pmid: "20600217"
title: "Sulforaphane protege a toxicidade induzida por Microcistina-LR através da ativação da resposta defensiva mediada por Nrf2."
authors: "Gan N, Mi L, Sun X, Dai G, Chung FL, Song L"
journal: "Toxicology and applied pharmacology"
pubdate: "2010 Sep 01"
doi: "10.1016/j.taap.2010.06.005"
source: "PMC Full Text"
Sulforaphane protege a toxicidade induzida por Microcistina-LR através da ativação da resposta defensiva mediada por Nrf2.
Autores
Gan N, Mi L, Sun X, Dai G, Chung FL, Song L
Periodico
Toxicology and applied pharmacology (2010 Sep 01)
Conteudo
Sulforafano protege a toxicidade induzida por Microcistina-LR através da ativação da resposta defensiva mediada por Nrf2
Microcistinas (MCs), hepatotoxinas de heptapeptídeos cíclicos, são produzidas principalmente pela cianobactéria formadora de florações Microcystis, que se tornou um perigo ambiental em todo o mundo. O consumo prolongado de água contaminada com MCs pode induzir danos hepáticos, câncer de fígado e até a morte humana. Portanto, além da remoção de MCs na água potável, novas estratégias que previnam danos à saúde são urgentemente necessárias. O sulforafano (SFN), um isotiocianato de ocorrência natural de vegetais crucíferos, tem sido relatado por reduzir e eliminar toxicidades de xenobióticos e carcinógenos. O objetivo do presente estudo foi fornecer insights mecanísticos sobre o sistema de defesa antioxidante induzido por SFN contra a citotoxicidade induzida por MC-LR. Realizamos ensaios de viabilidade celular, incluindo ensaio MTS, ensaio de formação de colônias e classificação de células apoptóticas, para estudar o dano celular induzido por MC-LR e os efeitos protetores do SFN. Os resultados mostraram que o SFN protegeu contra os danos induzidos por MC-LR em uma dose não tóxica e fisiologicamente relevante nas células HepG2, BRL-3A e NIH 3T3. A proteção foi mediada por Nrf2, evidenciada pela transativação de Nrf2 e ativação de seus genes a jusante, incluindo NQO1 e HO-1, e pelo nível elevado de GSH intracelular. Os resultados de nossos estudos indicam que o pré-tratamento das células com 10 μM de SFN por 12 h protegeu significativamente as células contra danos induzidos por MC-LR. A resposta protetora induzida por SFN foi mediada pela via Nrf2.
Introdução
Microcistinas (MCs) são uma família de hepatotoxinas cíclicas heptapeptídicas produzidas por espécies de água doce de microcystis. As MCs têm sido implicadas no desenvolvimento de câncer hepático, necrose e até sangramento intra-hepático fatal. Uma característica comum dessas toxinas peptídicas monocíclicas é que elas compartilham um aminoácido distinto de 20 carbonos, o ácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda). Sabe-se que o componente Adda é um elemento-chave para a toxicidade desses compostos (Fig. 1A). Além disso, alguns episódios de intoxicação causados por florações tóxicas de cianobactérias foram relatados. Yu et al encontraram uma correlação estreita entre a incidência de Câncer Hepático Primário (CHP) na cidade de Haimen, Província de Jiangsu, e as MCs na água potável, por meio de um levantamento epidemiológico de dois anos (1993–1994), e levantaram a hipótese de que as MCs na água potável são um dos fatores de risco para a alta incidência de CHP na cidade de Haimen. Em 1996, um incidente que causou a morte de 50 pessoas ocorreu em Caruaru, Brasil, devido ao uso de água de hemodiálise contaminada com microcistina. Evidências crescentes mostram que muitos animais domésticos, peixes e seres humanos adoeceram ou morreram ao beber água com cianotoxina em alguns casos. Entre as Microcistinas, a Microcistina-LR (MC-LR) é a variante de MC mais tóxica e também a mais comumente encontrada em um sistema aquático contaminado. Devido à sua alta toxicidade, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu uma diretriz segura com o limite superior recomendado de 1 μg L−1 de MC-LR na água potável para consumo humano diário.
Na China, a eutrofização em muitos lagos tornou-se uma grave ameaça ambiental. Estima-se que cerca de 85% dos lagos estejam eutrofizados e a taxa ainda está aumentando. As espécies dominantes nesses lagos são microcystis spp. produtoras de Microcistinas. Muitos lagos de água doce, riachos e reservatórios ao longo da bacia do Rio Changjiang (Yangtze) estão fortemente poluídos pelas crescentes atividades de desenvolvimento econômico. Em 2007, uma enorme floração de algas verde-azuladas no terceiro maior lago da China (Lago Tai) apareceu, sendo responsável pelo abastecimento de água potável contaminada na cidade de Wuxi. A poluição dos lagos representa um problema nacional maior; a densidade celular da floração de cianobactérias atingiu mais de 2 bilhões por litro em alguns dos maiores lagos da China, como o Lago Dianchi, o Lago Chao e o Lago Tai.
Claramente, a forma mais eficaz de reduzir a contaminação por microcistina na água potável é inibir o crescimento de Microcystis nos recursos hídricos. O tratamento sofisticado da água para reduzir e remover a microcistina é outra opção. No entanto, essas operações são desafios tanto técnicos quanto econômicos, especialmente em países em desenvolvimento como a China. Portanto, novas estratégias para prevenir os riscos à saúde induzidos por MC tornaram-se opções importantes e são urgentemente necessárias. Recentemente, a Vitamina E tem sido implicada na proteção contra a exposição crônica à MC-LR, reduzindo a peroxidação lipídica e limitando o vazamento de ALT induzido pela toxina e a inibição da atividade da GST.
O sulforafano (Fig. 1B), um isotiocianato (ITC) natural encontrado em vegetais crucíferos como brotos de brócolis, é um agente quimioprotetor eficaz contra o câncer em estudos de cultura celular e animais. Estudos epidemiológicos também mostraram que a ingestão de ITC na dieta está associada a um risco reduzido de vários tipos de câncer humano, incluindo pulmão, mama, cólon e próstata. Vários mecanismos, incluindo a supressão das enzimas do citocromo P450, a indução da parada do ciclo celular e das vias apoptóticas, a inibição da angiogênese e a atividade anti-inflamatória, foram propostos para a atividade de quimioprevenção do SFN. Acredita-se que um mecanismo principal pelo qual o SFN protege as células é através da indução mediada pelo fator 2 relacionado ao NF-E2 (Nrf2) de enzimas de fase II que protegem as células do estresse oxidativo e de carcinógenos. O Nrf2, um fator de transcrição pertencente à subfamília cap’n’collar, é fundamental na regulação das respostas celulares a insultos oxidativos e eletrofílicos. Seus genes-alvo são cruciais para manter a homeostase redox celular e facilitar o metabolismo de xenobióticos. Foi proposto que o SFN libera o Nrf2 do complexo citoplasmático Keap1-Nrf2 ao se ligar covalentemente a algumas cisteínas-chave na Keap1. Consequentemente, o Nrf2 liberado se transloca para o núcleo, liga-se ao elemento de resposta antioxidante (ARE) e ativa a transcrição de enzimas de fase II dependentes de ARE. Outros estudos também indicam que o SFN estabiliza a proteína Nrf2, provavelmente através da inibição da degradação proteassomal dependente de Keap1. Em ambos os casos, o Nrf2 é essencial para a resposta antioxidante induzida pelo SFN. As enzimas de fase II reguladas pelo Nrf2 incluem a NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1 (NQO1) e a heme oxigenase-1 (HO-1). A NQO1 catalisa a redução de quinonas, protegendo as células contra o ciclo redox e o estresse oxidativo, e reduz o metabólito tóxico do paracetamol de volta ao composto original in vitro. A HO-1 catalisa a degradação do heme em bilirrubina, monóxido de carbono e ferro. A importância do Nrf2 como um novo alvo molecular para a quimioprevenção do câncer foi ainda mais confirmada em estudos utilizando camundongos Nrf2-nocaute. Camundongos Nrf2-nocaute apresentam níveis basais e induzidos reduzidos de enzimas antioxidantes e são mais suscetíveis a toxicantes e carcinógenos.
Uma ampla variedade de compostos isolados de fontes alimentares ou plantas são capazes de ativar a via Nrf2. No entanto, os ativadores de Nrf2 mais atraentes são aqueles com efeitos menos tóxicos. Esses agentes podem ser classificados em cinco categorias: 1) antioxidantes fenólicos (ácido cafeico, epigalocatequina-3-galato, butil-hidroxianisol); 2) ditioletionas (oltipraz, 3H-1,2-ditiol-3-tiona); 3) triterpenoides (CDDO-Im, ácido oleanólico); 4) diterpenoide (Oridonina); e 5) isotiocianatos (SFN). Os efeitos protetores do SFN contra a citotoxicidade induzida por Arsênio através da ativação da resposta defensiva mediada por Nrf2 foram demonstrados em estudos anteriores. E o SFN está disponível na vida diária das pessoas e apresenta efeitos menos tóxicos em baixas doses. Nossa hipótese foi que o SFN, um potente antioxidante indireto e forte ativador de Nrf2, poderia prevenir a citotoxicidade celular induzida por MC-LR, um eletrófilo e indutor de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste estudo, descobrimos que o SFN é capaz de proteger efetivamente o dano celular induzido por MC-LR em uma variedade de linhagens celulares em concentrações não tóxicas e fisiológicas através da resposta defensiva dependente de Nrf2, apoiando uma nova perspectiva no uso do SFN como agente protetor contra danos celulares causados por MC-LR.
Materiais e métodos
Produtos químicos e reagentes
A Microcistina-LR foi purificada em nosso laboratório. Sulforafano (SFN), terc-Butil-hidroquinona (tBHQ) e todos os outros reagentes eram do grau mais alto disponível da Sigma-Aldrich, salvo indicação contrária. MC-LR, SFN, L-Butionina-sulfoximina (BSO) e tBHQ foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenados a −20 °C até o uso.
Células e condições de cultura
As células HepG2 (linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano), BRL-3A (linhagem celular de hepatócito de rato) e NIH 3T3 (linhagem celular de fibroblasto embrionário de camundongo) foram obtidas do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências e cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (Invitrogen) a 37 °C e 5% de CO2.
Transfecção transiente de siRNA
Para os experimentos de RNA pequeno interferente (siRNA), foram utilizados 20 nM de siRNA controle (Qiagen) e siRNA específico para Nrf2 (SI03246950, Qiagen). As células foram incubadas com siRNA ou siRNA controle em Opti-MEM sem soro e sem antibióticos, usando o reagente de transfecção Oligofectamine (Invitrogen). Após 4 h, adicionou-se Opti-MEM com soro 2× concentrado, resultando em uma concentração final de 10% de FBS. As células foram incubadas por 48 h antes do tratamento.
Preparação de lisados celulares e análise por imunoblot
Após o tratamento, as células foram lisadas em um tampão contendo 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 1 mM DTT, por 20 min no gelo. As frações citosólicas foram obtidas como sobrenadante após centrifugação a 15.000×g por 10 min a 4 °C. O pellet foi ressuspendido em tampão de extração nuclear (20 mM Hepes, pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerol, 1 mM DTT) por 20 min no gelo, seguido de centrifugação a 15.000×g por 10 min a 4 °C. Proteínas (20 μg) foram carregadas em um gel de SDS-poliacrilamida, separadas por eletroforese e eletrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore). A análise de imunotransferência foi realizada com anticorpos específicos e detecção baseada em quimioluminescência aumentada (Millipore). Anticorpos contra Nrf2, Keap1, NQO1 e HO-1 foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). O anti-β-actina foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO, EUA).
Medição do GSH intracelular
A concentração de GSH intracelular foi medida usando o kit Glutathione Assay do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). Todos os procedimentos foram seguidos de acordo com as instruções do fabricante. Todos os experimentos descritos nesta seção foram realizados em triplicata para obter médias e desvios padrão.
Ensaio de viabilidade celular (MTS)
Células HepG2 e NIH 3T3 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células/poço por 24 h antes de serem tratadas com MC-LR por 24 h na presença ou ausência de pré-tratamento com 10 μM de SFN por 12 h. O ensaio de viabilidade celular foi realizado usando o kit CellTiter 96 Aqueous de proliferação celular não radioativo (Promega). A absorbância foi lida a 490 nm em um leitor de ELISA (Bio-rad, EUA). Os dados foram expressos como percentual de viabilidade celular em comparação com o controle, que foi tratado com 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO) e a porcentagem de sobrevivência celular foi obtida. Os valores apresentados são médias (n=3) ± DP.
Ensaios de formação de colônias
As células foram tratadas com 10 μM e 20 μM de MC-LR por 24 h na presença ou ausência de pré-tratamento com 10 μM de SFN por 12 h, tripsinizadas e semeadas em placas a 600 células para HepG2 e 500 células para NIH 3T3 por placa. As colônias foram coradas com violeta cristal e contadas 2–3 semanas após a semeadura.
Detecção de células apoptóticas
A morte celular apoptótica foi realizada com um kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC (BD Pharmingen) de acordo com o protocolo do fabricante. Um citômetro de fluxo FACScan (Beckman) foi usado para detecção de morte celular.
Análise de dados
Pelo menos três experimentos independentes foram conduzidos para todas as análises. Os dados foram armazenados e analisados em computadores pessoais usando Excel 2003 (Microsoft) e origin 7.5 (software). Os valores são expressos como médias ± desvio padrão. O teste t de Student e o teste de Mann-Whitney foram usados para comparar valores médios e valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
Citotoxicidade do MC-LR em células HepG2 e BRL-3A
Para estudar a citotoxicidade da MC-LR em células hepáticas, primeiro caracterizamos a dependência de concentração da morte celular induzida por MC-LR em células HepG2, uma linhagem celular com uma via Nrf2 altamente responsiva. Conforme mostrado na Fig. 2A, o tratamento com MC-LR por 24 h reduziu a sobrevivência celular de maneira dependente da concentração. A concentração de MC-LR com redução substancial na sobrevivência celular foi de 10 μM e a concentração IC50 foi de 21,9 μM. Repetimos os experimentos em BRL-3A, uma linhagem celular derivada de fígado de rato. A concentração de MC-LR com redução substancial na sobrevivência celular foi de 5 μM e a concentração IC50 foi de 7,5 μM. Parece que a célula BRL-3A é mais sensível à morte celular induzida por MC-LR do que as células HepG2.
O pré-tratamento com SFN bloqueia a morte celular induzida por MC-LR
Para demonstrar a citoproteção induzida por SFN contra a morte celular induzida por MC-LR, células HepG2 foram tratadas com 10 μM de MC-LR por 24 h com e sem pré-tratamento com SFN (1–20 μM) por 12 h. Os resultados do ensaio MTS (Fig. 3A) mostram que MC-LR reduziu significativamente a viabilidade celular para 64±1,13% (p<0,005). No entanto, o pré-tratamento com 10 μM de SFN por 12 h bloqueou completamente a morte celular causada por MC-LR (100,1±2,04%, p<0,005). A proteção pelo SFN também foi dependente do tempo e da dose (Figs. 3A e B). Uma proteção substancial pode ser alcançada pelo pré-tratamento com 1 μM de SFN por 12 h ou com 10 μM de SFN por 6 h. Citoproteção semelhante também foi observada em células BRL-3A (Fig. Suplementar 1). Como BRL-3A é mais sensível à morte celular induzida por MC-LR, apenas 5 μM de MC-LR foi usado para induzir toxicidade.
Além disso, SFN (10 μM) e MC-LR (10 μM) foram misturados e incubados a 37 °C por 24 h, depois analisados por HPLC de fase reversa. Nenhum pico adicional foi detectado e o tamanho dos picos originais não foi alterado (dados não mostrados), descartando possibilidades de que a inibição da morte celular fosse devida a uma reação entre SFN e MC-LR e, assim, reduzisse a captação celular de MC-LR.
Para estudar se o SFN induz citoproteção contra a toxicidade da MC-LR em células normais, tratamos células NIH 3T3, uma linhagem celular não cancerosa usada para mostrar transformação celular por carcinógenos, com até 40 μM de MC-LR por 24 h com e sem pré-tratamento com 10 μM de SFN por 12 h. O ensaio de viabilidade celular (Fig. 4A) mostra que o SFN foi capaz de proteger contra todas as concentrações de MC-LR. Interessantemente, a proteção do SFN foi mais evidente em concentrações mais altas de MC-LR. O pré-tratamento com SFN aumentou a viabilidade das células tratadas com 40 μM de MC-LR de 24% para 53%.
Para confirmar ainda mais a proteção, realizamos um ensaio de formação de colônias usando células HepG2 e NIH 3T3. Os resultados (Figs. 3C, 4B) mostram que o tratamento com 10 e 20 μM de MC-LR reduziu drasticamente o número de colônias formadas. No entanto, o pré-tratamento das células com 10 μM de SFN por 12 h mais que dobrou o número de colônias em ambas as concentrações de MC-LR.
Adicionalmente, a morte celular apoptótica por MC-LR com e sem pré-tratamento com SFN também foi quantificada usando o ensaio de coloração com Anexina V-FITC em células HepG2 e NIH 3T3. A Fig. 3D mostra que o tratamento em células HepG2 com 5 μM de MC-LR por 24 h aumentou a porcentagem de células apoptóticas, enquanto o pré-tratamento seguido de cotratamento com 10 μM de SFN reduziu a morte celular apoptótica (5,74 no controle, 11,5 em tratado com MC-LR, 8,25 em cotratado). A Fig. 4C também mostra que a proporção de células apoptóticas foi diminuída pelo cotratamento com 10 μM de SFN e 5 μM de MC-LR em células NIH 3T3 (5,74 no controle, 9,51 em tratado com MC-LR, 7,50 em cotratado). Deve-se notar que SFN sozinho a 10 μM induziu apenas ligeiramente a apoptose.
SFN ativa enzimas de fase II mediadas por Nrf2 e GSH
O SFN é conhecido por proteger as células do estresse oxidativo ou ataque eletrofílico ativando a via de sinalização mediada por Nrf2. Para entender se a citoproteção induzida por SFN contra MC-LR também é realizada através dessa via, tratamos células HepG2 com SFN e examinamos os níveis de Nrf2 tanto nas frações citoplasmática quanto nuclear. Os resultados (Fig. 5A) mostram que Nrf2 foi rapidamente enriquecido na fração nuclear após 1 h de tratamento com 10 μM de SFN e o enriquecimento durou pelo menos 8 h. Experimentos separados indicam que um enriquecimento substancial de Nrf2 no núcleo foi observado em células tratadas com apenas 5 μM de SFN por 2 h (Fig. 5B). O enriquecimento de Nrf2 foi dose-dependente até 20 μM. Em contraste, a intensidade da banda de Nrf2 na fração citoplasmática do lisado celular foi claramente reduzida, de acordo com a translocação seguida de acúmulo de Nrf2 no núcleo. O nível de Keap1 em ambas as frações não foi significativamente alterado, consistente com um estudo anterior mostrando que o SFN não foi capaz de induzir uma mudança de ubiquitinação/degradação de Nrf2 para Keap1. Aumentos nos níveis proteicos de NQO1 e HO-1 induzidos por SFN também foram observados por immunoblots (Fig. 5C).
Para descobrir se o Nrf2 desempenha um papel na proteção do SFN contra as toxicidades induzidas por MC-LR, testamos o nível proteico de Nrf2 em frações nucleares com tratamento apenas com MC-LR em células HepG2. A Fig. 5D mostra que o MC-LR aumentou os níveis da proteína Nrf2 de forma dose-dependente e a maior indução foi a 0,5 μM, mas os níveis da proteína Nrf2 diminuíram com altas doses de MC-LR (>5 μM). O tratamento com alta dose de MC-LR poderia inibir a ativação do Nrf2 e permitir que as células sofressem morte celular, provavelmente devido à regulação do Nrf2 na resposta de sobrevivência celular. Comparamos ainda entre os grupos de tratamento de apenas MC-LR, apenas SFN e (SFN+MC-LR) quanto à ativação do Nrf2, expressões de HO-1 e NQO1 (Fig. 5E). Os resultados mostram que o tratamento com apenas SFN e (SFN + MC-LR) enriqueceu o Nrf2 no núcleo. Os níveis proteicos de HO-1 e NQO1 foram significativamente induzidos pelo tratamento com apenas SFN e (SFN + MC-LR). Os resultados sugerem que a ativação do Nrf2 pelo pré-tratamento com SFN potencializou a resposta de sobrevivência celular e bloqueou as toxicidades induzidas por altas doses de MC-LR.
Estudos anteriores relatam que o tratamento com SFN desencadeia a elevação dos níveis celulares de GSH. Para confirmar isso, medimos o nível de GSH intracelular após tratar células HepG2 apenas com MC-LR, apenas com SFN e com (SFN+MC-LR). Conforme mostrado na Fig. 5F, o tratamento com SFN resultou em um aumento do nível de GSH com um máximo de 1,65 vezes o controle a 10 μM por 12 h, e o cotratamento resultou em um aumento de 1,43 vezes. Nossos resultados confirmam achados anteriores de que as respostas citoprotetoras induzidas por SFN podem envolver tanto a indução de enzimas de fase II quanto a elevação antioxidante de GSH.
Para estudar se as respostas antioxidantes induzidas por SFN são específicas da linhagem celular, tratamos mais duas linhagens celulares, BRL-3A e NIH 3 T3, com 0, 1, 2, 5, 10 e 20 μM de SFN por 2 h. As frações nucleares foram extraídas e submetidas a Western blot para análise de Nrf2. Os resultados mostram que o SFN enriqueceu rapidamente o Nrf2 no núcleo em ambas as linhagens celulares. O enriquecimento foi geralmente dependente da dose, com concentrações ótimas de SFN de 5 e 10 μM. Além disso, os resultados também mostram que os níveis das proteínas NQO1 e HO-1 e os níveis de GSH foram significativamente induzidos pelo tratamento com SFN por 12 h (Figura Suplementar 2). Os resultados sugerem que a resposta antioxidante induzida por SFN provavelmente não é específica da linhagem celular.
Nrf2 desempenha um papel essencial na proteção mediada por SFN contra a toxicidade induzida por MC-LR
Para estudar o papel da via do Nrf2 na proteção mediada por SFN contra a toxicidade induzida por MC-LR, silenciamos transitoriamente o Nrf2 em células NIH 3 T3 e HepG2 por meio de oligonucleotídeos siRNA. Após 48 horas de transfecção, as células foram tratadas com DMSO ou 10 μM de SFN por 4 h. O silenciamento gênico contra Nrf2 suprimiu a translocação de Nrf2 induzida por SFN e a expressão de NQO1 e HO-1 em NIH 3 T3 (Fig. 6A) e HepG2 (Figura Suplementar 3A). O ensaio de viabilidade celular indica que o silenciamento seletivo de Nrf2 aboliu a citoproteção por SFN contra a morte celular induzida por MC-LR em NIH 3 T3 (Fig. 6B) e HepG2 (Figura Suplementar 3B). Esses resultados indicam que a via do Nrf2 desempenha um papel na citoproteção induzida por SFN. Essa noção também foi apoiada pelo ensaio que avaliou a proporção de células apoptóticas por MC-LR em células NIH 3 T3 (Fig. 6C). Células transfectadas com Nrf2-siRNA tiveram mais células apoptóticas quando tratadas com uma combinação de SFN e MC-LR do que com MC-LR isoladamente, ao contrário dos resultados indicados na Fig. 4C. Nrf2 é um fator-chave que medeia a resposta antioxidante protetora. O silenciamento do mRNA de Nrf2 inibe a proteção contra o estresse oxidativo, o que foi comprovado pelo tratamento apenas com MC-LR em células Nrf2 e células deficientes em Nrf2 (9.51 em células NIH 3 T3, 13.54 em células NIH 3 T3 deficientes em Nrf2). E mais apoptose foi obtida com o cotratamento de SFN e MC-LR em células deficientes em Nrf2 (13.54 no tratamento com MC-LR, 14.3 no cotratamento). Portanto, o pré-tratamento com SFN agravou a morte celular induzida por MC-LR em células deficientes em Nrf2, provavelmente devido à perda da resposta defensiva dependente de Nrf2.
MC-LR, um dos principais venenos em lagos e rios contaminados pela cianobactéria Microcystis, representa uma ameaça iminente à saúde pública em todo o mundo. Beber água cronicamente com vestígios de MC-LR pode causar danos graves aos órgãos tanto em animais quanto em humanos. Além do tratamento sofisticado e caro da água para remover Microcystis ou seu produto metabólico - MCs, estratégias para minimizar seus efeitos venenosos na saúde animal e humana por meio do aprimoramento dos sistemas de desintoxicação são muito importantes, mas raramente investigadas. Neste estudo, demonstramos que o pré-tratamento de uma variedade de células cultivadas com SFN induziu efetivamente proteção antioxidante contra a citotoxicidade causada pela MC-LR, fornecendo uma perspectiva promissora de que o SFN possa ser usado como um agente protetor contra água potável contaminada com MC-LR.
Estudos anteriores indicaram que a MC-LR, um eletrófilo, se conjuga rapidamente com a GSH. De fato, sabe-se que a desintoxicação da MC-LR no fígado ocorre via conjugação com glutationa, com e sem glutationa-S-transferases (GSTs). Consequentemente, o nível celular de GSH é significativamente reduzido com estresse oxidativo elevado. Portanto, a melhor abordagem para proteger as células da MC-LR é aumentar as atividades antioxidantes. Foi relatado que o SFN pode reduzir efetivamente a citotoxicidade causada por uma variedade de compostos, como menadiona, hidroperóxido de terc-butila, 4-hidroxinonenal e trióxido de arsênio.
Este estudo mostra que o SFN protege as células da toxicidade induzida por MC-LR através da ativação da via Nrf2. A via de sinalização Nrf2 tem sido relatada como conferindo proteção contra a citotoxicidade induzida por carcinógenos químicos. Aqui, confirmamos em várias linhagens celulares que o SFN induziu a translocação de Nrf2 para o núcleo e ativou seus genes-alvo downstream que codificam proteínas, como as enzimas de fase II NQO1 e HO-1. A indução de NQO1 e HO-1 foi estabelecida como uma forte defesa celular contra o estresse oxidativo. Além disso, observamos um aumento no nível intracelular de GSH após o tratamento com SFN. Como a γ-glutamilcisteína sintetase, uma enzima de fase II regulada pela via Nrf2, é a enzima limitante da taxa na biossíntese de GSH, o aumento no nível de GSH pode refletir a indução da γ-glutamilcisteína sintetase pelo SFN. Curiosamente, as atividades antioxidantes induzidas pelo SFN foram abolidas quando o Nrf2 foi silenciado, indicando um papel específico da via Nrf2 na citoproteção induzida pelo SFN contra MC-LR. A descoberta da via alvo é significativa porque fornece um sinal que leva à identificação de compostos com melhor eficácia. Neste estudo, descobrimos que a citoproteção induzida pelo SFN é evidente em faixas de baixa concentração abaixo de 10 μM, o que é fisiologicamente alcançável. Acúmulo limitado de Nrf2 e citoproteção foram observados em altas concentrações de SFN (40 μM para células HepG2, 20 μM para células NIH 3T3), consistente com descobertas anteriores de que o SFN pode induzir apoptose substancial em células em altas concentrações. Portanto, é concebível que uma concentração mais baixa de SFN possa alcançar uma proteção antioxidante mediada por Nrf2 ideal. Nossos dados também mostram que a proteção substancial pelo SFN contra MC-LR é dependente do tempo e, portanto, é promissor que a proteção a longo prazo contra quantidades vestigiais de MC-LR na água potável seja alcançável pelo consumo diário de vegetais ricos em SFN. No entanto, mais estudos pré-clínicos e clínicos sobre a atividade protetora do SFN na toxicidade do MC-LR são necessários.
Material Suplementar
Abreviações
MCs
Microcistinas
MC-LR
Microcistina-LR
SFN
Sulforafano
PLC
Câncer Primário de Fígado
Nrf2
Fator 2 relacionado ao NF-E2
GSH
Glutationa
ARE
Elemento de resposta antioxidante
ALT
Alanina aminotransferase
ITC
Isotiocianato
NQO1, NAD(P)H
Quinona oxidoredutase 1
HO-1
Heme oxigenase-1
GSTs
Glutationa-S-transferases
tBHQ
Terc-Butilhidroquinona
siRNA
RNA pequeno interferente
DMSO
Dimetilsulfóxido
Indução potente de enzimas de fase 2 em células prostáticas humanas por Sulforafano
As toxinas das cianobactérias
Papel do NRF2 na proteção contra lesão pulmonar hiperóxica em camundongos
Avaliação pré-clínica e clínica do sulforafano para quimioprevenção na mama
Evidência direta de que os grupos sulfidrila da Keap1 são os sensores que regulam a indução de enzimas de fase 2 que protegem contra carcinógenos e oxidantes
Oridonina confere proteção contra toxicidade induzida por arsênio através da ativação da resposta defensiva mediada por Nrf2
Problemas de florações de cianobactérias tóxicas em águas australianas: riscos e impactos na saúde humana
Níveis urinários de isotiocianato, brássicas e câncer de mama humano
Proteção potente e prolongada de células epiteliais pigmentares da retina humana, queratinócitos e células de leucemia murina contra danos oxidativos: os efeitos antioxidantes indiretos do sulforafano
Uma investigação sobre o papel da vitamina E na proteção de camundongos contra a toxicidade de microcistinas
Uma investigação sobre a desintoxicação de microcistina-LR pela via da glutationa em camundongos Balb/c
O fator de transcrição Nrf2 contribui tanto para a expressão basal de glutationa S-transferases no fígado de camundongos quanto para sua indução pelos antioxidantes sintéticos quimiopreventivos, hidroxianisol butilado e etoxiquina
Nrf2: um potencial alvo molecular para a quimioprevenção do câncer por compostos naturais
Insuficiência hepática e morte após exposição a microcistinas em um centro de hemodiálise no Brasil
Vegetais crucíferos, polimorfismos genéticos nas glutationa S-transferases M1 e T1 e risco de câncer de próstata
Respostas de sobrevivência celular a estresses ambientais através da via Keap1-Nrf2-ARE
Efeitos da glutationa na expressão gênica mediada pelo elemento de resposta antioxidante e na apoptose induzida pelo sulforafano
O sensor de estresse oxidativo Keap1 funciona como um adaptador para a E3 ligase baseada em Cul3 para regular a degradação proteassômica de Nrf2
Eventos de transdução de sinal desencadeados por compostos de prevenção do câncer
Genótipo nulo da glutationa transferase, brócolis e menor prevalência de adenomas colorretais
Papel da NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1 na hepatoproteção mediada por clofibrato contra o acetaminofeno
Identificação de um conjugado de glutationa formado enzimaticamente da hepatotoxina cianobacteriana microcistina LR: o primeiro passo na desintoxicação
Regulação por eletrófilos e antioxidantes de enzimas que desintoxicam carcinógenos
A ablação genética de Nrf2 aumenta a susceptibilidade ao enfisema induzido por fumaça de cigarro em camundongos
O ácido oleanólico ativa o Nrf2 e protege contra a hepatotoxicidade do acetaminofeno por processos dependentes e independentes de Nrf2
DT-diaforase e quimioterapia do câncer
Sulforafano, um ativador de Nrf2, suprime o acúmulo celular de arsênio e sua citotoxicidade em hepatócitos primários de camundongos
Ingestão dietética de isotiocianatos: evidência de um efeito conjunto com polimorfismos da glutationa S-transferase no risco de câncer de pulmão
Transformação de células humanas por DNAs ineficazes na transformação de células NIH 3T3
Conjugação covalente de glutationa à hepatotoxina cianobacteriana microcistina LR por glutationa S-transferases citosólicas e microssomais de ratos F344
Detecção de microcistinas, uma hepatotoxina de algas azuis-verdes, em amostras de água potável em Haimen e Fusui, áreas endêmicas de Câncer Primário de Fígado na China, por imunoensaio altamente sensível
Diretrizes para a qualidade da água potável
Sinalização Nrf2: Uma via de resposta adaptativa para proteção contra insultos tóxicos ambientais
Ativação genética versus quimioprotetora da sinalização Nrf2: perfis de expressão gênica sobrepostos, porém distintos, entre camundongos knockout para Keap1 e tratados com triterpenoides
O sulforafano protege os rins contra lesão de isquemia-reperfusão por meio da indução da enzima de fase 2 dependente de Nrf2
Alteração dos níveis intracelulares de GSH e seu papel no dano ao DNA induzido por microcistina-LR em células HepG2 de hepatoma humano
Ubiquitinação de Keap1, uma proteína adaptadora de substrato BTB-Kelch para Cul3, direciona Keap1 para degradação por uma via independente de proteassoma
Estudos mecanísticos da via de sinalização Nrf2-Keap1
Apêndice A. Dados suplementares
Os dados suplementares associados a este artigo podem ser encontrados, na versão online, em doi:10.1016/j.taap.2010.06.005.
Estrutura química das microcistinas (A) e do sulforafano (B).
Citotoxicidade de MC-LR em células HepG2 e BRL-3A
MC-LR é tóxico para células HepG2 (A) e BRL-3A (B). Células semeadas em placas de 96 poços foram tratadas com concentrações crescentes de MC-LR por 24 h antes do ensaio MTS.
SFN protege células HepG2 da citotoxicidade induzida por MC-LR. (A) Células HepG2 foram pré-tratadas com as concentrações indicadas de SFN por 12 h e, em seguida, tratadas com MC-LR por 24 h. (B) são os resultados do ensaio de diferentes tempos de pré-tratamento. 0 h significa que as células foram tratadas com SFN e MC-LR ao mesmo tempo. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTS. Cada valor representa a média±DP de três determinações. **, p<0,01. (C) O ensaio de formação de colônias confirma a citoproteção pelo SFN. Esquerda, imagens de formação de colônias em clones HepG2 após 2 semanas. As células foram pré-tratadas com ou sem 10 μM de SFN por 12 h e, em seguida, tratadas com MC-LR por mais 24 h, conforme indicado em materiais e métodos. Direita, porcentagem de células HepG2 viáveis após 2 semanas com tratamento com MC-LR por 24 h na presença ou ausência de SFN. As barras de erro indicam o DP (n=3). (D) O pré-tratamento com SFN inibe a morte celular apoptótica induzida por MC-LR. Morte celular em células HepG2 com ou sem pré-tratamento com 10 μM de SFN por 12 h e, em seguida, tratadas com MC-LR por mais 24 h. A morte celular apoptótica foi detectada usando coloração com Anexina V-FITC e citometria de fluxo. O gráfico de barras representa a proporção de células apoptóticas iniciais mais células apoptóticas tardias em comparação com o controle; a média±DP foi calculada a partir de experimentos realizados em triplicata (direita).
SFN induz proteção antioxidante em células NIH 3 T3. (A) O pré-tratamento com SFN melhora a viabilidade celular suprimida por MC-LR. A sobrevivência celular em células NIH 3 T3 com ou sem pré-tratamento com 10 μM de SFN por 24 h e então tratadas com MC-LR por mais 24 h foi medida pelo ensaio de MTS. (média±DP de três experimentos; *, p<0,05). (B) O ensaio de formação de colônias confirma a citoproteção pelo SFN. Em cima, imagens de formação de colônias em clones de NIH 3 T3 após 3 semanas. As células foram pré-tratadas com ou sem 10 μM de SFN por 12 h e então tratadas com MC-LR por mais 24 h, conforme indicado em materiais e métodos. Em baixo, porcentagem de células NIH 3 T3 viáveis após 3 semanas com tratamento com MC-LR por 24 h na presença ou ausência de SFN. As barras de erro indicam o DP (n=3). (C) O pré-tratamento com SFN inibe a morte celular apoptótica induzida por MC-LR. Morte celular em células NIH 3 T3 com ou sem pré-tratamento com 10 μM de SFN por 12 h e então tratadas com MC-LR por mais 24 h. A morte celular foi detectada usando coloração com Anexina V-FITC e citometria de fluxo. O gráfico de barras representa a proporção de células em apoptose inicial mais células em apoptose tardia em comparação com o controle; a média±DP foi calculada a partir de experimentos realizados em triplicata (em baixo).
Efeitos do SFN na ativação da via Nrf2 em células HepG2. (A) e (B), Nrf2 é enriquecido no núcleo após o tratamento com SFN. (A) Estudo de cinética temporal. Frações nucleares (N) e citoplasmáticas (C) foram extraídas do lisado celular de HepG2 tratadas com 10 μM de SFN. (B) Estudo de dose-resposta. As células foram tratadas com 0, 5, 10, 20, 40 μM de SFN por 2 h. tBHQ, um indutor conhecido da via Nrf2, foi usado como controle positivo. (C) SFN induz a expressão de NQO1 e HO-1. Frações citoplasmáticas foram sondadas para NQO1 e HO-1. (D) Aumento da proteína Nrf2 nuclear em resposta a MC-LR. Células HepG2 foram tratadas com MC-LR (0, 0,1, 0,5, 5, 10 μM) por 4 h. Frações citosólicas e nucleares foram preparadas de cada linhagem celular e submetidas à análise de western blot com anticorpo anti-Nrf2 e β-actina, respectivamente. (E) Células HepG2 tratadas com 10 μM de MC-LR, 10 μM de SFN e (SFN+MC-LR) por 4 h. Frações nucleares e citoplasmáticas foram extraídas do lisado celular. As frações nucleares foram sondadas para Nrf2 e as frações citoplasmáticas para HO-1 e NQO1. (F) O GSH intracelular foi aumentado pelo tratamento com SFN sozinho e (SFN + MC-LR). Células tratadas com MC-LR sozinho, SFN sozinho e (SFN + MC-LR) por 12 h. Cada valor representa a média±DP de três determinações. *, p<0,05.
A via Nrf2 é especificamente responsável pela citoproteção induzida por SFN. (A) O siRNA Nrf2 é eficaz em silenciar a translocação de Nrf2 e a ativação de genes-alvo. Células NIH 3 T3 foram transfectadas com oligos controle ou siRNA Nrf2. Após a transfecção, as células foram expostas a SFN por 4 h. Extratos nucleares foram preparados para analisar a distribuição de Nrf2, e extratos citoplasmáticos foram preparados para analisar a expressão de NQO1, HO-1 e β-actina. (B) O silenciamento de Nrf2 anula a citoproteção induzida por SFN contra a toxicidade de MC-LR. Células NIH 3 T3 foram transfectadas com siRNA Nrf2 por 48 h antes de serem tratadas com MC-LR sozinho ou com uma combinação de MC-LR e SFN por 24 h. A taxa de sobrevivência celular foi medida pelo ensaio MTS. As barras de erro indicam o D.P. (n=3). *p<0,05. (C) A especificidade da via Nrf2 na citoproteção induzida por SFN é confirmada pelo ensaio de Anexina V-FITC. Mais células apoptóticas foram observadas em células NIH 3 T3 transfectadas com siRNA Nrf2 e tratadas com SFN e MC-LR do que naquelas tratadas apenas com MC-LR.