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pmid: "39135739"
title: "Biscoitos de Milho Sem Glúten Incorporados com Farinha de Folha de Urtiga: Efeito nas Propriedades Físicas, Estabilidade de Armazenamento e Benefícios à Saúde."
authors: "Tanyitiku MN, Bessem P, Petcheu ICN"
journal: "International journal of food science"
pubdate: "2024"
doi: "10.1155/2024/8864560"
source: "PMC Full Text"

Biscoitos de Milho Sem Glúten Incorporados com Farinha de Folha de Urtiga: Efeito nas Propriedades Físicas, Estabilidade de Armazenamento e Benefícios à Saúde.

Autores

Tanyitiku MN, Bessem P, Petcheu ICN

Periodico

International journal of food science (2024)

Conteudo

Biscoitos de Milho sem Glúten Incorporados com Farinha de Folhas de Urtiga: Efeito nas Propriedades Físicas, Estabilidade de Armazenamento e Benefícios para a Saúde

O consumo de biscoitos de milho sem glúten está se tornando muito popular entre indivíduos não celíacos e celíacos. No entanto, a ausência de glúten e outros nutrientes no milho geralmente leva a biscoitos de menor qualidade em termos de valor nutricional, textura, cor e vida de prateleira. Para melhorar as características de qualidade dos biscoitos de milho, este estudo investigou o efeito da incorporação de uma erva subutilizada (folhas de Urtica dioica L.) em suas propriedades nutricionais e físicas. A farinha de folhas de urtiga foi incorporada em diferentes níveis (5%, 10%, 15% e 20%) e comparada com um controle (biscoitos 100% milho). A estabilidade de armazenamento dos biscoitos de milho formulados também foi investigada à temperatura ambiente e congelada (−18 ± 2 °C). A incorporação de farinha de folhas de urtiga aumentou (p < 0,05) o teor de cinzas e proteína dos biscoitos de milho de 0,32% (controle) para 2,56% (incorporação de 20% de farinha de folhas de urtiga) e de 6,44% (controle) para 21,52% (incorporação de 20% de farinha de folhas de urtiga), respectivamente. Após a digestão in vitro do amido, o conteúdo fenólico total (CFT) e a atividade antioxidante (AA) também aumentaram aproximadamente 27 e sete vezes, respectivamente, e o índice glicêmico estimado (IG) (IGe) diminuiu (p < 0,05) de 48,60% (controle) para 33,18% (20% de urtiga incorporada). As características de vida de prateleira (atividade de água, índice de peróxido (IP) e contagem microbiana) dos biscoitos de milho formulados permaneceram dentro dos limites aceitáveis para consumo humano após armazenamento por 6 meses. Os achados indicaram que as folhas de urtiga podem servir como um potencial ingrediente alimentício em produtos de panificação sem glúten, particularmente onde alimentos com baixo IG são desejáveis.

1. Introdução

A doença celíaca afeta mais de 1% das pessoas na maioria dos grupos étnicos em todo o mundo. Ocorre quando uma dieta com glúten ingerido causa inchaços na camada mucosa do intestino delgado, levando a condições de saúde como atrofia das vilosidades, diarreia e dor abdominal crônica, entre outras. Atualmente, seu único tratamento é a abstinência completa da proteína do glúten, encontrada naturalmente em alimentos como trigo, centeio e cevada. De acordo com a Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA, os alimentos rotulados como "sem glúten" devem conter menos de 20 partes por milhão de glúten, uma quantidade pequena demais para causar danos a pacientes celíacos.
O milho é o cereal sem glúten mais abundante devido ao seu crescente potencial genético e rendimento de colheita. É amplamente consumido como alimento básico ou processado em diversos produtos extrusados e de panificação, incluindo biscoitos. Na verdade, os biscoitos são um alimento diário para todas as faixas etárias, pois são deliciosos, vendidos a preços razoáveis e fáceis de transportar para qualquer ocasião. No entanto, ao contrário dos biscoitos tradicionais de trigo, as massas feitas exclusivamente com farinha de milho são limitadas na formação de redes viscoelásticas e coesivas de glúten desejáveis. Isso frequentemente leva a grandes problemas de panificação, como textura esfarelenta, cor ruim, baixo volume específico e vida útil mais curta. Com isso, os cientistas de alimentos estão buscando novos ingredientes alimentícios que forneçam nutrientes, textura e propriedades sensoriais adequados sem glúten a custos mais baixos para os consumidores.

A urtiga (Urtica dioica L.) é uma erva perene abundante e nutritiva que foi encontrada crescendo na Ásia temperada e tropical, Europa, América do Norte e África. Na verdade, elas contêm compostos bioativos essenciais com propriedades antioxidantes, antimicrobianas, antiúlcera e anti-inflamatórias. Embora as urtigas sejam geralmente consideradas um ingrediente-chave na medicina tradicional ou como ervas daninhas tenazes com picadas urticantes quando tocadas em terras agrícolas e/ou caminhos, alguns estudos recentemente se concentraram no impacto da adição de farinha de folhas de urtiga em produtos de panificação de trigo. Por exemplo, foi relatado que a incorporação de chá de folhas de urtiga no pão de trigo causa uma diminuição na perda de cozimento e no volume do pão, bem como um aumento no índice de porosidade da farinha de rosca de ervas. No entanto, não há dados indicando seus atributos de qualidade, benefícios à saúde e propriedades de vida útil em alimentos sem glúten.

Para contribuir com a crescente demanda e disponibilidade de alimentos saudáveis sem glúten, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da incorporação de farinha de folhas de urtiga em diferentes níveis (5%, 10%, 15% e 20%) na preparação de biscoitos de milho. Além disso, a estabilidade de armazenamento dos biscoitos de milho formulados foi investigada em temperatura ambiente (25 ± 2°C) e congelada (−18 ± 2°C). Um controle (biscoitos 100% milho) foi utilizado para comparar as propriedades nutricionais, físicas e de armazenamento.

2. Materiais e Métodos

2.1. Matérias-Primas

Milho amarelo orgânico (Zea mays L.) foi obtido do Instituto de Pesquisa Agrícola para o Desenvolvimento (IRAD), Yaoundé (Camarões). Folhas de urtiga (Urtica dioica L.) foram colhidas em hortas selecionadas em Buea (Camarões). Outros ingredientes, margarina Jadida light (Jadida, Med Oil, Camarões), sal iodado (Saselsa, Camarões), açúcar granulado (SOSUCAM, Camarões), leite em pó semidesnatado (Nestlé NIDO, Reino Unido), bicarbonato de sódio 98% (ALSA, Camarões) e ovos de tamanho médio (grau 6), foram adquiridos em supermercados locais. Todos os produtos químicos e reagentes utilizados eram de grau analítico.

2.2. Processamento de Sementes de Milho e Folhas de Urtiga em Farinha
Milho amarelo e folhas de urtiga foram processados em farinha, conforme mostrado na Figura 1.
Sementes de milho amarelo orgânico (2 kg) foram separadas manualmente de pedras e sementes partidas. As sementes foram então moídas usando um moinho elétrico (Atabong Ets, Camarões) para obter farinha de milho amarelo moída em pedra (tamanho de grão: 452 ± 12,68 μm).
A urtiga (Urtica dioica L.) foi identificada por suas características morfológicas, incluindo folhas verdes, peludas, brilhantes e vibrantes, com bordas fortemente serrilhadas e nervuras claramente visíveis. As folhas foram cortadas manualmente dos caules usando uma tesoura de poda estéril e colocadas em sacos de polietileno estéreis. As amostras foram transportadas para o laboratório em bolsas de gelo e processadas em até 1 h. A farinha de folhas de urtiga foi processada conforme descrito por Tanyitiku e Njombissie Petcheu. Folhas de urtiga recém-colhidas (25 g) foram enxaguadas uma vez em 225 mL de água deionizada, escorridas e trituradas usando um liquidificador de imersão (Breville, Austrália; velocidade de corte, 30–40 mm/s; ângulo de afiação da lâmina, 45°; e tempo de trituração, 5–10 s). As folhas trituradas foram congeladas a −18°C por 28 h e secas usando um liofilizador doméstico (Harvest Right, Estados Unidos) ajustado a −40°C por 30 h. As folhas de urtiga secas foram então moídas e peneiradas usando uma peneira de aço inoxidável ASTM E11 de 400 μm para obter farinha de folhas de urtiga.
2.3. Preparação dos Biscoitos
Os biscoitos foram preparados de acordo com a AACC, conforme mostrado na Figura 1. Cada formulação consistiu em farinha de milho e ingredientes constantes em cada formulação (margarina: 40 g, açúcar: 30 g, leite: 20 g, sal: 1 g, bicarbonato de sódio 98%: 1 g, água deionizada: 20 mL e um ovo médio). Farinha de folhas de urtiga foi adicionada em diferentes níveis para obter quatro tratamentos, como segue: 5NC (95 g de farinha de milho + 5 g de farinha de folhas de urtiga), 10NC (90 g de farinha de milho + 10 g de farinha de folhas de urtiga), 15NC (85 g de farinha de milho + 15 g de farinha de folhas de urtiga) e 20NC (80 g de farinha de milho + 20 g de farinha de folhas de urtiga). O controle consistiu em 100 g de farinha de milho + 0 g de farinha de folhas de urtiga. Os ingredientes secos foram misturados por 3 min usando uma batedeira elétrica (Breville, Austrália), girando a 10.000 rpm, seguido pela adição dos ingredientes úmidos até formar uma massa. Cada mistura foi enrolada em uma tábua de corte e moldada em biscoitos (5,67 ± 0,04 cm de diâmetro) usando um cortador de biscoitos (tamanho: 9,5 × 7,5 cm). Os biscoitos foram então colocados uniformemente em assadeiras, assados em forno pré-aquecido (Miele, Alemanha) a 180°C por 10 min e deixados esfriar à temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, cada biscoito formulado foi armazenado em sacos de polietileno etiquetados (500 g por saco) e mantido a 4°C durante a análise.
2.4. Composição Centesimal das Folhas de Urtiga e dos Biscoitos de Milho
O teor de cinzas totais, umidade, proteína e gordura foi obtido de acordo com a AOAC. As cinzas totais corresponderam ao resíduo remanescente quando 10 g de cada amostra foram calcinados a 550°C por 24 h. A umidade foi a diferença de peso quando 5 g de cada amostra foram secos em estufa a 105°C por 24 h. A proteína bruta foi determinada pelo método Kjeldahl com fator de conversão de 6,25. O teor de gordura foi determinado pelo método de extração por solvente Soxhlet utilizando éter de petróleo. Para o teor de amido, o amido digestível e resistente foi medido utilizando o kit de ensaio de amido digestível e resistente Megazyme (Megazyme International, Irlanda), de acordo com as diretrizes do fabricante.
2.5. Textura da Massa e dos Biscoitos
A textura da massa e dos biscoitos formulados foi medida utilizando um analisador de textura TA.XT Plus (Stable Micro Systems, Reino Unido). Foi equipado com um suporte de flexão de três pontos (HDP/3 PB) com configuração de 30 kg de força em modo de compressão, distância de 5 mm, velocidade de teste de 0,5 mm/s e força de gatilho de 5 g. Após oito medições por formulação, a dureza (força de pico) foi determinada como a resistência máxima de cada massa ou biscoito à lâmina de borda arredondada, e isso ocorreu quando a amostra começou a quebrar.
2.6. Perfil de Cor
A cor dos biscoitos foi medida utilizando um espectrofotômetro HunterLab MiniScan EZ (Hunter Associates Laboratory, Estados Unidos), após cinco leituras por formulação. As coordenadas de cor (L∗, a∗ e b∗) foram interpretadas como L∗ = luminosidade ou escuridão, a∗ = vermelho a verde (+a = mais vermelho, −a = mais verde) e b∗ = amarelo a azul (+b = mais amarelo, −b = mais azul). A diferença total de cor, ΔE, entre cada amostra e um branco (azulejo branco calibrado) foi obtida conforme a seguir.
2.7. Razão de Espalhamento e Perda por Cozimento
A razão de espalhamento foi calculada dividindo o diâmetro de três conjuntos de biscoitos pela sua espessura (altura). Além disso, os biscoitos foram pesados imediatamente após modelados (W0) e depois após o cozimento no forno (W1). A porcentagem de perda por cozimento foi calculada conforme a seguir.
2.8. Teor de Fenólicos Totais (TPC) e Atividade Antioxidante (AA)
TPC e AA foram medidos nos biscoitos antes e após a digestão in vitro (ver Seção 2.9) de acordo com Tanyitiku e Njombissie Petcheu. Tanto TPC quanto AA foram medidos antes e após a digestão in vitro, pois estudos recentes mostraram que os polifenóis em particular podem se ligar ao amido ou às enzimas digestivas do amido e reduzir a digestibilidade do amido tanto in vitro quanto in vivo.
A extração da amostra foi realizada antes de cada análise. Cada amostra moída (2 g) foi misturada com 10 mL de etanol 80%. Sob condições de escuridão, a mistura foi incubada em uma incubadora com agitação (Thermo Scientific, Estados Unidos) a 25°C, 150 rpm por 24 h, e depois centrifugada a 10.000 g por 10 min. O sobrenadante foi coletado, e o sedimento remanescente foi misturado com outros 10 mL de etanol 80% e extraído novamente. Os sobrenadantes coletados foram combinados e filtrados usando papel de filtro Whatman nº 4. Os extratos das amostras foram utilizados para os ensaios de AA e fenóis.
TPC foi medido por colorimetria usando reagente Folin–Ciocalteu (FC). Cada extrato de amostra (0,5 mL) foi misturado com 5 mL de água deionizada e 5 mL de reagente fenólico FC por 3 min. Em uma incubadora agitadora, 2 mL de Na2CO3 a 10% foram adicionados, agitados e incubados a 30°C por 1 h. A absorbância a 765 nm foi medida usando um espectrofotômetro Hitachi (Tóquio, Japão) com ácido gálico (40–200 mg/L de ácido gálico) como padrão. Os resultados foram expressos como miligrama de equivalente de ácido gálico (GAE) por grama de amostra seca.

AA foi estimada usando um ensaio de sequestro de radicais livres DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila). Cada extrato de amostra (0,2 mL) foi misturado com 2,5 mL de solução de DPPH (0,35 mM de DPPH dissolvido em etanol 50%) e incubado em temperatura ambiente por 10 min. A absorbância a 517 nm foi medida, e a AA foi calculada como porcentagem de inibição com solução de Trolox (100–1000 μM) como padrão. Os resultados foram expressos como micromol de equivalentes de Trolox/grama de peso seco.

2.9. Índice Glicêmico (IG) Estimado (IGe)
O IGe foi determinado conforme modificado por Simons, Hall e Tulbek. Cada amostra (100 mg) foi misturada com 5 mL de etanol (80% v/v) em um tubo de ensaio e incubada a 80 ± 3°C por 5 min. Outros 5 mL de etanol foram adicionados ao tubo e centrifugados a 3000 rpm (1174 × g) por 10 min, e o sobrenadante foi descartado. A amostra foi então ressuspensa em 10 mL de etanol e novamente centrifugada a 3000 rpm (1174 × g) por 10 min. Subsequentemente, o resíduo foi digerido adicionando α-amilase usando o protocolo do kit de amido resistente Megazyme (Megazyme International, Irlanda). Cada amostra foi colocada em uma incubadora agitadora, ajustada a 37°C, e digerida por 30, 60, 90, 120, 150 e 180 min. As reações foram interrompidas adicionando 4 mL de etanol a 99%.

A quantidade de glicose liberada do amido em cada intervalo foi determinada por espectrofotometria a 510 nm usando o reagente glicose oxidase-peroxidase (GOPOD) do kit de amido resistente Megazyme. O índice de hidrólise (IH) foi calculado dividindo a área sob a curva de hidrólise pela referência (pão branco). O IGe foi calculado conforme a seguir. onde IGe é o IG.

2.10. Estabilidade de Armazenamento em Temperatura Ambiente e Congelada
A estabilidade de armazenamento foi avaliada medindo a atividade de água (aw), o índice de peróxido (PV) e a contagem microbiana (contagem padrão em placas (APC), leveduras e bolores) das amostras de biscoito armazenadas.
Cada formulação de biscoito (500 g) foi pesada e colocada em sacos de polietileno herméticos separados (volume: 1000 mL, espessura: 98 mícrons, e permeabilidade ao vapor de água: 1 g/m2). Baseado em Garden-Robinson, três sacos separados por formulação foram armazenados por 6 meses em duas condições de armazenamento: temperatura ambiente em um armário de madeira e congelado a −18 ± 2°C (Haier, China). Cada saco foi amostrado duas vezes durante todo o experimento, três amostras por formulação foram retiradas a cada mês, descongeladas por 1 h (para amostras congeladas) e moídas (12.000 rpm por 6 min) usando um mini liquidificador magic bullet (Nutribullet, Reino Unido). O liquidificador foi lavado e limpo entre as amostras para evitar contaminação cruzada.

A atividade de água foi medida usando um medidor de atividade de água (Aqualab, Estados Unidos), de acordo com as diretrizes do fabricante. O PV foi medido de acordo com a AOAC por titulação. Cada amostra (5 g) foi dissolvida em 30 mL de solução de ácido acético glacial e clorofórmio (60:40 v/v) e incubada em uma incubadora com agitação por 2 h. A solução foi filtrada com papel de filtro Whatman No. 1. Em seguida, 30 mL de ácido acético glacial e 0,5 mL de iodeto de potássio saturado foram adicionados a 20 mL do filtrado e deixados em repouso por 30 min. Cinquenta mililitros de água deionizada e 2–3 gotas de solução de amido a 1% foram então adicionados e titulados com tiossulfato de sódio 0,01 N com agitação vigorosa até um ponto final incolor. O PV (miliequivalente por quilograma) foi obtido da seguinte forma.

APC, leveduras e bolores foram enumerados usando técnicas padrão de cultivo microbiano. Cada amostra (25 g) foi homogeneizada em 225 mL de água peptonada tamponada estéril (BPW) usando um stomacher. Em seguida, diluições seriadas (10−1–10−6) usando 1 mL de homogeneizado em 9 mL de BPW foram preparadas. Para APC, as amostras foram então cultivadas em ágar para contagem em placas (Oxoid, Reino Unido) a 37°C por 48 h. Leveduras e bolores foram enumerados plaqueando as diluições em Ágar Batata Dextrose Rosa Bengala (Oxoid, Reino Unido) a 25°C por 5 dias. As colônias foram contadas visualmente e os resultados obtidos foram expressos em log10UFC/g.

2.11. Análise Estatística

Salvo especificação, os experimentos foram realizados em triplicata e analisados usando IBM SPSS Statistics 23. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, e as diferenças de médias foram determinadas usando ANOVA. Quando diferenças significativas (p < 0,05) entre as médias foram observadas, as médias foram separadas usando o teste de Tukey.

3. Resultados

3.1. Composição da Amostra de Biscoito
A composição centesimal dos biscoitos de milho formulados e da farinha de folhas de urtiga é apresentada na Tabela 1. A adição de farinha de folhas de urtiga não afetou (p < 0,05) o teor de umidade e de amido resistente dos biscoitos de milho formulados. Os teores de cinzas e proteínas aumentaram de 0,32% (controle) para 2,56% (20% de urtiga incorporada) e de 6,44% (controle) para 21,52% (20% de urtiga incorporada), respectivamente. Por outro lado, o teor de gordura e de amido digestível diminuiu de 2,13% (controle) para 1,81% (20% de farinha de folhas de urtiga) e de 31,89% (controle) para 27,31% (20% de urtiga incorporada), respectivamente.
3.2. Características Físicas dos Biscoitos de Milho
A massa do controle era mais dura (978,87 gf), e a dureza diminuiu significativamente (p <0,05) para 489,34 gf (biscoitos de milho com 20% de urtiga) após a incorporação da farinha de urtiga (Tabela 2). Antes do cozimento, a dureza das amostras com 15% e 20% de urtiga foi significativamente (p < 0,05) menor do que a dos biscoitos de milho controle. Após o cozimento, o controle manteve a maior dureza (1706,54 gf), enquanto os biscoitos com 15% de urtiga enriquecida apresentaram a menor dureza (1326,63 gf). A perda por cozimento pode estar correlacionada com a dureza dos biscoitos, pois também foi maior para o controle (8,98%) e variou entre 6,93% e 8,23% para os biscoitos de milho enriquecidos com urtiga. Da mesma forma, os biscoitos de milho controle apresentaram maior diâmetro (36,31 mm) e fator de espalhamento (10,53), que diminuíram significativamente (p < 0,05) com a incorporação de farinha de folhas de urtiga.
Os valores de L∗, a∗ e b∗ diminuíram com o aumento da incorporação de farinha de folhas de urtiga, indicando maior luminosidade, vermelhidão e amarelidão para o controle do que para os biscoitos de milho enriquecidos com urtiga. A luminosidade diminuiu de 54,93 (controle) para 42,73 (biscoitos com 20% de urtiga), sendo os biscoitos de milho com 20% de urtiga observados como os mais escuros. O aumento da farinha de folhas de urtiga nos biscoitos de milho aumentou sua esverdeamento (valores de −a∗) em relação ao biscoito de milho controle mais avermelhado (a∗ = +0,21). Além disso, o controle foi o biscoito mais amarelo (b∗ = 23,51), e a amarelidão diminuiu significativamente (p < 0,05) para b∗ = 23,51 (20% de urtiga) com o aumento da substituição por farinha de folhas de urtiga. Valores positivos adicionais para ΔL∗, Δa∗ e Δb∗ indicaram que todos os biscoitos de milho formulados eram mais brilhantes, mais avermelhados e mais amarelados, respectivamente, do que o ladrilho branco calibrado de referência (L∗ = 81,79, a∗ = 1,08 e b∗ = 7,66). Os valores de ΔE diminuíram significativamente com o aumento da substituição por farinha de folhas de urtiga e variaram entre 6,11 (15% de urtiga) e 9,68 (controle).
3.3. TPC e AA dos Biscoitos
Os valores de AA e TPC dos biscoitos de milho enriquecidos com urtiga antes e após a digestão são apresentados na Tabela 3. Tanto os valores de AA quanto de TPC de todos os biscoitos de milho formulados aumentaram após a digestão in vitro. Com exceção dos biscoitos de milho com 5% de urtiga, os valores de TPC foram significativamente (p < 0,05) diferentes. Em particular, o TPC para biscoitos de milho com 20% de urtiga aumentou antes da digestão (120,32 mg GAE/g), e esse aumento foi ainda maior, cerca de 27 vezes após a digestão, quando comparado aos biscoitos de milho controle.
3.4. Hidrólise do Amido e eGI
A hidrólise do amido de todos os biscoitos de milho formulados pode ser dividida em três fases — um aumento acentuado no amido hidrolisado durante os primeiros 30 min e um ligeiro aumento até 60 min, que depois se estabilizou até 180 min de digestão in vitro (Figura 2). Com isso, todos os valores de IG foram estatisticamente (p < 0,05) diferentes entre si, e o controle foi o mais alto (eGI = 48,60), enquanto os biscoitos de milho com 20% de urtiga foram os mais baixos (eGI = 33,18) (Tabela 3). Especificamente, os valores de eGI reduziram gradualmente em 2%, 11%, 12% e 15% com o aumento da incorporação de 5%, 10%, 15% e 20% de farinha de folhas de urtiga, respectivamente.
3.5. Estabilidade de Armazenamento dos Biscoitos de Milho Formulados
A atividade de água (aw) das amostras de biscoitos é apresentada na Figura 3. No Dia 0, a aw dos biscoitos de milho formulados era baixa e diminuiu (p < 0,05) após a incorporação de farinha de folhas de urtiga. Os biscoitos de milho controle apresentaram a maior aw (0,51) e os biscoitos de milho com 20% de urtiga a menor (aw = 0,31). Durante o armazenamento dos biscoitos, todos os valores de aw permaneceram constantes durante o primeiro mês, tanto em condições de armazenamento em temperatura ambiente quanto congelado. À temperatura ambiente, a aw dos biscoitos de milho com 5% e 15% de urtiga aumentou a partir do segundo mês, enquanto os biscoitos de milho controle, 10% e 20% não foram afetados até o terceiro mês de medição da aw. Entre o segundo e o terceiro mês, a aw aumentou significativamente para todos os biscoitos formulados, com os biscoitos de milho com 5% de urtiga (aw inicial = 0,35) excedendo os biscoitos de milho com 10% de urtiga (aw inicial = 0,40). Para os biscoitos de milho congelados, foi observado um aumento semelhante na aw. No entanto, exceto pelos biscoitos controle e com 15% de urtiga, que aumentaram a partir do primeiro mês de armazenamento, a aw dos biscoitos enriquecidos com 5%, 10% e 20% de urtiga permaneceu constante até o quarto mês de armazenamento.
Além disso, biscoitos armazenados foram amostrados mensalmente e cultivados para bactérias viáveis, leveduras e bolores. A Figura 4 apresenta a média de APC dos biscoitos formulados durante 6 meses de armazenamento em temperatura ambiente e congelada, respectivamente. As temperaturas de armazenamento afetaram significativamente o crescimento bacteriano, com maior crescimento observado em temperatura ambiente do que a −18 ± 2°C. Em temperatura ambiente, nenhum crescimento bacteriano foi observado durante o primeiro mês de armazenamento. A partir do segundo mês, um aumento gradual de bactérias viáveis foi observado, com os biscoitos controle apresentando o maior crescimento (4,21 log10 UFC/g) e os biscoitos de milho enriquecidos com 20% de urtiga apresentando o menor (0,80 log10 UFC/g) ao final de 6 meses. Para as amostras congeladas, o crescimento bacteriano foi observado apenas após 3 meses de armazenamento e especificamente no quarto mês para os biscoitos enriquecidos com 20% de urtiga. Assim como em temperatura ambiente, o controle foi o mais alto (1,4 log10 UFC/g) enquanto os biscoitos de milho enriquecidos com 20% de urtiga foram os mais baixos (0,24 log10 UFC/g) na contagem bacteriana total.

Assim como o crescimento bacteriano, uma contagem maior de leveduras e bolores foi registrada em temperaturas ambiente do que quando congeladas (Figura 5). Da mesma forma, nenhum crescimento foi observado durante o primeiro mês de armazenamento em ambas as temperaturas. No segundo mês, o crescimento foi observado em todas as amostras de biscoitos armazenadas em temperatura ambiente e os biscoitos de milho com 10% de urtiga apresentaram o maior crescimento (8,50 log10 UFC/g) ao final de 6 meses. Assim como a atividade de água, os biscoitos de milho com 20% de urtiga permaneceram os mais baixos quando armazenados em temperatura ambiente (5,50 log10 UFC/g) e congelada (0,24 log10 UFC/g).

Além disso, os PVs aumentaram com o tempo e a temperatura de armazenamento (Figura 6). No Dia 0, o PV do controle foi o mais alto (0,71 meq/kg) enquanto o de 20% de urtiga foi o mais baixo (0,30 meq/kg). Em temperatura ambiente, o PV continuou a aumentar até o final de 6 meses, com 5% e 10% de urtiga ultrapassando o controle para 2,90 meq/kg e 2,81 meq/kg, respectivamente. Os biscoitos de milho com 20% de urtiga permaneceram os mais baixos com 2,22 meq/kg. Por outro lado, o PV para as amostras de biscoitos congeladas aumentou de forma constante até o final de 6 meses, com pequenas variações entre cada amostra de biscoito.

4. Discussão
   A incorporação de farinha de folhas de urtiga melhorou as características nutricionais, físicas e de vida útil de biscoitos de milho sem glúten. Em particular, os teores de cinzas e proteínas foram duas e quatro vezes maiores que o controle, respectivamente. Esse aumento pode ser devido ao maior teor de cinzas (11,23%) e proteínas (34,76%) das folhas de urtiga. Man et al. relataram um aumento no teor de proteínas e cinzas quando a farinha de folhas de urtiga foi incorporada ao pão de trigo. Da mesma forma, Amadi registrou um aumento no teor de proteínas (13,44%–17,03%) e cinzas (3,40%–4,84%) em biscoitos de trigo enriquecidos com farinha de folhas de moringa. Por outro lado, os resultados mostraram uma diminuição (p < 0,05) no amido digestível, o que pode ter ocorrido devido à incorporação de farinha de folhas de urtiga com menor teor de amido digestível (8,20%). O teor de gordura também diminuiu ligeiramente, e o efeito não foi (p < 0,05) significativo. Maietti et al. relataram uma diminuição semelhante no teor de gordura (2,51–2,13 g/100 g) em pão de trigo enriquecido com urtigas. Em contraste, Hasrini, Aviana e Khoiriyah relataram um aumento significativo no teor de gordura (33,9 ± 0,93%–38,1 ± 1,2%) quando folhas de ervas como couve, moringa e katuk foram incorporadas em biscoitos de farinha de mandioca modificada (mocaf).

Os biscoitos de milho enriquecidos com urtiga pareceram produzir biscoitos mais macios (menor dureza) do que o controle. Evdokimova et al. relataram um aumento no índice de viscosidade de 25,3%, 39,2% e 42,6% na massa de trigo quando a farinha de urtiga foi incorporada a 1%, 2% e 3%, respectivamente. Assim, um biscoito mais macio nesta pesquisa indicou que a viscosidade da massa de milho enriquecida com urtiga pode ter permanecido estável durante o cozimento. Sahagún e Gómez relataram dureza semelhante de biscoitos quando ervilhas, batatas e proteína do soro do leite foram incorporadas em biscoitos de farinha de milho (8,41% de umidade, 4,58% de proteína). Da mesma forma, Tarasevičienė et al. relataram aumento da maciez após a adição de farinha de bagaço de framboesa, groselha vermelha e morango em biscoitos de trigo. Em contraste, Swapnil et al. relataram um aumento na dureza dos biscoitos (de 4,567 para 6,432 N) após a incorporação de pó de folha de moringa. Além disso, isso foi correlacionado com a diminuição do glúten, que geralmente forma redes viscoelásticas durante a hidratação da farinha de trigo.
Durante o cozimento, a perda durante o cozimento constitui a perda de água e material orgânico. Mudanças na dimensão dos biscoitos são observadas devido à espalhabilidade da farinha, à ação do agente de fermentação e à influência do calor e dos açúcares dissolvidos. No mesmo processo, uma mudança na cor do biscoito pode ocorrer devido às reações de Maillard entre açúcares redutores e a cadeia lateral de aminoácidos da lisina e durante a oxidação e caramelização de pigmentos e fenólicos da urtiga. A perda durante o cozimento e o espalhamento do biscoito foram maiores no controle e diminuíram (p < 0,05) com a incorporação de farinha de folha de urtiga. Wójcik et al. e Man et al. também relataram uma diminuição no volume do pão de trigo com a incorporação de farinha de folha de urtiga. Isso foi atribuído ao aumento da diluição do teor de glúten de trigo, bem como às interações entre os componentes de fibra, água e glúten do pão formulado. Assim como nesta pesquisa, Stamatovska et al. registraram mudanças de cor muito visíveis (ΔE > 6) em biscoitos feitos com 70% de farinha de cevada (ΔE = 10,89), 100% de farinha de cevada (ΔE = 9,09) e 100% de farinha de trigo (ΔE = 7,47) após 5–7 min de cozimento. Uma diminuição semelhante nos valores de L∗, a∗ e b∗ foi relatada em bolo esponjoso enriquecido com pó de folha de urtiga. A variação na cor do biscoito neste estudo indicou fortemente que os valores de L∗, a∗ e b∗ foram grandemente influenciados pelo betacaroteno nas sementes de milho amarelo e pelo pigmento verde clorofila nas urtigas.

Além disso, um aumento significativo (p < 0,05) nos valores de TPC e AA foi observado antes e depois da digestão in vitro. Maietti et al. relataram um aumento semelhante nos valores de TPC e AA de 372 μgGAE/g (pão branco) para 597 μgGAE/g e de 0,53 mgTE/g (pão branco) para 0,83 mgTE/g, respectivamente, em pão de trigo enriquecido com urtiga. Da mesma forma, Mitrović et al. registraram um teor de fenóis livres significativamente (p < 0,05) maior (2537,18 μg/g) em biscoitos de trigo enriquecidos com semente de urtiga, e isso foi 21,5% maior do que o teor de fenóis dos biscoitos de trigo controle (1991,75 μg/g). Polifenóis e antioxidantes exercem efeitos benéficos em condições de saúde como câncer, diabetes e doenças cardiovasculares, retardando a digestão de carboidratos e a absorção de glicose no intestino delgado. Adhikari, Bajracharya e Shrestha demonstraram que o pó de folha de urtiga continha maior TPC (129 mgGAE/g) e AA (66,3 inibição % do DPPH) do que o trigo (1,3 mgGAE/g e 23,72 inibição % do DPPH) e a cevada (1,7 mgGAE/g e 28,64 inibição % do DPPH), respectivamente. Assim, os achados indicaram fortemente que o consumo de biscoitos de milho sem glúten enriquecidos com urtiga poderia fornecer níveis significativamente mais altos de polifenóis e antioxidantes, levando aos seus benefícios à saúde associados em humanos.
O amido digestível e a taxa de hidrólise do amido das amostras de biscoito controle foram maiores do que os de todos os biscoitos de milho enriquecidos com urtiga. Isso pode ser porque a substituição da farinha de milho por farinha de folhas de urtiga reduziu a quantidade de amido hidrolisado nos biscoitos de milho enriquecidos com urtiga. Além disso, a ação das fibras da urtiga com o amido gelatinizado pode ter levado à formação de uma matriz polimérica que dificultou o ataque da α-amilase durante a digestão in vitro. Correspondentemente, valores de IG esperados significativamente (p < 0,05) menores foram obtidos para os biscoitos de milho enriquecidos com urtiga formulados. Leoro Vernaza et al. relataram uma redução de até 50% no IG quando a fibra de maracujá foi gradualmente incorporada em cereais matinais de milho extrusados. Da mesma forma, Triandita e Putri relataram uma diminuição de 40% no IG quando a farinha de soja preta foi incorporada em biscoitos de milho. O IG esperado indica a rapidez com que o nível de glicose no sangue é afetado após o consumo de alimentos ricos em amido. Alimentos com IG superior a 71 estão associados a doenças degenerativas, como diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares e obesidade. O milho é um alimento rico em amido, e os biscoitos de milho 100% não são exceção por terem um IG mais alto devido ao seu teor de amido (Tabela 1). No entanto, valores de eIG mais baixos nesta pesquisa indicaram que os biscoitos de milho enriquecidos com urtiga podem ser considerados "produtos de baixo IG" com potenciais benefícios à saúde para pacientes diabéticos no controle da liberação de insulina pós-prandial.

Importante, para estimar a vida de prateleira dos biscoitos de milho formulados, a atividade de água, o VP, as bactérias viáveis totais, as leveduras e os bolores durante 6 meses de armazenamento dos biscoitos foram investigados. A vida de prateleira dos biscoitos foi considerada como a duração na qual os biscoitos de milho formulados poderiam ser consumidos com segurança quando armazenados em temperatura ambiente ou congelada. Os resultados da atividade de água foram consistentes com os de Ruszkowska, Tańska e Kowalczewski, que obtiveram atividade de água variando entre 0,311 e 0,386 quando o pó de grilo foi incorporado em snacks de milho extrusados. Em contraste, Mitrevski et al. relataram uma diminuição na atividade de água de 0,501 para 0,347 quando biscoitos de farinha de espelta enriquecidos com 20% de beterraba foram armazenados por 3 meses. A atividade de água é uma medida da água disponível para reações biológicas e indica a vida de prateleira dos produtos alimentícios. Por exemplo, bactérias de deterioração de alimentos normalmente crescem quando aw é maior que 0,91, enquanto bolores e leveduras crescem quando aw é menor que 0,80.
A deterioração microbiana é muito crítica para limitar a textura, cor, sabor e vida útil dos alimentos. De fato, o limite microbiano máximo em produtos de panificação (bolo, pão, biscoitos e bolachas) é < 105 UFC/g para contagem total de placas e < 104 UFC/g para leveduras e bolores. Para manter a qualidade e a vida útil dos biscoitos, Garden-Robinson recomenda armazenamento por 3 semanas em temperatura ambiente ou 6 meses quando congelados. Nesta pesquisa, nenhum crescimento microbiano foi observado durante o primeiro mês de armazenamento em ambas as condições, indicando que os biscoitos armazenados em temperatura ambiente estavam dentro dos limites aceitáveis de consumo ao final de 1 mês. Posteriormente, o início mínimo de crescimento microbiano no segundo e terceiro meses de armazenamento congelado dos biscoitos também indicou que os biscoitos de milho formulados estavam dentro dos limites aceitáveis para consumo humano.
Em termos de PV, Asadi, Khan e Zaidi relataram um aumento semelhante no PV (1,04–4,98 meq/kg) quando pós de folhas de beterraba foram incorporados em biscoitos de trigo e armazenados por 15 meses. Isso foi atribuído a um aumento na migração de oxigênio para dentro da embalagem, resultando em oxidação de gordura e leve rancificação. Da mesma forma, Kaur, Choudhary e Sharma relataram um aumento de 0,65 e 0,50 meq/kg para 3,60 e 3,74 meq/kg em biscoitos de trigo doces quando armazenados por 90 dias em condições embaladas e desembaladas, respectivamente. Não obstante, os PVs de todos os biscoitos de milho formulados armazenados tanto em temperatura ambiente quanto congelada estavam dentro dos limites permitidos recomendados de < 10 meq/kg.
Embora mais pesquisas sejam necessárias para entender as propriedades reológicas, de viscosidade e estruturais dos biscoitos de milho incorporados com farinha de folhas de urtiga, uma baixa atividade de água, contagem microbiana e PVs indicaram que os biscoitos de milho sem glúten formulados nesta pesquisa poderiam manter sua qualidade e características de vida útil dentro das condições recomendadas de armazenamento em temperatura ambiente e congelamento.
5. Conclusões
Biscoitos de milho sem glúten com características nutricionais, físicas e de armazenamento melhoradas foram desenvolvidos. Especificamente, a substituição da farinha de milho por farinha de folhas de urtiga produziu biscoitos com IG esperado aproximadamente 15 vezes menor do que os biscoitos 100% de milho. Embora mais pesquisas sejam necessárias para entender as propriedades funcionais, estruturais e sensoriais dos biscoitos de milho sem glúten formulados, esses resultados de pesquisa indicaram fortemente os benefícios nutricionais e potenciais para a saúde das folhas de urtiga, como ingrediente alimentar em produtos de panificação sem glúten.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que suportam as descobertas deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Declaração de Ética
Os autores não têm nada a relatar.
Consentimento
Os autores não têm nada a relatar.
Divulgação
Uma pré-impressão foi publicada anteriormente.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Contribuições dos Autores
M.N.T., P.B. e I.C.N.P. contribuíram para a conceituação e desenho do estudo. M.N.T. e P.B. adquiriram as matérias-primas e realizaram o trabalho laboratorial. I.C.N.P. e P.B. analisaram e interpretaram os resultados. M.N.T. escreveu o primeiro rascunho. Todos os autores revisaram e aprovaram o manuscrito final.
Financiamento
Os autores não receberam financiamento específico para este trabalho.
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Formulação de biscoitos de milho e folhas de urtiga. ∗Para biscoitos de milho incorporados com farinha de folhas de urtiga, 5%, 10%, 15% e 20% da farinha de folhas foram pesados separadamente e adicionados durante a mistura.
Hidrólise do amido de biscoitos durante uma digestão in vitro de 180 min. Os dados são expressos como média ± DP; controle (100% milho), 5NC (95% milho + 5% urtiga), 10NC (90% milho + 10% urtiga), 15NC (85% milho + 15% urtiga) e 20NC (80% milho + 20% urtiga).
Atividade de água de biscoitos de milho armazenados em temperatura ambiente e grau de congelamento: (a) em temperatura ambiente; (b) 18 ± 2°C. Os dados são expressos como média ± DP; controle (100% milho), 5NC (95% milho + 5% urtiga), 10NC (90% milho + 10% urtiga), 15NC (85% milho + 15% urtiga) e 20NC (80% milho + 20% urtiga).
Contagem bacteriana (log10UFC/g) de biscoitos de milho armazenados em temperatura ambiente e grau de congelamento: (a) em temperatura ambiente; (b) 18 ± 2°C. Os dados são expressos como média ± DP; controle (100% milho), 5NC (95% milho + 5% urtiga), 10NC (90% milho + 10% urtiga), 15NC (85% milho + 15% urtiga) e 20NC (80% milho + 20% urtiga).
Contagem de leveduras e bolores (log10UFC/g) de biscoitos de milho armazenados em temperatura ambiente e grau de congelamento: (a) em temperatura ambiente; (b) 18 ± 2°C. Os dados são expressos como média ± DP; controle (100% milho), 5NC (95% milho + 5% urtiga), 10NC (90% milho + 10% urtiga), 15NC (85% milho + 15% urtiga) e 20NC (80% milho + 20% urtiga).
Índice de peróxido (meq/kg) de biscoitos de milho armazenados à temperatura ambiente e temperatura de congelamento: (a) à temperatura ambiente; (b) 18 ± 2°C. Os dados são expressos como média ± DP; controle (100% milho), 5NC (95% milho + 5% urtiga), 10NC (90% milho + 10% urtiga), 15NC (85% milho + 15% urtiga) e 20NC (80% milho + 20% urtiga).

Macronutrientes na farinha de folhas de urtiga e nos biscoitos formulados.
Composição SNLF Controle 5NC 10NC 15NC 20NC Cinzas (%) 11.23 ± 0.04a 0.32 ± 0.46e 1.89 ± 0.55c 2.05 ± 0.31cd 2.33 ± 0.04cd 2.56 ± 0.60b Umidade (%) 6.51 ± 0.76b 9.92 ± 0.19ac 8.79 ± 0.63a 8.64 ± 0.88a 8.71 ± 1.08a 9.70 ± 1.21ac Proteína (%) 34.76 ± 1.22a 6.44 ± 0.93e 18.58 ± 0.27d 20.65 ± 0.43c 20.05 ± 0.9c 21.52 ± 0.04b Gorduras (%) 0.33 ± 0.08c 2.13 ± 0.52a 2.01 ± 0.14a 2.10 ± 0.01a 1.94 ± 0.33b 1.81 ± 0.12b Amido digestível (%) 8.20 ± 0.45e 31.89 ± 0.17a 30.61 ± 0.32b 26.83 ± 0.24d 28.69 ± 0.04c 27.31 ± 0.27c Amido resistente (%) 5.45 ± 1.34a 2.91 ± 0.70b 2.42 ± 0.02b 2.23 ± 0.31b 2.97 ± 0.52b 3.78 ± 0.44b

Nota: Os valores são média ± desvio padrão de três repetições. Médias com sobrescritos diferentes na mesma linha são significativamente (p < 0.05) diferentes.
Abreviaturas: SNLF: farinha de folhas de urtiga; controle: 100% milho; 5NC: 95% milho + 5% SNLF; 10NC: 90% milho + 10% SNLF; 15NC: 85% milho + 15% SNLF; 20NC: 80% milho + 20% SNLF.

Perda na cocção, razão de espalhamento, dureza e cor dos biscoitos.
Parâmetro Controle 5NC 10NC 15NC 20NC Perda na cocção (%) 8.98 ± 0.04a 7.33 ± 0.01c 8.23 ± 0.04b 7.18 ± 0.00d 6.93 ± 0.02e Diâmetro (mm) 36.31 ± 0.41a 34.23 ± 0.26b 30.21 ± 0.12e 33.89 ± 0.52c 31.83 ± 0.55d Espessura (mm) 3.45 ± 0.02a 3.41 ± 0.81a 3.57 ± 0.31a 3.59 ± 0.22a 3.48 ± 0.08a Razão de espalhamento 10.53 ± 0.01a 10.04 ± 0.08b 8.46 ± 0.11e 9.44 ± 0.02c 9.16 ± 0.12d Dureza (gf)  Massa 978.87 ± 39.60a 965 ± 88.23a 696.42 ± 61.90b 557.71 ± 35.87c 489.34 ± 62.15c  Biscoitos 1706.54 ± 445.15a 1543.76 ± 321.61a 1463.34 ± 704.10ac 1326.63 ± 925.31ab 1491.09 ± 152.44ac Cor  L∗ 54.93 ± 0.61a 50.10 ± 0.38b 45.31 ± 0.44c 44.02 ± 0.53c 42.73 ± 0.32d  a∗ 0.21 ± 0.36d −0.65 ± 0.18b −0.24 ± 0.11c −0.88 ± 0.72b −1.40 ± 0.27a  b∗ 23.51 ± 0.20a 20.51 ± 0.25b 15.43 ± 0.08c 10.46 ± 0.04d 8.74 ± 0.32e  ΔE 9.68 ± 0.42a 8.09 ± 0.04b 6.21 ± 0.34c 6.11 ± 0.52c 5.86 ± 0.17d

Nota: Os valores são média ± desvio padrão de três repetições; médias com sobrescritos diferentes na mesma linha são significativamente (p < 0.05) diferentes.
Abreviaturas: Controle: 100% milho; 5NC: 95% milho + 5% urtiga; 10NC: 90% milho + 10% urtiga; 15NC: 85% milho + 15% urtiga; 20NC: 80% milho + 20% urtiga.

CFT, DPPH e índice glicêmico estimado (IGe) de biscoitos de milho.
Formulação TPC (mg GAE/g) DPPH (μmol TE/g) eGI Antes da digestão Após a digestão Antes da digestão Após a digestão Controle 89.22 ± 0.08d 102.55 ± 0.01e 4.32 ± 0.08e 6.42 ± 0.02e 48.60 ± 0.02a 5NC 84.95 ± 5.66e 112.52 ± 6.45d 5.30 ± 0.54d 8.40 ± 0.64d 45.81 ± 0.08b 10NC 102.33 ± 2.98c 120.28 ± 0.34c 8.10 ± 0.02c 9.8 ± 0.31c 37.98 ± 0.04d 15NC 118.02 ± 1.38b 125.32 ± 2.17b 9.50 ± 0.21b 10.93 ± 0.45b 38.72 ± 0.00c 20NC 120.32 ± 0.08a 129.88 ± 0.04a 10.99 ± 0.38a 14.22 ± 0.33a 33.18 ± 0.02e

Nota: Os dados são expressos como média ± DP; médias com sobrescritos diferentes na mesma coluna são significativamente (p < 0.05) diferentes.
Abreviações: Controle: 100% milho; 5NC: 95%milho + 5%urtiga; 10NC: 90%milho + 10%urtiga; 15NC: 85%milho + 15%urtiga; 20NC: 80%milho + 20%urtiga.