinilada (1 μM). Amarelo: núcleo; magenta: F-actina; verde: ExTxA. Painéis do meio: visão ortogonal. Painéis inferiores: escala de cinza invertida do sinal de ExTxA. Barra de escala, 10 μm. Imagem representativa de 3 experimentos independentes. d Corrente persistente normalizada (I40 ms/Ipico), induzida por ExTxA (100 nM) na solução extracelular (ECS) ou solução intracelular (ICS), em células HEK293-NaV1.7 co-transfectadas com TMEM233. e Imagem de microscopia confocal mostrando imunofluorescência anti-HA em células HEK293 não permeabilizadas (superfície) ou permeabilizadas transfectadas com TMEM233 marcado com HA na extremidade C-terminal ou N-terminal. Azul, anti-HA; amarelo, núcleo. Barra de escala, 10 μm. f Porcentagem de células positivas para sinal de fluorescência, determinada por citometria de fluxo, de células HEK293 permeabilizadas ou não permeabilizadas transfectadas com TMEM233 marcado com HA na extremidade C-terminal ou N-terminal após coloração com anticorpo anti-HA. g Curvas de concentração-resposta das correntes persistentes normalizadas (I40 ms/Ipico) induzidas por ExTxA em células HEK293-NaV1.7 co-transfectadas com TMEM233, PRRT2 ou TRARG1. Os dados são apresentados como média ± EPM; *p < 0,05. Os valores de n e as informações estatísticas estão detalhados na Tabela Suplementar 1. Os dados de origem estão incluídos como um arquivo de Dados de Origem.
Em seguida, avaliamos a ligação do ExTxA marcado com biotina no terminal N ou com Alexa488, que manteve atividade funcional (Fig. Suplementar S3a–c), ao NaV1.7 e ao TMEM233. A análise por citometria de fluxo de células tratadas com biotina-ExTxA mostrou um sinal significativamente aumentado em células HEK293 que expressam TMEM233, mas não em células HEK293-NaV1.7 em comparação ao controle, sugerindo que o ExTxA se liga diretamente ao TMEM233 (Fig. 4a e Fig. Suplementar S3d). Da mesma forma, sinais de fluorescência do ExTxA marcado com Alexa488 foram observados apenas em células que expressam TMEM233, com a EC50 da ligação da toxina a células coexpressando NaV1.7/TMEM233 (EC50 125,9 ± 19,2 nM, n = 3) sendo comparável à potência funcional na inativação do NaV1.7 nas mesmas células (EC50 80,9 ± 29,1 nM, n = 7) (Fig. 4b e Fig. Suplementar S3c). A ligação do ExTxA biotinilado ao TMEM233 também foi confirmada por microscopia confocal, que mostrou marcação pontual da toxina predominantemente na superfície celular (Fig. 4c). Além disso, em experimentos de eletrofisiologia, o ExTxA incluído na solução intracelular (ICS) não afetou a inativação do NaV1.7 coexpresso com TMEM233, enquanto a toxina na solução extracelular (ECS) inibiu robustamente a inativação (Fig. 4d). Assim, o ExTxA parece interagir com o TMEM233 pelo lado extracelular, o que também é apoiado pela nossa observação de que o ExTxA se associa a micelas de dodecilfosfocolina (Fig. Suplementar S4a). Além dos efeitos profundos na inativação do NaV1.7, a exposição extracelular ao ExTxA também resultou em um pronunciado desvio hiperpolarizante (11,6 mV) na dependência de voltagem da ativação, um forte desvio despolarizante (18,0 mV) na dependência de voltagem da inativação rápida, uma diminuição nas constantes de tempo de recuperação da inativação e um aumento das correntes induzidas por rampas lentas de voltagem (Fig. Suplementar S4b–g), consistente com o efeito excitatório do ExTxA em nociceptores.
TMEM233 é um membro da família das dispaninas, com a maior similaridade a PRRT2 e TRARG1 (anteriormente conhecido como TUSC5). Embora originalmente se tenha previsto que TMEM233 compreendesse duas hélices transmembrana e terminais N e C extracelulares, os parálogos PRRT2 e TRARG1 foram recentemente confirmados como adotando uma topologia transmembrana simples. Especificamente, nesses membros da subfamília B de dispaninas, o domínio N-terminal é localizado intracelularmente e é seguido por um segmento hidrofóbico central que forma uma alça de reentrada na membrana, e outro segmento que atravessa a membrana, posicionando o curto C-terminal extracelularmente. Procuramos determinar a topologia de membrana do TMEM233 e geramos construções marcadas com HA nas terminações C e N. Experimentos de imunofluorescência (Fig. 4e) e citometria de fluxo (Fig. 4f) em células permeabilizadas e não permeabilizadas demonstraram que, de forma semelhante a PRRT2 e TRARG1, o TMEM233 também possui um C-terminal extracelular e um N-terminal intracelular (Fig. 4e, f; Fig. Suplementar S4h). Com base na sequência semelhante (Fig. Suplementar S4i) e na topologia, ficamos curiosos se a coexpressão de PRRT2 ou TRARG1 poderia sensibilizar o NaV1.7 ao ExTxA. De fato, a coexpressão de PRRT2 ou TRARG1 com NaV1.7 resultou em correntes persistentes induzidas por ExTxA, embora a toxina tenha sido significativamente mais potente quando coexpressa com TMEM233 (Fig. 4g e Fig. Suplementar S4j–l).
TMEM233 associa-se ao NaV1.7
TMEM233 é expresso em neurônios do gânglio da raiz dorsal e pode se associar ao NaV1.7.
a Expressão de tdTomato (vermelho) e RNA Nefh, detectada por análise RNAscope (TS405, azul), em DRGs lombares isolados de camundongos Tmem233Cre/Rosa-CAG-flox-stop-tdTomato adultos. Inset, imagem representativa de secção de DRG usada para análise, de 4 experimentos independentes. Barra de escala, 200 μm. b
Expressão e localização do RNA de Tmem233 e Scn9a em seções congeladas frescas de DRGs de camundongo determinadas por análise de RNAscope. A localização do mRNA de Tmem233 (verde, AF488) foi comparada ao mRNA de Nefh (vermelho, Opal570) e ao mRNA de Scn9a (infravermelho distante, Opal650, mostrado em magenta). Setas, neurônios expressando tanto Tmem233 quanto Scn9a, resultando em sobreposição de cor branca no sinal. Barra de escala, 100 μm. Imagem representativa de 2 experimentos independentes. c Gel de SDS-PAGE do complexo NaV1.7-TMEM233 purificado. CBB (coloração de azul brilhante de Coomassie), fluorescência de GFP (proteína fluorescente verde) e fluorescência de mCherry do mesmo gel de SDS-PAGE. As setas verde e vermelha indicam as bandas de NaV1.7-GFP e mCherry-TMEM233, respectivamente. PM, marcador de peso molecular (kDa). d Perfil de cromatografia de exclusão por tamanho normalizado do complexo NaV1.7-TMEM233 purificado. Sinais de proteína total (preto), GFP (verde) e mCherry (vermelho) foram detectados simultaneamente. e Esquerda: Quantificação do sinal de ensaio de ligação por proximidade em células HEK293 GFP-positivas transfectadas com GFP, bem como com hNaV1.7 marcado com FLAG no N-terminal e TMEM233 marcado com HA no N-terminal, sozinhos ou em combinação. Direita: Imagens representativas mostrando núcleos (DAPI, azul), GFP (verde) e sinal de ligação por proximidade (canal vermelho, visão ampliada no recorte mostrada em escala de cinza para clareza). Barra de escala, 10 μm. Os dados são apresentados como média ± EPM; *, p < 0,05. Os valores de n e informações estatísticas estão detalhados na Tabela Suplementar 1. Os dados de origem estão incluídos em um arquivo de Dados de Origem.
Nossos dados indicam que os efeitos da ExTxA na função do NaV são mediados por uma interação direta da toxina com TMEM233, implicando que TMEM233 está localizado próximo ao NaV1.7 nos neurônios e representa uma proteína de interação. Embora nenhum papel funcional para TMEM233 tenha sido descrito anteriormente, TMEM233 é notável por seu padrão de expressão específico do subtipo de DRG, com sequenciamento de célula única sugerindo que a expressão é restrita a nociceptores. Usando uma linhagem de camundongos Tmem233 Cre-knockin cruzada com uma linhagem repórter CAG-floxed stop tdTomato, na qual tdTomato é expresso sob os elementos reguladores de Tmem233, descobrimos que neurônios de DRG de pequeno diâmetro, predominantemente negativos para Nefh (cadeia pesada de neurofilamento), expressavam tdTomato (Fig. 5a e inserção). Além disso, a Hibridização In Situ RNAscope (ISH) confirmou a coexpressão de ambos Tmem233 e Scn9a por alguns neurônios, enquanto neurônios grandes expressando mRNA de Nefh mostraram colocalização limitada de sinal com mRNAs de Scn9a ou Tmem233 (Fig. 5b). Como os efeitos induzidos por ExTxA no NaV1.7 sugerem uma interação funcional entre NaV1.7 e TMEM233, avaliamos em seguida se as duas proteínas podem se associar na ausência da toxina. Quando coexpressas com NaV1.7 marcado com GFP e Twin-Strep, TMEM233 marcado na extremidade N-terminal com mCherry pôde de fato ser copurificado junto com NaV1.7, sugerindo que NaV1.7 e TMEM233 podem formar um complexo (Fig. 5c, d). Além disso, utilizando ensaios de ligação por proximidade, observamos amplificação de sinal apenas em células coexpressando NaV1.7 marcado na extremidade N-terminal com FLAG e TMEM233 marcado na extremidade N-terminal com HA, indicando que as duas proteínas estão presentes em proximidade uma da outra (Fig. 5e).
A coexpressão de TMEM233 afeta a inativação rápida e lenta do NaV1.7
Efeitos de TMEM233 na função do NaV1.7.
a Relação corrente-tensão e (b) família de traços de amostra do hNaV1.7 (n = 6) co-expresso com TMEM233 (n = 11) em células HEK293. c Curvas sobrepostas de condutância-tensão (G–V, quadrados) e inativação rápida de estado estacionário (círculos), de células HEK293-NaV1.7 transfectadas com mock (controle, amarelo) e com TMEM233 (azul-petróleo). d V50 de ativação e (e) V50 de inativação de células HEK293-NaV1.7 transfectadas com mock e com TMEM233. f Dependência de tensão da inativação lenta e (g) V50 da inativação lenta em células HEK293-NaV1.7 transfectadas com mock e com TMEM233. h Dependência temporal e (i) constante de tempo τ1 de recuperação da inativação rápida em células HEK293-NaV1.7 transfectadas com mock e com TMEM233. j Correntes de pico (Imax, nA) e (k) traços representativos de correntes eliciadas por despolarizações lentas em rampa (−100 mV a +20 mV a 1 mV/s) em células HEK293-NaV1.7 controle e transfectadas com TMEM233. l Correntes de pico da última despolarização (30º pulso), normalizadas em relação ao primeiro pulso, de células HEK293-NaV1.7 controle e transfectadas com TMEM233 nas frequências de pulso de 1, 2, 5, 10 e 20 Hz. m Esquerda: Constante de tempo τ1 de recuperação da inativação rápida em células HEK293-NaV1.7 que foram transfectadas com mock (controle), transfectadas com TMEM233 de comprimento total (TMEM233) ou com TMEM233 truncado na extremidade N-terminal, sem os resíduos 1–34 (del. 1–34). Direita: Constante de tempo τ1 de recuperação da inativação rápida em células HEK293-NaV1.7 com controle de tampão (BSA 0,1%) ou peptídeo N-terminal sintético de TMEM233 (100 μM) na solução intracelular (ICS). Os dados são apresentados como média ± EPM; n.s., não significativo; *p < 0,05. Os valores de n e as informações estatísticas estão detalhados na Tabela Suplementar 1. Os dados de origem estão incluídos em um arquivo de Dados de Origem.
Como os efeitos induzidos por ExTxA no NaV1.7 sugerem uma interação funcional entre NaV1.7 e TMEM233, avaliamos em seguida os efeitos da coexpressão de TMEM233 nas propriedades biofísicas do NaV1.7. Em comparação com células HEK293-NaV1.7 transfectadas com mock, a coexpressão de TMEM233 teve efeitos menores, embora estatisticamente significativos, na dependência de voltagem da inativação rápida (−3,9 mV), mas nenhum efeito na dependência de voltagem da ativação (Fig. 6a–e). Pequenos efeitos na dependência de voltagem da inativação lenta (−5,5 mV; Fig. 6f, g), bem como na constante de tempo de recuperação da inativação rápida (Fig. 6h, i), também foram observados. Dados esses efeitos nos parâmetros de inativação, testamos em seguida se TMEM233 também poderia afetar as correntes de rampa mediadas por NaV1.7 ou a dependência de uso do NaV1.7. No entanto, a coexpressão de TMEM233 não afetou as correntes de rampa, e apenas efeitos menores na dependência de uso foram observados na frequência testada mais alta (20 Hz) (Fig. 6j–l). A coexpressão de TMEM233 também teve efeitos menores semelhantes na função do NaV1.7 em oócitos de Xenopus, mais notavelmente um efeito pequeno, porém significativo, na recuperação da inativação rápida e um pequeno deslocamento na dependência de voltagem da inativação lenta (Fig. Suplementar S5a–e). Hipotetizamos que esses efeitos podem ser mediados pelo domínio N-terminal intracelular de TMEM233 e avaliamos os efeitos de um mutante de TMEM233 truncado em N-terminal na recuperação da inativação rápida. De fato, a coexpressão de NaV1.7 com TMEM233 sem os primeiros 34 resíduos N-terminais não afetou mais a recuperação da inativação rápida (Fig. 6m), embora ExTxA ainda fosse capaz de inibir a inativação rápida (Fig. Suplementar S5f). Por outro lado, a inclusão de um peptídeo sintético correspondente ao N-terminal de TMEM233 na solução intracelular em células HEK293-NaV1.7 recapitulou os efeitos observados com a coexpressão de TMEM233 de comprimento total na recuperação da inativação rápida de NaV1.7, sugerindo que esse efeito é mediado por interações com o N-terminal de TMEM233 (Fig. 6m). Em conjunto, nossos dados indicam que TMEM233 é uma proteína de interação com NaV1.7 anteriormente desconhecida, alvo de peptídeos de veneno causadores de dor de urtigas australianas, fornecendo insights sobre o interactoma de NaV1.7 que, em última análise, podem ser passíveis de modulação farmacológica ou por terapia gênica para benefício terapêutico.
Discussão
As gimpietídeos são uma nova classe de toxinas peptídicas direcionadas a NaV, notáveis por várias propriedades distintas, incluindo uma estrutura primária única que não compartilha similaridade significativa com sequências conhecidas, exceto com albuminas de origem vegetal em aproximadamente 50% de identidade. A estrutura terciária desta família de peptídeos, estabilizada por três pontes dissulfeto intramoleculares em um motivo de nó de cisteína inibitório, faz dos gimpietídeos moduladores de NaV "knottin" derivados de plantas e destaca um caso notável de evolução convergente entre venenos animais e vegetais algésicos.
Entretanto, talvez a característica mais intrigante das gimpietídeas seja seu mecanismo de ação, notadamente nossa observação de que a ExTxA praticamente não tem efeito sobre a função do NaV1.7 em sistemas de expressão heteróloga e em neurônios que não expressam TMEM233, uma proteína transmembrana com função até então indefinida. Embora o sítio de ligação exato da toxina na TMEM233 ainda precise ser determinado, é provável que a ExTxA hidrofóbica, que demonstramos se ligar a membranas modelo, interaja com resíduos extracelulares ou intramembrana que podem incluir aminoácidos hidrofóbicos na alça de reentrância prevista da TMEM233. Um bolsão de ligação enterrado na membrana também pode explicar os efeitos quase irreversíveis da ExTxA sobre a função do NaV e, por sua vez, os efeitos biológicos extremamente duradouros das picadas de Dendrocnide, que incluem alodinia e crises dolorosas que podem, por exemplo, ser desencadeadas pelo ato de coçar o local da picada por semanas ou até meses após o envenenamento. É provável que a interação TMEM233-ExTxA sirva para potencializar um efeito tóxico de baixa afinidade sobre o NaV1.7, embora a base molecular dessa interação ainda precise ser determinada. Assim, a TMEM233 parece atuar como uma molécula bifuncional que se liga à ExTxA por meio do terminal C extracelular ou dos resíduos transmembrana, e ao NaV1.7 por meio de pelo menos o módulo citoplasmático, incluindo o terminal N, para produzir um efeito alostérico na abertura do canal após a ligação do peptídeo tóxico.
Estudos de alinhamento de sequências e análise filogenética caracterizaram a TMEM233 como um membro das dispaninas, especificamente da subfamília B, sendo os dois membros mais próximos, PRRT2 e TRARG1 (anteriormente conhecido como TUSC5), notáveis por seus domínios N-terminais substancialmente maiores. As semelhanças limitadas das sequências da subfamília B de dispaninas nessa região, juntamente com nossa observação de que a ExTxA também modula a função do NaV1.7 quando coexpressa com PRRT2 ou TRARG1, fornece mais suporte à hipótese de que a ExTxA interage com resíduos extracelulares ou intramembrana na parte C-terminal mais conservada dessas proteínas. Embora os motivos precisos envolvidos na interação tripartite toxina-TMEM233-NaV1.7 ainda precisem ser determinados, os efeitos profundos da ExTxA sobre os parâmetros de inativação em particular sugerem que o domínio IV do NaV1.7 provavelmente está envolvido nesse processo.
O TMEM233 é notável por sua expressão em nociceptores, motivando a geração de um camundongo Tmem233Cre no qual a expressão de Cre está sob o controle de elementos reguladores do Tmem233, sendo os homozigotos knockouts do gene Tmem233. Consequentemente, os comportamentos de dor induzidos por toxinas foram significativamente reduzidos em animais knockout Tmem233Cre/Cre, com respostas nocifensivas residuais provavelmente explicadas pela expressão e atividade do ExTxA em Prrt2 e Trarg1 em populações neuronais sobrepostas. De fato, o TRARG1 é expresso em altos níveis no DRG humano e de camundongo, bem como em neurônios sensoriais de zebrafish. Embora as ligações com doenças humanas, em particular condições dolorosas, ainda não tenham sido estabelecidas para o TMEM233, é interessante notar que várias mutações de perda de função do PRRT2 foram associadas a múltiplas doenças neurológicas, incluindo discinesias paroxísticas, epilepsia infantil familiar benigna e enxaqueca hemiplégica. Sabe-se que o PRRT2 interage com várias proteínas de vesículas sinápticas envolvidas na liberação de neurotransmissores, bem como com o subtipo de Ca2+ dependente de voltagem CaV2.1, o que pode contribuir para fenótipos de doenças humanas associados a mutações no PRRT2. Consistente com efeitos apenas menores ou inexistentes da coexpressão do TMEM233 na função do NaV1.7, as respostas nociceptivas mecânicas, ao calor e ao frio não foram alteradas nos animais knockout Tmem233Cre/Cre, embora contribuições adicionais para estados de dor patológica não possam ser descartadas atualmente.
Nossos dados sugerem que, em sistemas heterólogos, o TMEM233 pode se associar ao NaV1.7. Devido à falta de anticorpos de bom desempenho, atualmente não é possível confirmar diretamente essa interação em neurônios nativos, embora seja fortemente sugerida pelos efeitos induzidos pelo ExTxA no NaV1.7 em neurônios do DRG e neurônios sensoriais humanos derivados de iPSC. De fato, o TRARG1 foi previamente identificado como uma proteína de interação com o NaV1.7, provavelmente devido à expressão ubíqua do TRARG1 em neurônios sensoriais. Essas observações sugerem que o TMEM233 provavelmente faz parte de um complexo de sinalização nativo do NaV em neurônios sensoriais, com base em nossas observações de que ele não funciona como um canal iônico por si só, mas que a coexpressão com o NaV1.7 confere sensibilidade a peptídeos knottin algésicos derivados de plantas.
Os canais NaV são conhecidos por funcionar como complexos de múltiplas subunidades em neurônios nativos, onde se associam não apenas com subunidades β auxiliares, mas também com várias outras proteínas que podem afetar modificações pós-traducionais, expressão, tráfego e função dos canais. As subunidades β são conhecidas por modular a interação de diversos peptídeos derivados de venenos com a subunidade α formadora de poro do NaV; por exemplo, a cinética de inibição por μ-conotoxinas é afetada pela presença de subunidades β, enquanto a coexpressão de β2 ou β4 impede a inibição pela μO§-conotoxina GVIIJ. No entanto, todas as toxinas direcionadas ao NaV estudadas anteriormente parecem se ligar à subunidade α, tornando as gimpietidas toxinas que requerem uma proteína de interação para modular a função do canal NaV. Além disso, as gimpietidas também são ligantes de dispaninas, levantando a possibilidade de desenvolvimento futuro de ligantes seletivos que possam ser usados como compostos ferramenta para investigar a função dessa família de proteínas, ou que possam, em última análise, levar a aplicações terapêuticas. Finalmente, nosso estudo relata uma associação com NaV1.7—um importante ator na sinalização periférica da dor—e uma função do TMEM233, fornecendo um impulso convincente para estudos adicionais dessa intrigante proteína transmembrana e seus parálogos.
Métodos
Síntese e purificação de peptídeos
Os precursores dos peptídeos ExTxA e Pn3a foram montados via síntese de peptídeos em fase sólida com fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) em um sintetizador automatizado de micro-ondas Liberty Prime (CEM) usando resina Fmoc-Wang (LL) pré-carregada (CEM, 0,31 mmol/g, escala de 0,1 mmol). Os acoplamentos de aminoácidos foram realizados em dimetilformamida (DMF) usando 5 equivalentes (eq) de aminoácido protegido com Fmoc/5 eq de Oxyma/10 eq de N,N′-diisopropilcarbodiimida, em relação à substituição da resina, por 1 min a 105 °C. A remoção do grupo protetor Fmoc foi realizada usando pirrolidina (25% v/v em DMF, 40 s a 100 °C). A clivagem e remoção simultânea dos grupos protetores das cadeias laterais foram realizadas por tratamento com 92,5% de ácido trifluoroacético (TFA)/2,5% de triisopropilsilano/2,5% de H2O/5% de 2,2′-(etilenodioxi)dietanotiol por 2 h à temperatura ambiente. O TFA foi evaporado por fluxo de N2, seguido de precipitação do peptídeo em éter dietílico frio e liofilização em 0,1% de TFA/50% de acetonitrila (ACN)/H2O.
Dobramento oxidativo
ExTxA linear e análogos foram dissolvidos em um volume mínimo de ACN aquosa, depois diluídos para uma concentração de peptídeo de 0,25 mg/mL com 0,1 M de NH4HCO3/ tampão iPro 50% (pH 8) contendo 100 eq de GSH/ 10 eq de GSSG e agitados por 24 h à temperatura ambiente. A reação foi interrompida adicionando 1% de TFA/ H2O até pH 5, e o peptídeo enovelado corretamente foi isolado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Pn3a foi oxidado a 0,1 mg/mL em 4,5 M de NH4OAc a pH 8 com 2 M de ureia, e 1:10 de glutationa oxidada para reduzida (48 h a 4 °C). As soluções de oxidação foram acidificadas a pH <4 com TFA, filtradas e purificadas por RP-HPLC. A pureza e a massa correta foram confirmadas por RP-HPLC e ESI-MS em conjunto com ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H 1D e 2D, respectivamente.60% solvente B; 10–11 min, 60–96% solvente B; 11–13 min, a 96% solvente B; e 13,10–20 min, 2% solvente B. O solvente A é 0,1% de ácido fórmico em H2O e o solvente B é ACN aquoso com 0,1% de ácido fórmico.
Química click
[K(N3)]ExTxA enovelado (450 µM) e fluor 488 alquino (BroadPharm, 670 µM) foram dissolvidos em 50 mM de fosfato de potássio/ 30% de DMSO (pH 7) contendo 500 µM de CuSO4, 500 µM de tris-hidroxipropiltriazolilmetilamina, 5 mM de aminoguanidina e 5 mM de ascorbato de sódio e deixados reagir a 37 °C por 1 h. A reação foi interrompida com TFA 1% v/v e purificada por HPLC.
Biotinilação
ExTxA enovelado (870 µM) e biotina-PEG4-NHS (BroadPharm, 8700 µM) foram primeiro dissolvidos em DMSO mínimo e depois diluídos com NaHCO3 (100 mM, pH 7) e deixados reagir a 37 °C por 1 h. A reação foi interrompida com TFA 1% v/v e purificada por HPLC.
Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC)
A HPLC preparativa e analítica foi realizada em um sistema Shimadzu LC-20AT equipado com detector UV/VIS SPD-20A Prominence, um auto-injetor SIL-20AHT. Uma coluna Eclipse XDB – C18 (Agilent; 5 μm, 9,4 cm × 250 mm, 300 Å, fluxo de 5 mL/min) com gradiente de 45–75% do solvente B em 60 min foi usada para purificar os peptídeos oxidados. Uma coluna Zorbax 300SB – C18 (Agilent; 5 μm, 4,6 cm × 250 mm, 300 Å, fluxo de 1 mL/min) com gradiente de 45–75% do solvente B em 60 min foi usada para purificar peptídeos marcados. Uma coluna Hypersil GOLD – C18 (ThermoFisher; 3 μm, 2,1 × 100 mm, 175 Å, fluxo de 0,7 mL/min) com gradiente de 0–80% B em 16 min foi usada para monitorar a oxidação e a ligação, e para analisar a pureza dos peptídeos. A absorbância foi monitorada a 214 nm e 280 nm. Solvente A: 0,05% de TFA em H2O; solvente B: 90% de ACN/ 0,043% de TFA em H2O.
Espectrometria de massas (MS)
Um espectrômetro de massa Q-Star Elite (Applied Biosystems, MDS SCIEX) equipado com bomba Shimadzu LC-20AB e um auto-injetor SIL-20ACHT foi usado para análise de massa. Amostras (50 µg) foram dissolvidas em ACN aquoso a 50% (100 µL), então 5 µL das amostras foram injetados no espectrômetro para análise pelo Analyst QS Software 2.0. Uma coluna Zorbax 300SB – C18 (Agilent; 3,5 µm, 2,1 × 100 mm, 300 Å, taxa de fluxo 0,25 mL/min) foi usada para processar todas as amostras. A faixa de massa do TOF foi ajustada para 500–1800 Da. O programa de gradiente foi o seguinte: 0–0,5 min, 2% solvente B; 0,5–10 min, 2
Expressão recombinante de ExTxA marcada com 15N e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)
Células competentes de E. coli SHuffle® T7 (New England Biolabs, Massachusetts, EUA) foram transformadas com um vetor de expressão codificando uma etiqueta de solubilidade 6xHis/SUMO e ExTxA. As células transformadas foram cultivadas em Caldo de Lisogenia (LB) suplementado com ampicilina a 30 °C até OD600 = 0,8–1,2. As células foram então transferidas para meio mínimo M9 marcado com 15N contendo 90,2 mM de Na2HPO4, 22,0 mM de KH2PO4, 17,1 mM de NaCl, 2 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl2, solução vitamínica BME 1x (Sigma-Aldrich, Missouri, EUA), 1% (p/v) de glicose, 18,7 mM de 15NH4Cl e 100 µg/mL de ampicilina antes da indução com 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e incubadas a 30 °C por 3 h. As células foram sedimentadas a 5000 × g por 10 min e lisadas por ultrassonicação em tampão contendo 40 mM de Tris pH 8, 400 mM de NaCl e 0,1 mg/mL de lisozima. Os debris celulares foram removidos por centrifugação a 40.000 × g por 30 min a 4 °C. A fusão recombinante His6-SUMO-ExTxA foi isolada usando resinas Ni-NTA (Cytiva, Massachusetts, EUA) e clivada pela adição de 400 µg/mL de protease SUMO e 2 mM de ditiotreitol (DTT). O peptídeo clivado foi então purificado por CLAE em fase reversa em uma coluna semipreparativa C3 Agilent Zorbax (Agilent, Califórnia, EUA). O peptídeo foi então liofilizado, dissolvido em 6 M de cloridrato de guanidina e diluído 20 vezes com tampão de enovelamento contendo 200 mM de bicarbonato de amônio pH 8,2, 55% de isopropanol, 5 mM de GSH e 0,5 mM de GSSG e deixado sob agitação durante a noite à temperatura ambiente. O peptídeo renaturado foi então purificado por CLAE em fase reversa usando uma coluna analítica C18 Phenomenex Jupiter (Phenomenex, Califórnia, EUA).
Para análise de RMN, o ExTxA marcado com 15N liofilizado foi ressuspenso em 40% de acetonitrila deuterada ou tampão contendo 20 mM de Tris pH 8, 50 mM de NaCl, 10% (p/v) de dodecilfosfocolina (DPC) e 5% de D2O. Espectros de espectroscopia otimizada por relaxação transversal 1H-15N (TROSY) foram adquiridos para as amostras de peptídeo (30 µM) em um espectrômetro de RMN Bruker Avance 900 MHz equipado com uma sonda criogênica de tripla ressonância a 298 K. Os espectros foram processados usando o software TOPSPIN v4.1.4 (Bruker, Massachusetts, EUA).
Animais e aprovações éticas
Todos os experimentos envolvendo animais foram revisados e aprovados pelos comitês locais de ética em experimentação animal (US Veterans Affairs West Haven Medical Center Animal Care and Use Committee; University of Queensland Molecular Bioscience Animal Ethics Committee; King’s College London Animal Welfare and Ethical Review Body; University College London Animal Welfare and Ethical Review Body) e conduzidos em conformidade com as regulamentações nacionais e internacionais relevantes (International Association for the Study of Pain Guidelines for the Use of Animals in Research; o Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes, 8ª edição (2013); UK Home Office Project Licence). Camundongos C57BL/6 para experimentos in vivo ou coleta de tecidos foram obtidos do Animal Resource Centre (Canning Vale, Austrália Ocidental, Austrália) ou de colônias de reprodução locais. Animais de ambos os sexos foram utilizados. Os experimentos não foram projetados ou dimensionados para detectar diferenças específicas entre sexos. Os animais foram alojados em grupos de três ou quatro por gaiola sob ciclos claro-escuro de 12 horas e receberam ração padrão para roedores e água ad libitum.
Animais Tmem233Cre foram gerados e genotipados conforme descrito anteriormente, com um cassete Kozak-Cre-pA substituindo o códon de início ATG do gene Tmem233 murino para produzir um knockout funcional em animais homozigotos. Camundongos NaV1.7Advill sem NaV1.7 funcional em todos os neurônios sensoriais foram gerados e genotipados conforme descrito anteriormente, cruzando camundongos Advillin-Cre com animais Scn9a floxados, nos quais sítios loxP foram inseridos nos íntrons que flanqueiam os éxons 14 e 15. Camundongos NaV1.9−/− e camundongos NaV1.8Cre/Cre, nos quais a Cre recombinase substitui o sítio de início da tradução do NaV1.8, foram gerados e sequenciados conforme descrito anteriormente.
X. laevis foram adquiridos da ENASCO, Fort Atkinson, WI 53538-0901, EUA. As cirurgias em ovócitos de X. laevis foram revisadas e aprovadas pelo grupo de Biociências Anatômicas do Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (QBI/AIBN/087/16/NHMRC/ARC) e conduzidas de acordo com as regulamentações de quarentena australianas.
Isolamento e cultura de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG)
DRG de todos os níveis espinhais foram isolados de camundongos machos e fêmeas (C57BL/6 J selvagem, Tmem233Cre/Cre, NaV1.8Cre/Cre, NaV1.9−/− ou controles da mesma ninhada) conforme descrito anteriormente. Para experimentos de imageamento de Ca2+, os neurônios do DRG foram dissociados após incubação com colagenase tipo IV a 1% (Worthington, Nova Jersey, EUA) por 1,5 h (37 °C, 5% CO2) e tripsina a 2,5% (Sigma-Aldrich, Montana, EUA) por 15 min e ressuspensos em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, Nova Gales do Sul, Austrália) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Thermofisher, Massachusetts, EUA) e penicilina/estreptomicina (Thermofisher, Massachusetts, EUA). Após a semeadura em placas de cultura de 96 poços revestidas com poli-d-lisina, os neurônios isolados foram incubados por 24 h a 37 °C com 5% de CO2 antes do imageamento.
Para experimentos de patch clamp manual em neurônios de DRG de camundongos Tmem233Cre/Cre, DRGs isolados de camundongos homozigotos Tmem233Cre/Cre machos e fêmeas e controles da mesma ninhada foram colocados em colagenase tipo IV 2,5% (Worthington, New Jersey, EUA) por 3 h (37 °C, 5% CO2). O DRG inteiro foi então exposto a 0,25% de Tripsina (Sigma-Aldrich) por 15 min antes da trituração com uma pipeta Pasteur de vidro polida à chama. A suspensão celular foi triturada e observada ao microscópio até que os gânglios inteiros fossem reduzidos a células individuais. A suspensão de células individuais foi então tratada brevemente com 0,05% de DNase (Worthington) e passada (1000 rpm) através de um colchão de albumina sérica bovina (15% p/v) em Meio Essencial Mínimo (MEM) para remover detritos. Lamínulas de vidro borossilicato pré-revestidas com poli-D-lisina (PDL) e laminina (Corning, NY, EUA) foram usadas para plaquear os neurônios individuais de DRG isolados, que foram deixados para aderir por >90 min. Finalmente, as lamínulas foram inundadas com MEM 10% SBF, 10 μM de citosina arabinosídeo, 1% v/v de penicilina e estreptomicina, 50 ng/mL de NGF (Promega, Southampton, Reino Unido) e 50 ng/mL de GDNF (Promega). As culturas de DRG foram usadas no dia seguinte (~16–30 h após o isolamento) para registros de célula inteira.
Para experimentos de patch clamp manual em neurônios de DRG de camundongos NaV1.8Cre/Cre e NaV1.9−/−, os DRGs foram incubados em 0,5 U/mL de Liberase TM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 0,6 mM de EDTA por 20 min a 37 °C, seguido por uma incubação de 15 min a 37 °C em 0,5 U/mL de Liberase TL (Sigma-Aldrich), 0,6 mM de EDTA e 30 U/mL de papaína (Worthington Biochemical, Lakewood NJ). Após coleta por centrifugação, os DRGs foram triturados em meio de Eagle modificado por Dulbecco/F12 (1:1) com 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY) e 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), contendo 1,5 mg/mL de albumina sérica bovina (baixo endotoxina; Sigma-Aldrich) e 1,5 mg/mL de inibidor de tripsina (Sigma-Aldrich). A suspensão de células individuais foi então plaqueada em meio de DRG contendo 1,5 mg/mL de albumina sérica bovina (baixo endotoxina; Sigma-Aldrich) e 1,5 mg/mL de inibidor de tripsina (Sigma-Aldrich) em lamínulas revestidas com poli-D-lisina/laminina (Corning, Discovery Labware, Bedford, MA).
Linhagens celulares e cultura
As linhagens celulares foram obtidas de fornecedores comerciais e não foram autenticadas.
Células TE-671
Células TE-671 (CRL-8805; European Collection of Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Reino Unido) foram cultivadas em MEM suplementado com 10% (v/v) de SBF e 2 mM de L-glutamina (Thermofisher, Massachusetts, EUA).
Células HEK293
Células Embrionárias Humanas de Rim (HEK) 293 (85120602; American Tissue Culture Collection, Manassas, VA, EUA) utilizadas para transfectações transientes foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), L-glutamina (2 mM), piridoxina e piruvato de sódio (110 mg/mL). As células foram divididas a cada 4–6 dias usando TrypLE Express (Invitrogen, Massachusetts, EUA) e cultivadas em incubadora a 37 °C/5% CO2. Para transfectação transiente dos construtos de NaV1.7, foram utilizadas células HEK293 expressando de forma estável as subunidades β1 e β2 sob seleção com G418.
Células HEK293-NaV1.1, HEK293-NaV1.2, HEK293-NaV1.3, HEK293-NaV1.4, HEK293-NaV1.5, HEK293-NaV1.6, HEK293-NaV1.7, CHO-NaV1.7 e CHO-NaV1.8 estáveis.
Células HEK293 expressando de forma estável hNaV1.1/β1 – hNaV1.7/β1 (SB Drug Discovery, Glasgow, Reino Unido) foram mantidas em MEM suplementado com 10% (v/v) de SFB, L-glutamina (2 mM) e antibióticos de seleção (geneticina (600 µg/mL, Sigma-Aldrich, Missouri, EUA) e blasticidina (4 µg/mL, Thermofisher, Massachusetts, EUA)) para todas, exceto as células HEK293-hNaV1.4, que foram cultivadas em meio adicionalmente contendo zeocina (500 µg/mL, Thermofisher, Massachusetts, EUA). Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) expressando de forma estável hNaV1.7 na ausência de subunidades β (ChanTest, Ohio, EUA) e células CHO expressando de forma estável hNaV1.8/β3 induzível por tetraciclina (ChanTest, Ohio, EUA) sob seleção com higromicina e zeocina foram cultivadas em MEM adicionalmente suplementado com 10% (v/v) de SFB e 2 mM de L-glutamina. Tetraciclina (1 µg/mL, Sigma-Aldrich, Missouri, EUA), preparada recentemente a partir de estoques congelados, foi adicionada no mínimo 48 h antes dos ensaios funcionais para induzir a expressão de hNaV1.7 e hNaV1.8. Todas as linhagens celulares foram cultivadas em incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 °C e repicadas usando TrypLE Express.
Células ND7/23
A linhagem de hibridoma de neuroblastoma de gânglio da raiz dorsal (DRG) ND7/23 (92090903) foi obtida da Sigma–Aldrich (Castle Hill, Nova Gales do Sul, Austrália) e mantida em DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de SFB inativado pelo calor, L-glutamina (2 mM), piridoxina e piruvato de sódio (110 mg/mL). Culturas confluentes foram dissociadas usando TrypLE Express e cultivadas em incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 °C.
Células F11
Células de hibridoma de DRG x neuroblastoma F11 (08062601; Sigma Aldrich Austrália, Coleção Europeia de Culturas Celulares) foram cultivadas a 37 °C/5% CO2 em meio Ham's F12 contendo 10% de SFB, 100 μM de hipoxantina, 0,4 μM de aminopterina e 16 μM de timidina (suplemento HAT Hybri-Max™, Sigma–Aldrich, Castle Hill, Austrália) e repicadas usando TrypLE Express.
Células SH-SY5Y
Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y (94030304; Sigma Aldrich Austrália, Coleção Europeia de Culturas Celulares) foram mantidas a 37 °C/5% CO2 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contendo L-glutamina (2 mM) e 15% de SFB, e repicadas a cada 5–7 dias usando TrypLE Express.
Neurônios sensoriais derivados de iPSC humano
Neurônios sensoriais derivados de iPSC humana (RealDRG™) produzidos por Anatomic Inc. a partir do sujeito feminino ANAT001 foram diferenciados para produzir neurônios sensoriais imaturos com versões ampliadas do kit Senso-DM da Anatomic. Neurônios criopreservados no dia 7 pós-diferenciação foram obtidos da Anatomic Inc., plaqueados em lamínulas de vidro revestidas com poli-L-ornitina (Sigma, Castle Hill, Austrália) e Matrix 3 (Anatomic Inc., Minneapolis, EUA) em placas de cultura de tecidos de 12 poços (Corning) na densidade de 50.000 células/poço e mantidos em meio de maturação Chrono™ Senso-MM (Anatomic cat# 7008) por mais 7–21 dias (DIV14–28). O meio de crescimento foi trocado três vezes por semana e as gravações realizadas entre DIV14–28.
Plasmídeos e transfecção
Plasmídeos que codificam as subunidades β1, 2, 3 e 4 do NaV humano (SCN1B transcrito variante a; SCN2B; SCN3B transcrito variante 1 e SCN4B transcrito variante 1) foram adquiridos da OriGene (Rockville, MD, EUA) e subclonados em um plasmídeo pIRES-EGFP-Puro (Addgene, Massachusetts, EUA) pela instalação de Expressão de Proteínas da Universidade de Queensland, resultando em um constructo que leva à expressão separada das subunidades β e de uma proteína de fusão EGFP/resistência à puromicina após o elemento IRES2. Plasmídeos personalizados pSpCas9(BB)-2A-Puro PX459 codificando três RNAs guia separados que têm como alvo TMEM233 (5′-TGCGTACCCCATCAACATCG-3′, 5′-GTCTCAGTACGCCCCTAGCC-3′ e 5′-TCTCTGAACAGCTACAACGA-3′) foram adquiridos da GenScript (Nanjing, Província de Jiangsu, China). Plasmídeos pcDNA3.1 codificando hTMEM233, TMEM233 marcado com HA na extremidade N-terminal, TMEM233 marcado com HA na extremidade C-terminal, del.1-34 TMEM233, hNaV1.7 marcado com FLAG, hPRRT2, hTRARG1, GPAA1, PIGK, PIGS, PIGT, PIGU, CRELD1, LMAN2L, MMGT1, RNF121 e STT3B foram adquiridos da GenScript (Singapura) ou obtidos através da iniciativa FANTOM Riken cDNA. Os plasmídeos foram preparados usando os kits Qiagen HiSpeed Maxi Prep ou Qiagen Endofree Maxi Prep (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Para transfecção, as células foram semeadas a 70–80% de confluência em frascos T25 ou T75 e transfectadas com Lipofectamine 2000 ou Lipofectamine 3000 de acordo com os protocolos do fabricante. O plasmídeo vazio pcDNA3.1 foi usado como controle de transfecção simulada (mock) ou para ajustar a quantidade total de DNA para 1,8 µg (T25) ou 5,4 µg (T75). As células foram cultivadas por 24–48 h em meio de crescimento normal antes dos ensaios funcionais, exceto para células CHO transfectadas com plasmídeos β1-β4 e células TE-671 transfectadas com RNAs guia TMEM233/Cas9, que foram cultivadas sob seleção com puromicina por aproximadamente 4 semanas antes dos ensaios. Células HEK293-NaV1.7/TMEM233 marcado com HA na extremidade C-terminal estáveis foram geradas por seleção clonal usando higromicina (50 µg/mL em meio de crescimento completo) após transfecção com um plasmídeo pcDNA3.1/Hygro(+)-TMEM233 C-HA.
Eletrofisiologia
Patch-clamp automatizado em eletrofisiologia
Experimentos de patch clamp em célula inteira envolvendo células HEK293, COS-1, CHO, ND7/23, F11, SH-SY5Y e TE-671 foram realizados em uma plataforma de eletrofisiologia automatizada QPatch II (Sophion Bioscience, Ballerup, Dinamarca), conforme descrito anteriormente. Células com aproximadamente 70–80% de confluência foram coletadas de frascos T75 usando TrypLE Express a 37 °C por 2–5 min e ressuspensas em DMEM com 25 mM de HEPES (Sigma-Aldrich, NSW, Austrália), 100 U/mL de Penicilina-Estreptomicina (Gibco) e 40 µg/mL de inibidor de tripsina de Glycine max (soja) (Sigma Aldrich) antes da recuperação em um QStirrer (Sophion) por 30 min. Placas de patch de 16 canais com diâmetro de orifício de patch de 1 µm e resistência de 2 ± 0,02 MΩ foram utilizadas. Os parâmetros de posicionamento celular e selamento foram os seguintes: pressão de posicionamento −60 mbar, resistência mínima de selamento 0,1 GΩ, potencial de manutenção −100 mV, pressão de manutenção −20 mbar. As correntes de célula inteira foram filtradas a 5 kHz e adquiridas a 25 kHz. A compensação da resistência em série foi utilizada e ajustada para 70%.
A composição da solução extracelular (ECS) foi (em mM): 145 NaCl, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES e 10 glicose (pH 7,4) (osmolaridade, 305 mOsm). Para experimentos em células HEK293 que expressam NaV1.4, NaV1.5 e NaV1.7, a concentração de NaCl foi reduzida para 70 mM e substituída por 75 mM de cloreto de colina. A composição da solução intracelular foi (em mM): 140 CsF, 1/5 EGTA/CsOH, 10 HEPES e 10 NaCl (pH 7,3) com CsOH (osmolaridade, 320 mOsm).
Curva IV e dependência de voltagem da inativação rápida em estado estacionário
As curvas de corrente-voltagem (IV) foram determinadas em células HEK-NaV1.7, na ausência e presença de TMEM233, a partir de uma série de pulsos escalonados (500 ms) variando de −110 a +55 mV (incrementos de 5 mV, intervalo de repetição de 5 s) antes e após a incubação com ExTxA (1 µM) a partir de um potencial de manutenção de −90 mV. As correntes foram convertidas em condutância (G) usando G = I/(V − Vrev), com Vrev sendo o potencial de reversão, plotadas contra a voltagem e ajustadas com uma equação de Boltzmann para obter curvas GV (condutância-voltagem). A dependência de voltagem da inativação rápida em estado estacionário foi determinada por um pulso subsequente de 10 ms a −20 mV imediatamente após a etapa de despolarização de 500 ms detalhada acima para avaliar os canais não inativados disponíveis.
Farmacologia do ExTxA
Os efeitos do ExTxA na corrente de NaV em sistemas de expressão heteróloga ou linhagens celulares neuronais foram avaliados após incubação com concentrações variadas de ExTxA (0,1 nM – 1 µM), Pn3a (100 nM) e TTX (1 µM) diluídos em ECS com 0,1% de BSA por 5 min a um potencial de manutenção de −90 mV. A corrente de NaV foi eliciada por despolarização (50 ms) a −20 mV a cada 20 s (0,05 Hz), com a corrente persistente (40 ms a partir do pico de corrente) normalizada para o pico de corrente conforme especificado.
Dependência de voltagem da inativação lenta
Para determinar a dependência de voltagem da inativação lenta, células HEK293-NaV1.7 foram mantidas a −120 mV e a corrente de pico foi determinada por um pulso inicial de 20 ms para 0 mV. Após uma série de pulsos escalonados de 15.000 ms variando de −120 a 0 mV em incrementos de 20 mV, um pulso de teste subsequente de 50 ms para 0 mV, precedido por um passo de 50 ms para −120 mV para remover a inativação rápida, foi usado para determinar a corrente remanescente. A proporção de canais inativados lentamente foi determinada normalizando a corrente de pico do pulso de teste em relação à despolarização inicial. Uma equação de Boltzmann foi ajustada aos dados de corrente, plotados em função da voltagem, para determinar o V50, bem como a proporção mínima de canais ativáveis.
Protocolos de corrente de rampa
O potencial de manutenção foi de −90 mV. Após um pulso de 50 ms para −100 mV, rampas de −100 mV a +20 mV a uma taxa de 0,2 e 1,0 mV/ms foram aplicadas antes e depois da adição de ExTxA (100 nM).
Protocolo de dependência de uso
Os experimentos de dependência de uso foram realizados no Patchliner Quattro (Nanion Technologies GmbH, Munique, Alemanha) usando um amplificador de patch clamp EPC 10 USB Quadro (HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht/Pfalz, Alemanha) e os softwares PatchControlHT 2.01.30 e PatchMaster v2x90.4 beta (HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht/Pfalz, Alemanha). Células com aproximadamente 70–80% de confluência foram coletadas de frascos T75 usando Accutase (Thermofisher, Massachusetts, EUA) à temperatura ambiente por 2–5 min e ressuspensas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alta glicose (Sigma-Aldrich, New South Wales, Austrália) com HEPES 15 mM (Sigma-Aldrich, NSW, Austrália) antes da recuperação no hotel de células do Patchliner por 10 min. O ECS continha (em mM): NaCl 140, KCl 4, CaCl2 2, MgCl2 1, HEPES 10, glicose 5. O pH foi ajustado para 7,4 com NaOH e a osmolaridade foi de 298 mOsm. O ICS continha (em mM): CsCl 50, NaCl 10, CsF 60, EGTA 20, HEPES 10. O pH foi ajustado para 7,2 com CsOH e a osmolaridade foi de 285 mOsm. Um intensificador de selo foi usado contendo (em mM): NaCl 80, KCl 3, MgCl2 10, CaCl2 35, sal de HEPES Na+ 10. O pH foi ajustado para 7,4 com HCl e a osmolaridade foi de 298 mOsm. O intensificador de selo foi removido antes de iniciar os experimentos. Células HEK293 expressando estavelmente hNaV1.7/β1 ou hNaV1.7/β1/C-HA TMEM233 foram utilizadas. Séries consecutivas de 30 pulsos despolarizantes de 20 ms de −90 mV a −20 mV foram aplicadas com frequências de 1 Hz, 2 Hz, 5 Hz, 10 Hz e 20 Hz. Após o experimento, ExTxA (100 nM) foi aplicada para confirmar a expressão de TMEM233. A amplitude da corrente de teste foi normalizada em relação à corrente induzida pelo primeiro pulso de sua série, com o último pulso de teste plotado em função da frequência para análise estatística.
Recuperação do protocolo de inativação rápida
Para determinar a recuperação da inativação rápida, um pulso de 20 ms a 0 mV a partir de um potencial de manutenção de −90 mV foi utilizado para induzir a inativação rápida. Um período de recuperação subsequente, variando de 1 ms a 2216 ms em incrementos de 50% a −90 mV, foi seguido por um último pulso de teste de 20 ms a 0 mV para determinar a dependência temporal da recuperação da inativação rápida. A proporção de canais disponíveis foi determinada normalizando as correntes de pico do último para o primeiro pulso. Uma equação exponencial de duas fases foi ajustada à corrente normalizada, plotada em função do tempo, para determinar as constantes de tempo τ1 e τ2 da recuperação da inativação rápida.
Eletrofisiologia de oócitos de Xenopus laevis
Os genes humanos NaV1.7 e TMEM233 clonados no plasmídeo pcDNA3.1 foram linearizados com a enzima de restrição NotI e usados como molde para a síntese de cRNA usando a T7 polimerase (mMessage mMachine Kit; Life Technologies). Oócitos de estágio V/VI foram injetados com 5–20 ng de RNA total, depois incubados a 17 °C por 1–3 dias em meio Leibovitz’s L-15 50% (Gibco), suplementado com 25 µg/mL de gentamicina, 25 µg/mL de estreptomicina e 2,5% de soro fetal de cavalo. O voltage clamp de dois eletrodos (amplificador Axoclamp 900 A; Axon Instruments) foi realizado à temperatura ambiente em solução ND96 (em mM: 96 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 5 HEPES; pH 7,4 com NaOH) com uma câmara de registro de ∼40 μL. Nos experimentos em que ExTxA foi adicionado, as soluções foram suplementadas com 0,05% de albumina sérica bovina livre de ácidos graxos. Microeletrodos de vidro borossilicato tinham resistências de 0,2–0,8 MΩ quando preenchidos com KCl 3 M. Os dados foram digitalizados a 20 kHz e filtrados a 2 kHz usando o software pCLAMP 11 (Digidata 1550B; Axon Instruments).
A atividade de ExTxA foi avaliada a 1 µM, analisando a corrente de um degrau de 50 ms para −10 mV a cada 10 s, a partir de um potencial de manutenção de −80 mV. Para todos os outros protocolos de voltagem, os oócitos foram mantidos a −90 mV. As curvas de ativação foram obtidas medindo as correntes de pico durante degraus de −100 mV a +60 mV em incrementos de +10 mV aplicados a cada 10 s, com o gráfico G/Gmax entre −80 mV e +10 mV. As curvas de inativação em estado estacionário plotam a corrente de pico em um pulso de teste de −10 mV, após um pré-pulso de 200 ms de −100 mV a +40 mV em incrementos de +10 mV aplicados a cada 10 s. As curvas de inativação lenta plotam a corrente de pico em um pulso de teste de −10 mV, após um pré-pulso de 10 s de −110 mV a −10 mV em incrementos de +10 mV aplicados a cada 20 s. Para determinar a recuperação da inativação, os oócitos foram primeiro submetidos a um degrau para −10 mV, depois repousados a −90 mV por um intervalo de tempo variável indicado no gráfico, e então uma segunda despolarização para −10 mV foi aplicada para determinar a fração de canais recuperados. Este protocolo foi aplicado a cada 13 s (tempo entre cada degrau inicial para −10 mV).
Eletrofisiologia manual de patch-clamp em neurônios de DRG
Para determinar os efeitos da ExTxA na corrente total e TTX-s de NaV em neurônios de DRG do tipo selvagem, foram realizados registros de voltage-clamp de célula inteira 20–48 h após a isolamento do DRG usando um amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices) e o conjunto de software Clampex 10.7, com dados amostrados a 10 kHz e filtrados a uma frequência de 2 kHz. A resistência da pipeta foi mantida entre 1–3 MOhm. As soluções internas continham (em mM): CsF 140, NaCl 10, EGTA 1, HEPES 10, D-glicose 10 (pH 7,3 com CsOH, osmolaridade 310–315). As soluções externas continham (em mM): NaCl 50, Choline-Cl 90, KCl 3, HEPES 10, MgCl2 1, CaCl2 1, TEA-Cl 20, CdCl2 0,1, CsCl 5 (pH 7,4 com NaOH, osmolaridade 320–330). As correntes foram evocadas por degraus de despolarização consecutivos a −20 mV (50 ms) a partir de um potencial de manutenção de −90 mV a cada 10 s na presença de controle de tampão (0,1% BSA) ou ExTxA (100 nM em 0,1% BSA) seguido por TTX (1 µM em 0,1% BSA) ou ExTxA + TTX. Correntes persistentes a 40 ms foram normalizadas para a corrente de pico para análise.
O efeito do ExTxA nos canais NaV1.8 foi examinado em neurônios do gânglio da raiz dorsal (GRD) sem NaV1.9. Registros eletrofisiológicos foram realizados em temperatura ambiente (22 °C) 24 horas após o isolamento dos neurônios do GRD utilizando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices). O potencial da pipeta foi ajustado para zero antes da formação do selo, e o potencial de junção líquida não foi corrigido. Os transientes de capacitância foram cancelados e os erros de voltagem foram minimizados com compensação de resistência série de 80–90%. As correntes dependentes de voltagem foram adquiridas com Clampex 10.7, amostradas a 50 ou 100 kHz e filtradas a 5 kHz. A solução extracelular (SEC) continha (em mM): 50 NaCl, 90 cloreto de colina, 3 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 5 CsCl, 20 TEA·Cl, 0,1 CdCl2, pH 7,4 com NaOH (326 mOsmol/L). No início do experimento, 4-aminopiridina (4 mM) e tetrodotoxina (TTX, 1 μM) foram adicionadas à solução do banho para bloquear canais de potássio endógenos e canais de sódio sensíveis à tetrodotoxina. A solução interna da pipeta continha (em mM): 140 CsF, 10 NaCl, 1 EGTA, 10 HEPES e 10 dextrose, pH 7,3 com CsOH (ajustado para 311 mOsmol/L com sacarose). Neurônios do GRD de pequeno diâmetro (24–30 μm) foram selecionados porque produzem grandes correntes de NaV1.8. As células foram mantidas a −100 mV e as correntes de NaV1.8 foram eliciadas com uma série de despolarizações (0 mV por 100 ms, intervalos de 10 segundos). Uma vez que a amplitude da corrente se tornou estável, ExTxA (100 nM em 0,1% BSA, 10 ml) ou controle veicular (0,1% BSA, 10 mL) foram aplicados por superfusão. As correntes persistentes foram normalizadas para as correntes de pico, e os efeitos na corrente persistente foram avaliados comparando a alteração da corrente persistente em 40 ms (amplitude da corrente persistente após tratamento com ExTxA ou BSA menos amplitude da corrente persistente antes do tratamento com ExTxA ou BSA). Finalmente, para confirmar a sensibilidade ao ExTxA dos neurônios registrados, a TTX extracelular foi removida por lavagem com SEC normal ao final do experimento. Apenas células com grandes correntes persistentes em resposta à remoção da TTX, provavelmente produzidas por canais NaV1.7, foram incluídas na análise dos dados.
O efeito da ExTxA sobre o NaV1.9 foi examinado em neurônios DRG nulos para NaV1.8 (NaV1.8Cre/Cre), conforme detalhado acima para as correntes de NaV1.8. A solução extracelular (ECS) continha (em mM): 140 NaCl, 3 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 5 CsCl, 20 TEA·Cl, 0,1 CdCl2, pH 7,4 com NaOH (327 mOsmol/L). A solução interna da pipeta continha (em mM): 140 CsF, 10 CsCl, 5 EGTA, 10 HEPES, 2 Na-adenosina 5′-trifosfato, 0,3 Na-guanosina 5′-trifosfato, 2,5 Na-creatina fosfato e 9 dextrose, pH 7,3 com CsOH (311 mOsmol/L). Neurônios DRG de pequeno diâmetro (<30 μm) foram selecionados, e as correntes de NaV1.9 foram evocadas por duas despolarizações de 50 ms a −50 e −40 mV após um pré-pulso de 500 ms a −130/−140 mV antes de cada despolarização (protocolo de dois pulsos, intervalo de 20 seg). Houve um aumento dependente do tempo nas correntes de NaV1.9, com amplitude de pico máxima alcançada cerca de 10 min após a formação da configuração de célula inteira. Células que produziam mais de 1 nA de correntes de NaV1.9 com pouco ou nenhum declínio foram superfundidas com ECS, seguidas por 10 mL de ECS contendo 0,1% de BSA (controle) ou ExTxA (1 μM em 0,1% de BSA). Os dados foram analisados usando Clampfit 10.7 (Molecular Devices) e OriginPro 2021b (Microcal Software) e apresentados como média ± EPM, salvo indicação em contrário.
Experimentos de patch clamp em célula inteira em DRGs de camundongos Tmem233Cre/Cre e DRGs de camundongos selvagens (littermates) foram obtidos usando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, CA, EUA) e os sinais foram digitalizados usando Digidata 1440 A (Molecular Devices), os dados foram visualizados e analisados usando o pacote de software pClamp (Versão 10). A solução interna para voltage-clamp continha (em mM): CsMetanossulfonato 130, NaCl 20, EGTA 0,2, HEPES 10, Mg-ATP 4, Na-GTP 0,3 e dextrose 10. A solução externa continha (em mM): NaCl 30, Cloreto de Colina 110, KCl 3, MgCl2 1, CaCl2, HEPES 10, CsCl 5, TEA-Cl 20, CdCl2 0,1 e 4-AP 1. A solução externa continha (em mM): NaCl 140, KCl 3, MgCl2 2, CaCl2 2, HEPES 10. As soluções internas e externas foram ajustadas para pH 7,2 com CsOH ou NaOH e a osmolaridade foi corrigida usando D-glicose, 300–310; 310–320 mOsm, respectivamente. As pipetas foram puxadas usando vidro borossilicato (1,5 DE, 1,17 DI, Harvard Apparatus, Reino Unido) em um puxador de pipetas Narashige (PC-10, Reino Unido) e polidas ao fogo (Microforge MF830, Narashige) no dia do experimento. A resistência da pipeta foi mantida entre 1–3 MOhm e, após a configuração de célula inteira ser alcançada, os neurônios foram mantidos a −80 mV. Os erros de voltagem foram mantidos abaixo de 10% usando 80–90% de compensação de resistência em série. As gravações foram adquiridas a 25 kHz com um filtro passa-baixa Bessel de 2,9 kHz e as gravações incluíram uma subtração linear de vazamento P/6. Antes da gravação, as lamínulas foram incubadas com isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia conjugada com AlexaFluor488 (1 µg/µL) por 5 min, depois lavadas duas vezes com solução externa para visualizar neurônios DRG IB4+ e IB4-. Os DRGs em lamínulas foram colocados em um banho de baixo volume (<500 µL) (Warner Instruments) para as gravações. Após uma gravação controle (antes), realizada 5 min após a ruptura, ExTxA (30 nM, 0,1% BSA) em ECS foi perfundida por 2–3 min através de um sistema de perfusão por gravidade para permitir troca de fluido suficiente e ligação da toxina. Pulsos para −20 por 100 ms foram usados para avaliar a corrente persistente (amplitude média da corrente durante os 30 ms finais) após a exposição à ExTxA.
Eletrofisiologia de patch-clamp manual em neurônios sensoriais derivados de iPSC humanos.
Experimentos de patch clamp de célula inteira em neurônios sensoriais derivados de iPSC humanos foram realizados entre DIV14-28 usando o amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices) e o pacote de software Clampex 10.7, com dados amostrados a 10 kHz, frequência de filtro de 2 kHz e compensação de resistência de série de 50–60%. A resistência da pipeta foi mantida entre 1–3 MOhm. As soluções externas continham (em mM): NaCl 140, KCl 3, HEPES 10, MgCl2 1, CaCl2 1, TEA-Cl 20, CdCl2 0,1, CsCl 5 (pH 7,4 com NaOH, osmolaridade 320–330). As soluções internas continham (em mM): CsF 140, NaCl 10, EGTA 1, HEPES 10, D-glicose 10 (pH 7,3 com CsOH, osmolaridade 310–315). As células foram mantidas a −100 mV e as correntes foram evocadas por despolarizações consecutivas para −20 mV (50 ms, intervalos de 10 s). Controle veículo (ECS contendo 0,1% de BSA), ExTxA (100 nM), Pn3a (100 nM) e TTX (1 µM) foram lavados consecutivamente. Correntes persistentes a 40 ms foram normalizadas para a corrente de pico para análise.
Triagem TKOv3 em células TE-671
Conforme descrito anteriormente, aproximadamente 70–100 milhões de células TE-671 foram preparadas em cinco frascos T-175. Polibreno (8 µg/mL; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Austrália) foi adicionado ao meio de crescimento e, subsequentemente, o lentivírus da Biblioteca CRISPR Toronto KnockOut (TKO) versão 3 codificando 70948 guias (4 gRNA/gene) (Addgene, Massachusetts, EUA) foi adicionado a cada frasco (foi usado um volume que produzia uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 0,5). As células foram incubadas por 24 h a 37 °C e 5% de CO2. O meio celular foi substituído por meio de crescimento fresco, e puromicina (10 µg/mL) foi adicionada após 24–48 h para a seleção das células transduzidas. As células TE-671 transduzidas com a biblioteca lentiviral TKO v3 foram passadas 6 vezes sob seleção antes da separação em três grupos, cada um contendo aproximadamente 70–100 milhões de células em múltiplos frascos de cultura celular. As células foram expostas a uma combinação de veratridina (5 µM) e ouabaína (20 nM) com ou sem ExTxA (1 µM), ou sem seleção por 3 dias. As células foram lavadas com PBS, e meio de crescimento fresco foi adicionado. As células foram deixadas para se recuperar por um período de 3–5 dias. Após a recuperação, as células passaram pelo processo de seleção mais duas vezes. Após a terceira rodada de seleção, as células foram colhidas e o DNA genômico (gDNA) foi extraído usando o Kit ISOLATE II de DNA Genômico (Bioline, Meridian Bioscience, Ohio, EUA).
O DNA genômico foi extraído de células TE-671 colhidas e utilizado para reações de PCR. Os iniciadores utilizados para amplificar os RNAs guia únicos (sgRNAs) do TKO v3 foram os seguintes: sense, 5′-GGA CAG CAG AGA TCC AGT TTG GT-3′ e antisense, 5′-GAG CCA ATT CCC ACT CCT TTC AA -3′. A amplificação foi realizada utilizando NEBNext Q5U Master Mix (BioLabs New England, Massachusetts, EUA) com 20 ciclos (98 °C por 10 seg, seguido de 66 °C por 30 seg). Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit de purificação de PCR QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Uma PCR secundária foi realizada para anexar adaptadores Illumina, bem como para codificar as amostras com código de barras. Os iniciadores para a PCR secundária incluem um código de barras de 6 pares de bases para multiplexação de diferentes amostras biológicas e réplicas, bem como sequências de comprimento variável para aumentar a complexidade da biblioteca: sense, 5′- AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T (sequência de comprimento variável de 1 a 9 pares de bases) TCT TGT GGA AAG GAC GAA ACA CC-3′ e antisense; 5′- CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT (código de barras de 6 pares de bases) GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TAC CGA CTC GTT GCC ACT TTT TCA AG-3′. A amplificação foi realizada utilizando NEBNext Q5U Master Mix (BioLabs New England, Massachusetts, EUA) com 3 ciclos (98 °C por 10 s, 63 °C por 30 s, depois 72 °C por 30 s) imediatamente seguidos por 15 ciclos (98 °C por 10 s e 72 °C por 30 s). Os produtos de PCR da segunda PCR foram carregados em um gel a 2% e submetidos à eletroforese por 1 h a 90 V. A banda que apareceu em aproximadamente 240 pb foi excisada, quantificada, misturada e sequenciada usando um sequenciador HiSeq 2500 (Illumina, Califórnia, EUA). As sequências de sgRNA contra genes específicos foram recuperadas após a remoção das sequências de etiqueta usando Checkout [http://100bp.wordpress.com] e cutadapt (ver. 1.12).
O enriquecimento de sgRNAs e genes foi analisado usando MAGeCK (ver. 0.5.9) comparando as contagens de leitura de células TE-671 após a seleção com ExTxA com as contagens de células sem seleção com ExTxA para obter uma lista de genes enriquecidos. P < 0,01 foi considerado estatisticamente significativo conforme definido pelo procedimento de Benjamini–Hochberg. Adicionalmente, o enriquecimento de sgRNAs e genes entre o controle não selecionado e o grupo tratado sem ExTxA (apenas veratridina e ouabaína) foi conduzido para garantir que nenhum gene foi enriquecido devido ao tratamento com veratridina ou ouabaína.
Ensaio de potencial de membrana
Células HEK293-NaV1.7 foram transfectadas com TMEM233, CRELD1, LMAN2L, MMGT1, RNF121 e STT3B e co-transfectadas com cinco plasmídeos que codificam para o complexo Glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPAA1, PIGK, PIGS, PIGU, PIGT) usando Lipofectamina 2000. Após 24 h, as células transfectadas foram colhidas e plaqueadas a uma densidade de 10.000–15.000 células por poço em placas de imagem de 384 poços com paredes pretas. As células plaqueadas foram cultivadas por mais 24 h a 37 °C e 5% de CO2. O corante do ensaio de potencial de membrana FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader) Red (Molecular Devices, Califórnia, EUA) foi diluído em solução salina fisiológica de acordo com as instruções do fabricante (PSS, em mM: NaCl 140, glicose 11,5, HEPES 10, KCl 5,9, MgCl2 1,4, NaH2PO4 1,2, NaHCO3 5, CaCl2 1,8, pH 7,4). O meio de crescimento foi removido da placa e substituído por 20 µL de corante do ensaio de potencial de membrana FLIPR Red por poço e incubado no escuro a 37 °C por 60 min. As alterações no potencial de membrana foram avaliadas usando um FLIPRPenta (excitação, 515–545 nm; emissão, 565–625 nm; Molecular Devices, Califórnia, EUA) a cada 0,5 s por 10 min após a adição de ExTxA (10 µM). As respostas de fluorescência ao ExTxA foram calculadas como a mudança máxima na fluorescência em relação à linha de base (ΔF/F0) usando ScreenWorks (Molecular Devices, Versão 5.1.2.94).
Avaliação comportamental in vivo
As respostas nocifensivas à administração intraplantar de ExTxA (5–10 nM) foram avaliadas conforme descrito anteriormente. Em resumo, o ExTxA foi diluído em soro fisiológico estéril / BSA 0,1% e administrado por injeção intraplantar (40 μL) em uma única pata traseira de camundongos Tmem233Cre/Cre, NaV1.7Advill e controles de ninhada do tipo selvagem. Os comportamentos de dor, consistindo em lambidas ou contrações da pata, foram contados a partir de gravações de vídeo por um investigador cego por até 60 min após a injeção.
Imagem de cálcio
Neurônios de DRG dissociados de camundongos Tmem233Cre/Cre e C57BL/6 foram plaqueados em placas de imagem de 96 poços com paredes pretas revestidas com PDL e carregados com indicador de cálcio Fluo-4 AM (5 μM) (Invitrogen, Massachusetts, EUA) por 1 h em meio de cultura. As células foram lavadas com solução salina balanceada de Hanks contendo 20 mM de HEPES e então transferidas para a câmara de registro de um microscópio invertido de deconvolução Nikon Ti-E equipado com uma fonte de luz LED Lumencor Spectra. Imagens de fluorescência (excitação, 485 nm; emissão, 521 nm) foram adquiridas a 1 quadro por segundo usando uma objetiva ×20. Após o registro da fluorescência basal (20 s), as células foram expostas consecutivamente ao controle de tampão (BSA 0,1%, t = 30 s), ExTxA (10 nM, t = 60 s) e KCl 30 mM (30 mM, t = 210 s). Os respondedores ao ExTxA (aumento >1,5 vezes na fluorescência em relação à linha de base) foram calculados como uma proporção de células excitáveis por KCl e determinados a partir de um total de 4 culturas (2 WT, 2 Tmem233Cre/Cre) gerando 1750 neurônios responsivos a KCl (899 WT, 851 Tmem233Cre/Cre). Células que responderam ao controle de tampão foram excluídas da análise.
Ensaio de ligação por proximidade (PLA)
Células HEK293 expressando estavelmente β1/β2 foram transfectadas transitoriamente em frascos T25 usando Lipofectamine 2000 com plasmídeos codificando GFP (0,35 μg) como controle de transfecção, bem como TMEM233 com tag HA N-terminal (0,35 μg) e NaV1.7 com tag FLAG N-terminal (1,0 μg) sozinhos ou em combinação. A quantidade total de DNA plasmidial/frasco T25 foi mantida constante em 1,7 μg/frasco usando plasmídeo pcDNA3.1 vazio conforme necessário. Após 24 h de incubação a 37 °C, as células foram plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com PDL e cultivadas por mais 24 h. As células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato estéril, fixadas com formaldeído a 4% por 5 min, permeabilizadas com Triton-X 100 a 0,1% em PSS, bloqueadas usando tampão de bloqueio para ligação de proximidade (Sigma DUO82007) e incubadas por 1 h com anticorpos anti-FLAG (1:1000; Sigma F1804) e anti-HA (1:1000; Sigma H6908) em diluente de anticorpo Duolink. As células permeabilizadas foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem A à temperatura ambiente por 5 min. As sondas anti-camundongo PLUS (Sigma DUO92001) e anti-coelho MINUS (Sigma DUO92005) foram diluídas 1:5 em diluente de anticorpo Duolink e incubadas com as células por 1 h a 37 °C. As células foram então lavadas com tampão de lavagem A à temperatura ambiente por 5 min duas vezes e incubadas com ligase diluída 1:40 em tampão de ligação. Após incubação a 37 °C por 30 min, as células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem A. A polimerase foi diluída 1:80 em tampão de amplificação e incubada com as células por 100 min a 37 °C. As células foram subsequentemente lavadas com tampão de lavagem B duas vezes por 10 min e montadas com meio de montagem Duolink In Situ com DAPI. As células foram imageadas em um Zeiss AxioImage M2 com Apotome2 e câmera Axiocam 506. O sinal do ensaio de ligação de proximidade (partículas PLA) em células GFP-positivas foi quantificado usando ImageJ em pilhas colapsadas de 3–6 imagens aleatórias obtidas por lamínula (Image>Type>8-bit; Image>Adjust>Threshold; Image>Analyze>Analyze Particles). O tamanho das partículas foi definido como 0,0003–∞ e a circularidade como 0,00–1,00. O número médio de partículas/células GFP-positivas de três experimentos independentes foi analisado por ANOVA de uma via.
Microscopia confocal
Células HEK293 foram transfectadas para expressar TMEM233 usando Lipofectamine 2000 (#11668019, ThermoFisher Scientific) conforme instruções do fabricante. Células HEK293 transfectadas foram então semeadas em placas de 6 poços sobre lamínulas redondas de 13 mm de diâmetro nº 1/1,5 um dia antes do experimento para atingir uma confluência alvo de 50–70% no momento do tratamento. No dia do experimento, o meio foi aspirado e substituído por ExTxA biotinilada (1 µM) diluída em meio totalmente complementado, seguido de incubação a 37 °C/5% CO₂ por 30 min. O meio foi então aspirado e as células foram lavadas duas vezes com meio pré-aquecido. Após incubação com conjugado estreptavidina-Alexa488 (S32354, Thermo Fisher Scientific Austrália, 1:1000) por 30 min e mais duas lavagens com meio completo, as células foram fixadas por 11,5 min com paraformaldeído a 4% pré-aquecido a 37 °C, grau microscopia eletrônica (#C004, ProScitech) e 1x BRB80 (tampão de estabilização do citoesqueleto, 80 mM PIPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, pH 6,8 com KOH). F-actina foi corada com Rodamina Faloidina (Ab235138, Abcam) e os núcleos corados com 0,66 µg/mL de Hoechst 33342 (#H3570, ThermoFisher Scientific) diluídos em tampão de diluição de anticorpos contendo 150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Triton X-100, 2% Albumina Sérica Bovina e 0,1% NaN₃, por 30 min. As células foram lavadas 5 vezes por 1 min cada com PBS, montadas usando meio de montagem com 10% Mowiol/2,5% DABCO e imageadas em um microscópio confocal de disco giratório Andor Dragonfly.
Células HEK293 foram transfectadas com TMEM233 marcado com HA nas extremidades N e C usando Lipofectamine 2000 (#11668019, ThermoFisher Scientific) conforme instruções do fabricante. 16 h após a transfecção, células HEK293 expressando TMEM233 marcado na extremidade N ou C foram destacadas e semeadas em placas de 6 poços sobre lamínulas de 13 mm 1.5#. Para determinar a exposição na superfície celular do HA-TMEM233 marcado na extremidade N ou C, 0,5 µg/mL de anticorpo monoclonal HA Tag (#26183, ThermoFisher Scientific) diluído em meio foi incubado com as células por 1 h dentro de uma incubadora de cultura de tecidos com 5% CO₂, com agitação manual suave a cada 10–15 min, e então fixado conforme acima. Condições de controle foram preparadas semeando primeiro células HEK293 transfectadas com TMEM233 marcado com HA na extremidade N ou C, depois fixando, permeabilizando e bloqueando conforme acima. O TMEM233 total marcado com HA na extremidade N ou C foi detectado usando 0,5 µg/mL de anticorpo HA-tag, diluído em tampão de diluição de anticorpos. Para ambas as condições, o HA Tag foi detectado usando um anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com alexafluor-488 (#715-545-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories inc., 1:1000), os núcleos foram contra-corados usando 0,66 µg/mL de Hoechst 33342.
RNAscope in situ Hibridização (ISH)
Cortes Congelados de Gânglio da Raiz Dorsal (DRG) de Camundongo (MF-240-C57, 7–10 µm de espessura) foram obtidos comercialmente da Zyagen (www.zyagen.com) via AMS Biotechnology (https://www.amsbio.com) ou produzidos internamente. No último caso, camundongos C57BL/6 adultos foram profundamente anestesiados com pentobarbital (i.p.) e perfundidos transcardialmente com solução salina heparinizada (NaCl 0,9%) seguida por 25 mL de paraformaldeído a 4% frio em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4). Os DRGs foram extraídos da área lombar e pós-fixados com a mesma solução fixadora por 2 h a 4 °C antes de serem embebidos em solução criopreservadora (sacarose a 30%) durante a noite a 4 °C. As amostras de tecido foram então colocadas em blocos de OCT para posterior corte em criostato. Cortes de 11 μm de espessura foram montados em lâminas Superfrost Plus (Fisher Scientific), deixados para liofilizar durante a noite a −80 °C, para uso imediato, ou armazenados a −80 °C em recipientes herméticos por no máximo um mês para experimentos subsequentes.
A hibridização in situ foi realizada usando o ensaio RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Bio-Techne) seguindo o protocolo para amostras frescas congeladas, com pós-fixação de 1 h com PFA a 4% em PBS a 4 °C e desidratação gradual com Etanol a 50%, 70% e 100%. O pré-tratamento do tecido consistiu em peróxido de hidrogênio e Protease IV (10 e 20 min, respectivamente) à temperatura ambiente. Após o pré-tratamento, a hibridização da sonda e a detecção com o Multiplex Fluorescence Kit v2 foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante.
As sondas incluíram mmTmem233 (#519851-c1), mmScn9a (#3133341-c2) ou mmScn9a (#3133341-c4), e mmNefh (#443671-c2) ou mmNefh (#443671-c4). A localização do RNA foi detectada com os corantes fluorocromos AF488 ou Opal 520 (verde), TS-coumarin TS405 (azul), Opal570 (vermelho) e Opal 650 (vermelho distante) (Perkin Elmer) em comparação com a coloração DAPI (núcleos). As lâminas de ISH foram montadas usando Prolong Gold (ThermoFisher Scientific #P36930).
A fluorescência foi detectada usando o microscópio Zeiss LSM 880 Airyscan, utilizando varredura airyscan ou LSM. As imagens foram obtidas com ampliações de 10x e 20x com média de 4x. Os mosaicos foram unidos quando mais de um foi usado para imagear a área, processados pelo airyscan e exportados como arquivos tiff de 16 bits não comprimidos para edição básica adicional no Adobe Lightroom v6 (Adobe) em um monitor iMac (X-Rite) retina calibrado por cores. As imagens finais foram exportadas como arquivos jpeg com 6000 pixels no lado maior a 300 ppi.
Ensaio inseticida em Drosophila melanogaster
Para testar a atividade inseticida, injetamos ExTxA em fêmeas de Drosophila melanogaster com três dias de idade (peso médio 0,875 mg). No total, 77 D. melanogaster foram usadas neste estudo: 52 indivíduos foram injetados com 0,5 nmol (50 nL de uma solução 0,1 mM) de ExTxA, enquanto 25 indivíduos serviram como grupo controle e foram injetados com veículo controle (3% de acetonitrila, 0,1% de albumina sérica bovina em água) e avaliados por um observador cego.
Copurificação e SDS-PAGE de NaV1.7/TMEM233
Os genes da variante 3 de splicing alternativo do NaV1.7 humano (acesso Uniprot: 15858-3) e do TMEM233 (acesso Uniprot: B4DJY2) foram subclonados em um vetor pEG BacMam modificado. Uma proteína fluorescente verde (GFP) e uma etiqueta Twin-Strep foram fundidas ao C-terminal do NaV1.7, e um peptídeo sinal da IL-2 e uma etiqueta de proteína fluorescente vermelha (mcherry) foram fundidos ao N-terminal do TMEM233. NaV1.7-GFP e mCherry-TMEM233 foram coexpressados em células HEK293F que foram cultivadas em meio OPM-293 suplementado com 1% (v/v) de soro fetal bovino (FBS, PAN-Biotech) em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e agitação a 100 rpm. As células foram coletadas e armazenadas em um freezer a −80 °C.
Os pellets de células foram ressuspendidos no tampão A (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM β-mercaptoetanol (β-ME), pH 7,5, e coquetel inibidor de protease incluindo 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), 0,8 μM pepstatina, 2 μM leupeptina, 2 μM aprotinina e 1 mM benzamidina). Em seguida, os debris de membrana foram coletados por ultracentrifugação e ressuspendidos no tampão A suplementado com 1% (p/v) de n-Dodecil-β-D-Maltosídeo (DDM, Anatrace) e 0,15% (p/v) de hemisuccinato de colesterila (CHS, Anatrace). Após a ultracentrifugação, o sobrenadante foi carregado em contas de Streptactina (Smart-Lifesciences). Após a lavagem, o complexo proteico foi eluído no tampão A mais 0,05% GDN (p/v) e 5 mM destiobiotina. A amostra concentrada foi carregada em uma coluna Superose 6 Increase 10/300 GL (GE Healthcare, EUA) pré-equilibrada com 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,007% GDN (p/v) e 2 mM β-ME, pH 7,5. As frações dos picos foram analisadas por HPLC com detecção de GFP, mCherry e UV, e por SDS-PAGE.
Citometria de fluxo
Células HEK293 (controles não transfectados ou transfectados com TMEM233), bem como células HEK293-NaV1.7 controle e transfectadas com TMEM233 foram coletadas usando TrypLE Express, lavadas e ressuspendidas em solução tampão de fosfato. As células foram então centrifugadas (400 × g por 5 min) e ressuspendidas em solução salina fisiológica (PSS) contendo 0,1% de albumina de soro bovino. ExTxA biotinilado (1 µM) foi então adicionado às células e incubado em um agitador por 30 min. Subsequentemente, as células foram centrifugadas e lavadas três vezes com PSS. As células foram então incubadas com Streptavidina DyLightTM 680 (1:2000) por 45 min com agitação. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PSS e ressuspendidas em PSS e analisadas usando um BD FACSAria Cell Sorter. Os dados de citometria de fluxo (100.000 eventos por grupo) foram analisados usando FlowJo™ (versão 10.7.2, FlowJo, LLC, Ashland, OR, EUA). Todos os gates foram criados no controle não corado e depois aplicados às outras amostras. O gate FSC-A vs. SSC-A foi usado para selecionar a população de células e eliminar debris celulares. Depois, a discriminação de doubletos foi realizada usando gates SSC-H vs. SSC-W e FSC-H vs. FSC-W. No gráfico de pontos FSC-A vs. APC-A, um limiar foi definido na intensidade fluorescente de 1000, acima do qual os eventos foram considerados como um sinal positivo.
Ensaio de ligação de ExTxA-488
Células HEK293 (controles não transfectados ou transfectadas com TMEM233, NaV1.7 ou ambos TMEM233 e NaV1.7) foram incubadas em suspensão com ExTxA conjugado a Alexa Fluor 488 (ExTxA-488) em tampão de ensaio (250 mM de NaCl, 25 mM de HEPES, pH 7) por 30 min a 4 °C. O ExTxA-488 não ligado foi removido por lavagem das células três vezes com tampão de ensaio. As células foram plaqueadas a uma densidade de 100.000 células por poço em um volume de 50 µL em uma OptiPlate de 384 poços (PerkinElmer, Massachusetts, EUA). A intensidade de fluorescência (excitação 490 nm; emissão 520 nm) foi avaliada utilizando um Infinite M1000 Pro (Tecan, Männedorf, Suíça). As curvas de concentração-resposta foram ajustadas usando a equação log(agonista) vs. resposta — declive variável (quatro parâmetros) e normalizadas ao maior topo ajustado dentre os quatro grupos, conforme calculado pelo GraphPad Prism Versão 9.4.1.
Análise de dados
Todos os dados são apresentados como média ± E.P.M. em todo o texto, salvo indicação em contrário. Detalhes sobre os valores de n (experimentos independentes ou réplicas biológicas) e testes estatísticos são fornecidos na Tabela Suplementar 1. Todas as medições foram obtidas a partir de amostras distintas. Os dados foram plotados e analisados utilizando o GraphPad Prism versão 9.4.1, conforme detalhado em todo o texto. A significância estatística foi definida como p < 0,05.
Resumo do relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo do Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.
Informações suplementares
Dados de origem
Nota do editor: a Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Sina Jami, Jennifer R. Deuis, Tabea Klasfauseweh.
Histórico de alterações
8/14/2023
Na versão original deste artigo, os nomes de família e próprios de G. Gregory Neely estavam incorretamente estruturados. O nome foi exibido corretamente em todas as versões no momento da publicação. O artigo original foi corrigido.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-023-37963-2.
Contribuições dos autores
S.J., J.R.D., T.K., X.C., P.Z., M.R.I., B.C.-A., L.D.R. realizaram experimentos de eletrofisiologia; S.J., J.R.D., T.K., S.L., V.S. e A.M.H. realizaram experimentos comportamentais; A.L.O., R.J.J., I.V. e S.D.R. realizaram experimentos de imagem; S.J., S.K., F.C., L.R. e Å.A. realizaram experimentos de sequenciamento e biologia molecular; J.Zhang., Y.K.-Y.C., Y.Z., J.L., T.C. e S.P. realizaram experimentos de bioquímica; I.V. realizou experimentos de citometria de fluxo; P.T., H.N.T.T. e K.M. sintetizaram compostos. D.A.A., L.D.R., J.N.W., J.Zhao., S.J.S., M.M., A.L., D.J., J.J.C., S.G.W., S.D.D., G.G.N., T.D. e I.V. desenharam os experimentos, analisaram e interpretaram os dados e editaram o artigo. T.D. e I.V. conceberam o estudo e escreveram o manuscrito.
Revisão por pares
Informações de revisão por pares
Nature Communications agradece a Bruce Bean e ao(s) outro(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Os relatórios dos revisores estão disponíveis.
Disponibilidade de dados
Os dados que suportam este estudo estão disponíveis mediante solicitação aos autores correspondentes. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem. Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
O papel dos canais de sódio dependentes de voltagem na sinalização da dor
Estrutura e farmacologia dos canais de sódio e cálcio dependentes de voltagem
União Internacional de Farmacologia. XLVII. Nomenclatura e relações estrutura-função dos canais de sódio dependentes de voltagem
Modelo molecular do canal de sódio do potencial de ação
Ativação dependente de voltagem dos canais de sódio: correlacionando estrutura e função
Canais de sódio e farmacologia de peptídeos de veneno
A farmacologia dos ativadores de canais de sódio dependentes de voltagem
Peptídeos neurotóxicos do veneno da gigante árvore urticante australiana
Contato cutâneo com uma árvore urticante exigindo internação em unidade de terapia intensiva
Caracterização farmacológica do peptídeo de veneno de aranha altamente seletivo para Na(V)1.7, Pn3a
Expressão endógena não canônica do subtipo de canal de sódio dependente de voltagem NaV 1.7 pela linhagem celular de rabdomiossarcoma TE671
A proteína RING finger 121 facilita a degradação e a localização na membrana dos canais de sódio dependentes de voltagem
Regulação dos canais de sódio dependentes de voltagem neuronais pelas ubiquitina-proteína ligases Nedd4 e Nedd4-2
Ferramentas para análise e deleção condicional de subconjuntos de neurônios sensoriais
As dispaninas: uma nova família de genes de origem antiga que contém 14 membros humanos
Uma nova topologia da proteína transmembrana rica em prolina 2 (PRRT2): indícios de uma função intracelular na sinapse
Duan, X. et al. Topologia de membrana do regulador de tráfego de GLUT4 1 (TRARG1). Biochemistry57, 3606–3615 (2018). .
Classificação não tendenciosa de tipos de neurônios sensoriais por sequenciamento de RNA de célula única em larga escala
Arquitetura molecular do sistema nervoso de camundongos
Ensaio de ligação por proximidade (PLA)
Yin, K., Baillie, G. J. & Vetter, I. Linhagens celulares neuronais como modelo de neurônios do gânglio da raiz dorsal: uma comparação transcriptômica. Mol. Pain12, 10.1177/1744806916646111 (2016).
O movimento do sensor de voltagem do domínio IV é suficiente e limitante da taxa para a inativação rápida em canais de sódio
Caracterização de Tusc5, um gene de adipócito coexpresso em neurônios periféricos
Identificação de possíveis genes a jusante necessários para a extensão de axônios periféricos em neurônios sensoriais primários
O sequenciamento do exoma identifica mutações de truncamento em PRRT2 que causam discinesia cinesigênica paroxística
Mutações em PRRT2 causam epilepsia infantil familiar benigna e convulsões infantis com síndrome de coreoatetose
Mutações em PRRT2 causam enxaqueca hemiplégica
PRRT2 modula o influxo de Ca(2+) pré-sináptico ao interagir com canais do tipo P/Q
Mapeamento das interações proteicas do canal de sódio Na(V)1.7 utilizando camundongos com genes direcionados e marcados por epítopo
Organização do canal de sódio dependente de voltagem em neurônios: interações proteicas e vias de tráfego
Uma ligação dissulfeto estabiliza o bloqueio dos canais de sódio pela conotoxina muO §-GVIIJ
A coexpressão das subunidades Na(V)beta altera a cinética de inibição dos canais de sódio dependentes de voltagem por mu-conotoxinas bloqueadoras do poro
Sensações dolorosas distintas dependentes de Nav1.7 requerem diferentes conjuntos de neurônios sensoriais e simpáticos
A deleção gênica específica de nociceptores revela um papel importante para Nav1.7 (PN1) na dor aguda e inflamatória
A deleção de PIK3C3/Vps34 em neurônios sensoriais causa neurodegeneração rápida ao interromper a via endossomal, mas não a autofágica
A nova atividade da carbamazepina como moduladora de ativação se estende das mutações do NaV1.7 ao canal mutante NaV1.8-S242T de um paciente com neuropatia diabética dolorosa
O canal de sódio dependente de voltagem Na(v)1.9 é um efetor da hipersensibilidade à dor inflamatória periférica
Gilding, E. K. et al. Peptídeos neurotóxicos do veneno da gigante árvore urticante australiana. Sci. Adv.6, 10.1126/sciadv.abb8828 (2020).
Goebel, A. et al. Transferência passiva de sintomas de fibromialgia de pacientes para camundongos. J. Clin. Invest.131, 10.1172/JCI144201 (2021).
Peptídeos neurotóxicos e citotóxicos estão por trás das picadas dolorosas da urtiga arbórea Urtica ferox
A inativação lenta diferencial e a inibição dependente de uso dos canais Nav1.8 contribuem para propriedades de disparo distintas em neurônios DRG IB4+ e IB4-
Dissecção molecular da citotoxicidade do veneno da água-viva caixa destaca um antídoto eficaz contra o veneno
MAGeCK permite a identificação robusta de genes essenciais a partir de triagens de knockout CRISPR/Cas9 em escala genômica