pmid: "24024172"
title: "A disponibilidade de glicose é um fator decisivo para a expressão gênica mediada por Nrf2."
authors: "Heiss EH, Schachner D, Zimmermann K, Dirsch VM"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2013"
doi: "10.1016/j.redox.2013.06.001"
source: "PMC Full Text"

A disponibilidade de glicose é um fator decisivo para a expressão gênica mediada por Nrf2.

Autores

Heiss EH, Schachner D, Zimmermann K, Dirsch VM

Periodico

Redox biology (2013)

Conteudo

A disponibilidade de glicose é um fator decisivo para a expressão gênica mediada por Nrf2☆
A ativação do fator de transcrição Nrf2 (fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2) é uma das principais linhas de defesa celular contra o estresse oxidativo e xenobiótico, mas também influencia genes envolvidos no metabolismo de lipídios e glicose. Não está resolvido se as respostas citoprotetoras e metabólicas mediadas por Nrf2 são eventos conectados ou separáveis em células não malignas. Neste estudo, mostramos que a ativação de Nrf2, seja pela molécula pequena sulforafano ou pelo knockout do inibidor de Nrf2 Keap1, leva ao aumento da captação celular de glicose e ao aumento da dependência de glicose em fibroblastos. Após a ativação de Nrf2, a glicose é preferencialmente metabolizada através da via das pentoses fosfato, com aumento da produção de NADPH. A interferência no fornecimento de glicose ou na via das pentoses fosfato e na geração de NADPH não apenas prejudica a desintoxicação mediada por Nrf2 de espécies reativas de oxigênio no nível enzimático, mas também a expressão iniciada por Nrf2 de proteínas de defesa antioxidante, como a glutationa redutase e a heme-oxigenase 1. Concluímos que a proteção dependente de Nrf2 contra o estresse oxidativo depende de uma via das pentoses fosfato intacta e que há uma intercomunicação entre metabolismo e desintoxicação já no nível da expressão gênica em células de mamíferos.
Resumo gráfico
Destaques

• A ativação de Nrf2 resulta em aumento da captação celular de glicose.
• Após a ativação de Nrf2, a glicose é preferencialmente metabolizada através da PPP.
• O aumento resultante de NADPH não é apenas crucial para a desintoxicação funcional de ROS, mas também para a expressão gênica dependente de Nrf2 em células de mamíferos.
• Esses dados complementam nossa compreensão do aspecto metabólico da ação de Nrf2.
  Introdução
  As células são constantemente desafiadas por insultos xenobióticos e oxidativos. O Nrf2 (fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2), um fator de transcrição ubiquamente expresso da família cap 'n' collar basic leucine zipper, é uma parte importante da defesa celular contra esses estressores prejudiciais. Como a maioria dos fatores de transcrição, o Nrf2 está sujeito a uma regulação espaço-temporal de sua função. Sob condições não estressadas, o nível da proteína Nrf2 é mantido baixo pela ligação ao seu inibidor mais proeminente, a proteína Kelch-like ECH-associated protein (Keap) 1, em uma proporção molar de 1:2. Keap1, sendo um adaptador para as ubiquitina ligases Cul3/Rbx1 E3, facilita a degradação constante do Nrf2 dependente de proteassoma. Após exposição a agentes oxidativos ou eletrofílicos, Keap1 atua como sensor redox ou xenobiótico por meio da oxidação ou modificação covalente de alguns de seus resíduos de cisteína. Isso interrompe o complexo Nrf2/Keap1, interrompe a degradação e favorece a estabilização do Nrf2 e subsequente translocação para o núcleo. Lá, o Nrf2 heterodimeriza com proteínas Maf (sarcoma fibroso pequeno masculoaponeurótico) e se liga a sequências consenso ARE (elemento de resposta antioxidante) (TCAG/CXXXGC) em promotores de genes regulados pelo Nrf2. Esses genes combatem os insultos iniciais e geralmente estão envolvidos no metabolismo de drogas, na resposta ao estresse oxidativo e na desintoxicação.

A descoberta do Nrf2 como fator principal na expressão de genes de defesa celular favoreceu pesquisas que exploram o Nrf2 como alvo de medicamentos ou suplementos nutricionais. Vários produtos derivados de plantas e alimentos são capazes de ativar o Nrf2, incluindo aceptores da reação de Michael (como a curcumina da cúrcuma), isotiocianatos (como o sulforafano de vegetais crucíferos), polienos (como a clorofila ou porfirinas) ou (di)fenóis oxidáveis (como o resveratrol das uvas). Eles influenciam beneficamente o resultado em muitos modelos de doenças, incluindo câncer, doença vascular, diabetes tipo II ou distúrbios neurodegenerativos. Essas condições são caracterizadas ou causadas, pelo menos em certa medida, por um desequilíbrio redox em direção ao estresse oxidativo, que se acredita ser aliviado ou prevenido pela ativação do Nrf2. No entanto, elas também estão ligadas a um metabolismo alterado. Vale notar que, além das funções meramente antioxidantes e de desintoxicação do Nrf2, arranjos de genes revelaram que o Nrf2 ativado regula grupos de genes envolvidos no metabolismo de lipídios e glicose. O Nrf2 mostrou influência tanto positiva quanto negativa na lipogênese, dependendo do sistema modelo utilizado, e certas células cancerígenas exploram a ativação constitutiva do Nrf2 para reprogramar seu metabolismo, garantindo um suprimento ideal de blocos de construção biossintéticos. No entanto, se a defesa antioxidante celular e a mudança metabólica provocada pelo Nrf2 estão interconectadas em células não malignas ainda não foi elucidado em detalhes.
Portanto, investigamos uma possível interação entre a citoproteção mediada por Nrf2 e o metabolismo da glicose celular em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) como sistema modelo. Para descartar adaptações metabólicas a taxas de proliferação distintas sob diferentes tratamentos, utilizamos células quiescentes (depletadas de fatores de crescimento) ao longo do estudo. Obtivemos ativação farmacológica transitória de Nrf2 por tratamento com o ativador de Nrf2 sulforafano (SFN). A atividade dependente de Nrf2 do SFN foi confirmada pela ausência de resposta em células isogênicas Nrf2−/−. O knockout genético do inibidor de Nrf2 Keap1 serviu como modelo para ativação constitutiva de Nrf2.
Materiais e métodos
Materiais
Fibroblastos embrionários de camundongo (WT, Nrf2−/− e Keap1−/−) foram um presente gentil de Thomas Kensler, Universidade de Pittsburgh, EUA. SFN, menadiona e outros produtos químicos ou enzimas foram obtidos da Sigma-Aldrich, salvo indicação em contrário. Accutase para descolamento celular sem soro foi da Millipore. 2-desoxiglicose marcada com trítio foi fornecida pela Amersham. Amplex Red e H2DCF-DA foram da Invitrogen. O ensaio CellTiterGlo para determinação dos níveis de ATP celular veio da Promega. O kit para determinação de NADPH foi adquirido da BioVision, e o sistema exógeno enzimático de geração de NADPH foi da BD Biosciences e foi utilizado em uma diluição 1:20 da solução A (NADP+ e glicose-6-fosfato; cat. no. 451220) e uma diluição 1:100 da solução B (glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD); cat. no. 451200). O anticorpo primário direcionado contra heme oxigenase (HO-1) foi da Stressgen, o anticorpo contra glutationa redutase (GR) foi da Santa Cruz, o anticorpo secundário anti-coelho acoplado à peroxidase de rábano (HRP) foi obtido da Cell Signalling, e o anticorpo secundário anti-camundongo foi adquirido da mpbio.
Cultivo e tratamento celular
Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) foram rotineiramente subcultivados em meio essencial modificado por Dulbecco (DMEM contendo 5 g/L de glicose) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor e 2 mM de glutamina e utilizados até a passagem 6. Exceto por traços de insulina do soro adicionado, nenhum extra de insulina esteve presente durante o cultivo e experimentos. Para todos os experimentos, as células foram semeadas em placas apropriadas e cultivadas até aproximadamente 80–90% de confluência e então tornadas quiescentes por depleção de soro (0,1% de soro) por pelo menos 18 h. Para retirada de glicose, o meio antigo foi aspirado, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e então DMEM sem glicose (Invitrogen) foi adicionado às células por pelo menos 24 h antes da avaliação do desfecho de interesse. Para ativação farmacológica de Nrf2, as células foram tratadas com 5 µM de SFN por 3–7 h.
Determinação da taxa de captação de glicose celular
MEFs foram semeadas em placas de 12 poços. Após o tratamento conforme indicado, as células foram equilibradas em tampão Krebs Ringer Fosfato HEPES (KRPH) padrão contendo 0,2% de albumina sérica bovina (BSA) por 20 min. A captação de glicose foi iniciada pela adição de 2-desoxi-D-glicose enriquecida com 2-desoxi-D-(1H3)-glicose (concentrações finais 0,1 mM e 0,45 µCi/mL). Após 15 min, a reação foi interrompida por três lavagens rápidas com PBS gelado. A taxa de captação de glicose foi determinada por contagem por cintilação líquida (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) dos lisados celulares (lise por 0,05 N NaOH em PBS) e normalizada para o conteúdo de proteína avaliado pelo ensaio de proteína de Bradford e o tempo de captação (para obter moles de glicose incorporados por miligrama de proteína por minuto).
Determinação do lactato extracelular como marcador de glicólise
MEFs foram semeadas em placas de 24 poços. Após o tratamento conforme indicado, as células foram lavadas com PBS e então incubadas com tampão KRPH suplementado com 0,2% de BSA e 10 mM de glicose por 2 h. Em seguida, os sobrenadantes foram analisados quanto ao seu conteúdo de lactato através de um ensaio enzimático acoplado e fluorescente, e as células foram lisadas e seu conteúdo de proteína determinado. Resumidamente, um volume de sobrenadante (geralmente diluído 1:20) foi misturado com um volume de tampão de ensaio (tampão KRPH com 10 µM de Amplex Red, 1 U/mL de lactato oxidase e 2,5 U/mL de peroxidase de rábano silvestre), incubado por 10 min e então lido em um fluorímetro com comprimento de onda de excitação de 535 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. O monitoramento paralelo de soluções com concentrações conhecidas de lactato facilitou uma leitura final de moles de lactato por grama de proteína por minuto.
Determinação dos níveis de ATP celular
MEFs foram preparadas em placas de 12 poços. Após o tratamento conforme indicado, as células foram desprendidas, e uma alíquota da suspensão celular foi contada em um analisador de viabilidade celular Vicell (Beckman) para obter o número de células por mililitro. Outra alíquota foi analisada em um kit de luminescência sensível a ATP (Cell Titer Glo, Promega) de acordo com as instruções do fabricante. O ATP foi quantificado pela avaliação paralela de uma curva padrão com concentrações conhecidas de ATP. Isso permitiu moles de ATP por célula como leitura final. O ATP derivado da glicólise foi determinado bloqueando a produção mitocondrial de ATP por 6 µM de oligomicina (OM), e o ATP originário de OXPHOS foi monitorado na presença do inibidor glicolítico 20 mM de desoxiglicose (DOG) ou 200 µM de 3-bromopiruvato (3BP). A porção de ATP glicolítico foi então determinada como (ATP na presença de OM / níveis totais de ATP) × 100, enquanto a porção de OXPHOS foi definida como (ATP na presença de DOG ou 3BP / níveis totais de ATP) × 100.
Determinação da razão NADPH/NADP
MEFs foram preparadas em placas de 12 poços. Após o tratamento conforme indicado, as células foram submetidas a uma avaliação da razão NADPH/NADP celular com um kit da BioVision de acordo com as instruções do fabricante.
Determinação do nível celular de espécies reativas de oxigênio (ERO)
MEFs foram preparados em placas de 12 poços. Após o tratamento indicado, 10 µM de H2DCF-DA (Invitrogen) foram adicionados às células. Após 20 min, as células foram destacadas por tratamento com accutase e analisadas em um citômetro de fluxo (FACS Calibur, BD) registrando a fluorescência verde de DCF oxidado. A fluorescência média de 10.000 células analisadas (corrigida para autofluorescência) foi considerada como leitura para a carga de ROS intracelular. O estresse redox exógeno foi induzido pela adição de 25 µM de menadiona.

Interferência na atividade da G6PD

A inibição farmacológica da G6PD foi obtida pela incubação das células com 100 µM de deidroandrostenodiona (DHEA). O knockdown mediado por siRNA da enzima foi obtido da seguinte forma. As células foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas com siRNA usando oligofectamina de acordo com as instruções do fabricante. O siRNA direcionado contra G6PD murina foi da Ambion (silencerSelect) e aplicado em uma concentração final de 100 nM, o siRNA controle scrambled foi da Invitrogen. O knockdown foi máximo entre 24 e 48 h (conforme determinado por análise de western blot) e variou entre 70% e 80% de eficiência.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RTq-PCR)

O isolamento de RNA e a síntese subsequente de cDNA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante, utilizando o kit PeqGOLD Total RNA (Peqlab) e o Superscript™ First-Strand Synthesis System (Invitrogen), respectivamente. A PCR quantitativa em tempo real (RTq-PCR) foi realizada usando o reagente Light Cycler™ LC480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics) em um volume de reação de 15 µL. Os ensaios de primers QuantiTect® para heme oxigenase 1 murina (alvo) e hipoxantina-fosforribosil-transferase murina (referência) foram obtidos da Qiagen, diluídos e aliquotados conforme recomendado pelo fabricante. A PCR continha uma etapa de desnaturação (10 min a 95 °C) e até 40 ciclos de amplificação (etapa de anelamento: 30 s a 61 °C e etapa de elongação: 15 s a 72 °C). As curvas de melting do DNA amplificado foram analisadas para garantir que a PCR resultou na amplificação de apenas um produto específico. Os dados foram analisados usando o software Light Cycler™ LC480 (Roche Diagnostics) e o método 2–ΔΔCt.

Extração de proteínas, eletroforese em SDS-poliacrilamida e análise de immunoblot
MEFs foram preparados em placas de seis poços. Após os tratamentos indicados, as células foram lavadas com PBS gelado e raspadas em 100 µL de tampão RIPA padrão. Após um breve pulso de sonicação, os lisados foram centrifugados para sedimentar os detritos insolúveis. Os sobrenadantes foram submetidos à determinação de proteínas de acordo com Bradford. Por canaleta de um gel, 10–20 µg de proteína foram desnaturados por calor em tampão de amostra SDS 1× e, em seguida, separados eletroforeticamente em géis de poliacrilamida SDS a 10%. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana Immobilon (BioRad). Os sítios de ligação livres da membrana foram bloqueados com 5% de leite em pó desnatado em solução salina tamponada com Tris e Tween (TBS–T) antes de as membranas serem sondadas com os anticorpos de interesse. A visualização do complexo antígeno-anticorpo foi obtida por quimioluminescência intensificada e registrada na câmera CCD Fuji LAS 3000. A análise densitométrica foi realizada utilizando o software AIDA (Fuji).

Estatística
Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes. Salvo indicação em contrário, os gráficos de barras representam média+EPM (erro padrão da média). Dois grupos foram comparados usando o teste t de Student, e mais grupos foram analisados por ANOVA de uma ou duas vias, dependendo do número de variáveis nos conjuntos de dados investigados, seguido pelo teste post hoc de Dunnett ou Bonferroni. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism. Diferenças com valores de p<0,05 foram consideradas significativas e designadas com * nas figuras.

Resultados
Para obter uma primeira visão sobre uma possível interdependência entre a citoproteção mediada por Nrf2 e o metabolismo da glicose, avaliamos a taxa de captação celular de glicose após a ativação de Nrf2. A deleção de Keap1 ou a ativação farmacológica de Nrf2 por SFN aumentou a taxa de captação celular de glicose em aproximadamente duas vezes e 1,5 vezes, respectivamente, em comparação com as células controle correspondentes (Fig. 1A). Células com deleção de Nrf2 não apresentaram aumento na taxa de captação celular de glicose após o tratamento com SFN, demonstrando dependência de Nrf2 e excluindo um efeito inespecífico da pequena molécula (Fig. 1B). Além disso, células com Nrf2 ativado, seja por deleção de Keap1 ou tratamento com SFN, foram menos capazes de lidar com a privação de glicose ao longo do tempo e mostraram viabilidade significativamente reduzida em comparação com células controle com atividade basal de Nrf2 (Fig. 1C). Um experimento controle realizado em paralelo na presença de glicose revelou viabilidade celular inalterada ao longo do tempo, excluindo um impacto negativo dependente do tempo da deleção de SFN ou Keap1 na viabilidade celular (dados não mostrados).
Em seguida, nosso objetivo foi decifrar a rota metabólica do excesso de glicose ingerida. Determinamos a taxa de glicólise aeróbica após a ativação do Nrf2. Os níveis de lactato excretado, um marcador substituto da glicólise, foram comparáveis entre células controle, células com Nrf2 ativado geneticamente ou farmacologicamente e células com Nrf2 depletado (Fig. 2A). Os níveis celulares de ATP permaneceram inalterados, demonstrando que a glicose não é desviada para produção de energia após a ativação do Nrf2 (Fig. 2B). Além disso, as proporções de ATP derivadas da fosforilação oxidativa e da glicólise, determinadas na presença de DOG ou 3BP e oligomicina, respectivamente (ver também Materiais e métodos), não foram significativamente diferentes entre células controle e células com Nrf2 ativado (dados não mostrados). Examinamos ainda a razão celular de NADPH/NADP, como leitura da atividade da via das pentoses fosfato (PPP), que direciona a glicose-6-fosfato para a produção de NADPH e ribose-5-fosfato. Células Keap1−/− apresentam níveis celulares de NADPH significativamente mais altos do que células WT (Fig. 2C), em consonância com a noção de que várias enzimas da PPP estão sob o controle do Nrf2. A inibição da enzima-chave da PPP, glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), pela deidroandrostenodiona (DHEA) aboliu o aumento de NADPH, mostrando que a G6PD e a PPP são as principais fontes do NADPH elevado observado. Células WT tratadas com o ativador de Nrf2 SFN também possuem uma razão NADPH/NADP significativamente maior do que células tratadas com veículo, enquanto células Nrf2−/− não respondem ao tratamento com SFN, confirmando assim a ação dependente de Nrf2 do SFN (Fig. 2D).
O NADPH é uma fonte fundamental de equivalentes redutores e é necessário para a regeneração enzimática das formas reduzidas dos tampões redox celulares tiorredoxina e glutationa, além de ser cofator para vários genes de desintoxicação dependentes de Nrf2, incluindo a NAD(P)H:quinona oxidoredutase 1 (NQO1). Portanto, verificamos a dependência da desintoxicação de ROS controlada por Nrf2 na disponibilidade de glicose e em uma via das pentoses-fosfato (PPP) funcional. As células são significativamente menos capazes de desintoxicar o estresse redox imposto após a ativação de Nrf2 pelo SFN quando a glicose é depletada ou a G6PD é inibida, seja por DHEA ou por knockdown mediado por siRNA (knockdown médio obtido de 70–80%). A desintoxicação de ROS induzida por menadiona pelo SFN é dependente de Nrf2, uma vez que é atenuada em células Nrf2−/− (Fig. 3A). Além disso, as células Keap1−/− não conseguem desintoxicar o estresse redox induzido por menadiona na mesma extensão após depleção de glicose ou inibição de G6PD como na presença de glicose e uma PPP intacta (Fig. 3B). Curiosamente, o impacto da depleção de glicose ou da interferência na atividade da G6PD torna-se evidente não apenas na desintoxicação funcional de ROS, mas já no nível da expressão gênica alvo de Nrf2. A retirada de glicose ou a inibição da atividade da G6PD por DHEA abole a indução dos genes alvo antioxidantes de Nrf2 selecionados, glutationa redutase (GR) ou heme oxigenase-1 (HO-1), pelo SFN (Fig. 3C). Para corroborar que a G6PD e uma PPP funcional são necessárias para a transcrição gênica adequada mediada por Nrf2, verificamos ainda a expressão de HO-1 em células com G6PD depletada. Células com níveis reduzidos de G6PD falham em regular positivamente HO-1 após ativação genética e farmacológica de Nrf2, tanto nos níveis de proteína (Fig. 3D) quanto de mRNA (Fig. 3E). Também confirmamos a regulação de G6PD por Nrf2, conforme observado pelos níveis elevados de G6PD após ativação de Nrf2. A suplementação com um sistema enzimático exógeno gerador de NADPH resgata a expressão proteica de GR e HO-1 em células que foram tratadas com DHEA ou depletadas de glicose (Fig. 4A). O NADPH exógeno também restaurou a expressão de HO-1 dependente de Nrf2 no nível de mRNA em células que foram privadas de glicose ou da atividade de G6PD (Fig. 4B).
Com base nessas descobertas, concluímos que a ativação de Nrf2 estimula a captação celular de glicose e o metabolismo através da PPP para fornecer NADPH, que é fundamental para a desintoxicação de ROS mediada por Nrf2 nos níveis funcional e transcricional.
Discussão
Neste estudo, demonstramos a faceta metabólica do fator de transcrição citoprotetor Nrf2. Nossos achados reforçam a noção de que a ativação de fatores de transcrição ou eventos de sinalização celular, que resultam em uma expressão gênica alterada e em um fenótipo celular modificado (por exemplo, proliferação e inflamação), está indissociavelmente acoplada a mudanças no metabolismo celular e vice-versa. Isso não é diferente com a ativação do Nrf2. Para atender à demanda celular de uma resposta antioxidante aumentada, as células captam mais glicose e a desviam pela via das pentoses-fosfato (PPP) para a produção de NADPH, em linha com a noção de que as enzimas da PPP são, elas próprias, genes-alvo do Nrf2. O NADPH é crucial para manter um sistema tampão celular íntegro contra o estresse redox, fornecendo equivalentes redutores para permitir a reciclagem redox da glutationa ou da tiorredoxina. Além disso, o NADPH é um cofator da NQO1, um gene-alvo validado do Nrf2 envolvido na desintoxicação de quinonas. A NQO1 pode, portanto, estar envolvida na desintoxicação do estresse redox induzido pela menadiona após a ativação do Nrf2, conforme observado na Fig. 3. Como mostramos aqui, a interferência no fluxo de glicose pela PPP prejudicou não apenas a desintoxicação de ROS no nível funcional, devido à disponibilidade insuficiente de NADPH, mas já no nível da expressão gênica desencadeada pelo Nrf2. A expressão de enzimas de desintoxicação de ROS parece ser interrompida se o suprimento adequado de cofatores necessários não for garantido. Tal regulação por feedback pode poupar a célula de uma expressão proteica de novo fútil. Uma ligação entre a PPP e a resposta antioxidante transcricional após uma agressão oxidativa já foi relatada em leveduras, e é muito provável que seja mediada pelo Nrf2 em células de mamíferos.
Nossos achados levantam várias questões que merecem investigações mais detalhadas na interface da desintoxicação celular dependente de Nrf2 e do metabolismo da glicose. Diante do aumento observado na taxa de captação celular de glicose, questões óbvias dizem respeito à conexão entre a sinalização da insulina e o Nrf2, de um lado, e o nível e a localização dos transportadores de glicose após a ativação do Nrf2, do outro. Vale notar que a sinalização da insulina é relatada como ativadora do Nrf2, e tanto a insulina quanto a ativação do Nrf2 desencadeiam a captação celular de glicose. A conexão causal detalhada e a interdependência ainda não foram resolvidas. No entanto, é tentador especular que a insulina, além de seus efeitos anabólicos, ativa o Nrf2, que então é responsável pela desintoxicação dos níveis elevados de glicose e subprodutos (como estresse redox). Um estudo muito recente observou níveis elevados de Glut1 no tecido adiposo marrom devido ao knockdown gradual de Keap1. Será também de interesse elucidar o sensor molecular da razão real NADPH/NADP que decide se a transcrição gênica dependente de Nrf2 ocorre ou não, e em que nível a sinalização do Nrf2 é interrompida. Observamos expressão reduzida de proteína e mRNA dependentes de Nrf2 após interferência na via das pentoses fosfato (PPP). No entanto, ainda não está esclarecido se a translocação nuclear ou a estabilização do Nrf2 também são afetadas. Selecionamos HO-1 e GR como genes-alvo representativos do Nrf2 e observamos que sua expressão é prejudicada pela retirada de glicose e pela interrupção da PPP, respectivamente. Será de interesse examinar em uma futura análise de microarranjo imparcial se todos os genes dependentes de Nrf2 são igualmente afetados ou se há diferenças entre diferentes promotores ou agrupamentos funcionais de genes-alvo dependentes de Nrf2. Além disso, será importante analisar se diferentes ativadores farmacológicos mostram dependência distinta de glicose para desencadear a ativação do Nrf2. Fizemos nossas observações em fibroblastos embrionários de camundongos não malignos. Estudos futuros são necessários para investigar a tonalidade metabólica do Nrf2 em tipos celulares especializados diferenciados. Será, por exemplo, interessante ver como a ativação do Nrf2 afeta a síntese de ácidos graxos e colesterol em hepatócitos, já que esses processos também necessitam de NADPH. Uma vez que a sintase de ácidos graxos é regulada negativamente pelo Nrf2, é concebível que a ativação do Nrf2 direcione o NADPH principalmente para a maquinaria antioxidante e não para biossínteses redutoras.
Além disso, será necessário confirmar nossas observações in vitro feitas em cultura de células em modelos in vivo/órgãos apropriados para considerar a aplicação de ativadores/inibidores de Nrf2 em contextos patológicos. Níveis cronicamente elevados de glicose no sangue, como encontrados em pacientes com diabetes e resistência à insulina, estão associados ao aumento do estresse redox, também devido ao fluxo de glicose através da via do poliol e da hexosamina. Estudos futuros devem esclarecer se a ativação de Nrf2 nessas condições poderia exercer uma dupla ação benéfica: (i) aumentando a captação celular de glicose e desviando a glicose para a via das pentoses-fosfato (PPP) e (ii) concomitantemente, estimulando a resposta antioxidante celular. Estudos que demonstram melhor tolerância à glicose e sensibilidade à insulina após a ativação de Nrf2 em modelos animais de diabetes estão alinhados com essa ideia.
No geral, Nrf2 é um ator proeminente na proteção da célula contra insultos oxidativos e xenobióticos. Neste estudo, revelamos que a ativação de Nrf2 está acompanhada de um aumento na captação celular e metabolismo da glicose através da PPP. A produção subsequente de NADPH é crucial para permitir não apenas a desintoxicação funcional de ROS, mas também a expressão gênica controlada por Nrf2. Este é o primeiro relato a mostrar que a desintoxicação mediada por Nrf2 está conectada a um programa metabólico específico em células de mamíferos não malignas. A disponibilidade de glicose e uma PPP funcional são pré-requisitos aparentes para que Nrf2 exerça plenamente suas propriedades citoprotetoras já no nível da expressão gênica.

Financiamento
Este estudo foi parcialmente apoiado por bolsas do Fundo Austríaco para a Ciência (FWF; P23317 para E.H.H.), da Herzfelder`sche Familienstiftung, bem como do programa de pós-graduação "BioProMoTion" da Universidade de Viena.

Contribuição dos autores
E.H.H. concebeu o estudo, realizou experimentos, analisou e interpretou dados, bem como escreveu o manuscrito. D.S. e K.Z. realizaram experimentos. V.M.D. comentou criticamente o manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a versão final deste manuscrito.

Referências
A via de defesa celular Nrf2: mecanismos de regulação dependentes e independentes de Keap1
Respostas de sobrevivência celular a estresses ambientais via a via Keap1-Nrf2-ARE
A via de defesa celular Keap1-Nrf2 - um alvo terapêutico promissor
Nrf2: um potencial alvo molecular para quimioprevenção do câncer por compostos naturais
Ativação genética versus quimioprotetora da sinalização Nrf2: perfis de expressão gênica sobrepostos, porém distintos, entre camundongos knockout para Keap e tratados com triterpenoides
NRF2 modula a sinalização do receptor de aril hidrocarboneto: influência na adipogênese
Papel de Nrf2 na prevenção da obesidade induzida por dieta rica em gordura pelo triterpenoide sintético CDDO-IM
A deficiência de Nrf2 resulta em adipogênese prejudicada e protege contra obesidade induzida por dieta
Nrf2 redireciona glicose e glutamina para vias anabólicas na reprogramação metabólica
Glucosinolatos e isotiocianatos na saúde e na doença
Novos inibidores esteroides da glicose-6-fosfato desidrogenase
O metabolismo contra-ataca: o fluxo metabólico regula a sinalização celular
A via das pentoses fosfato é um sensor redox metabólico e regula a transcrição durante a resposta antioxidante
A insulina reforça as defesas antioxidantes através da via das quinases reguladas por sinal extracelular - proteína quinase B - fator eritroide nuclear 2 p45 relacionado ao fator 2?
O sistema Keap1-Nrf2 previne o início do diabetes mellitus
O fator 2 relacionado ao NF-E2 inibe o acúmulo de lipídios e o estresse oxidativo em camundongos alimentados com dieta rica em gordura
A depleção do fator 2 relacionado ao fator eritroide nuclear 2 prejudica a tolerância à glicose e exacerba a hiperglicemia em camundongos diabéticos tipo 1
O Oltipraz regula positivamente o sistema antioxidante do fator 2 semelhante ao fator eritroide nuclear 2 (NRF2) e previne a resistência à insulina e a obesidade induzidas por dieta rica em gordura em camundongos C57BL/6J
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A ativação do Nrf2 resulta no aumento da captação celular de glicose e na adição de glicose. (A) Em fibroblastos embrionários de camundongo quiescentes, o Nrf2 foi ativado (barras pretas) por meio da inativação do Keap1 (Keap1−/−) ou tratamento com sulforafano (SFN, 5 µM) por 7 h. A taxa de captação celular de glicose foi determinada conforme descrito em Materiais e métodos. O gráfico compila dados de três experimentos independentes expressos como aumentos relativos em comparação com células do tipo selvagem (WT) com atividade basal de Nrf2 (* p<0,05, teste t de Student, média+EPM). (B) MEFs WT e Nrf2−/− quiescentes foram tratados com veículo (DMSO, D) ou 5 µM de SFN por 7 h antes da determinação da taxa de captação de glicose. O gráfico compila dados de três experimentos independentes expressos como aumentos relativos em comparação com células controle tratadas com veículo (p<0,05, teste t de Student, média+EPM). (C) Células controle com atividade basal de Nrf2 e células com Nrf2 ativado (tratamento com 5 µM de SFN ou células Keap1−/−) foram cultivadas na ausência de glicose conforme indicado. Após os períodos de tempo determinados, a viabilidade celular foi avaliada com base na exclusão de Azul de Tripan e analisada em um analisador automatizado de viabilidade celular. O gráfico representado compila dados de três experimentos independentes. ( p<0,05 (em comparação com células WT no respectivo ponto de tempo, ANOVA, média+EPM)).

A ativação do Nrf2 não altera a taxa glicolítica celular nem a produção de ATP, mas aumenta a razão NADPH/NADP celular. (A) A produção de lactato por MEFs com atividade basal (barras brancas, DMSO(D) ou WT), ativada (barras pretas, SFN (5 µM, 7 h) ou Keap1−/−) ou ausente de Nrf2 (barras cinzas) foi determinada como um indicador da atividade glicolítica celular e normalizada pela concentração de proteína derivada das células. O gráfico de barras representa dados compilados de três experimentos independentes. (B) MEFs com atividade basal (barras brancas, DMSO(D) ou WT), ativada (barras pretas, SFN (5 µM, 7 h) ou Keap1−/−) ou ausente de Nrf2 (barras cinzas) foram examinados quanto aos níveis totais de ATP normalizados pela contagem celular conforme descrito em Materiais e métodos (mM/célula). O gráfico de barras representa dados compilados de três experimentos independentes. (C) A razão NADPH/NADP celular foi determinada em células com atividade basal (barras brancas, WT e D(MSO), respectivamente) e Nrf2 ativado (barras pretas, Keap1−/− e SFN (5 µM, 7 h), respectivamente) conforme descrito em Materiais e métodos e referida ao valor de células WT não tratadas. A glicose-6-fosfato desidrogenase foi inibida por 100 µM de deidroandrostenediona (DHEA) e revelou a via das pentoses fosfato como principal fonte de NADPH. MEFs Nrf2−/− confirmaram a dependência do Nrf2 no aumento da razão NADPH/NADP após tratamento com SFN. (n=3; * p<0,05, ANOVA, Bonferroni, média+EPM).
O fornecimento de glicose e uma via funcional da pentose fosfato são necessários para a desintoxicação dependente de Nrf2 de ROS e expressão de genes alvo selecionados de Nrf2. (A) MEFs selvagens (WT), mantidas em meio com glicose ou sem glicose (−glc) ou com atividade de G6PD prejudicada (DHEA, siG6PD), foram tratadas com DMSO (D, barras brancas) ou 5 µM de SFN (7 h; barras pretas) e estressadas com menadiona (25 µM) conforme indicado. MEFs Nrf2−/− serviram como controle para a ação dependente de Nrf2 de SFN. Em seguida, seus níveis intracelulares de ROS foram determinados com base na fluorescência de DCF oxidado por citometria de fluxo (painel grande). O inserto representa a extensão da desintoxicação mediada por SFN do estresse redox induzido por menadiona ([1-(ΔROS(+menadiona/−menadiona)SFN/−(ΔROS (+menadiona/−menadiona)DMSO)]×100) sob cada condição (n=3; * p<0,05, ANOVA, Dunnett, média+EPM). (B) Os níveis intracelulares de ROS em MEFs Keap1−/− foram determinados no estado basal e após a imposição de estresse oxidativo exógeno por 25 µM de menadiona sob condições de controle (ctrl), após retirada de glicose (−glc), inibição de G6PD por DHEA (100 µM) ou knockdown de G6PD (siG6PD). O gráfico representa a extensão do estresse redox induzido por menadiona em cada condição (ou seja, ΔROS (+menadiona/−menadiona)) (n=3; * p<0,05, ANOVA, Bonferroni, média+EPM). (C) MEFs WT foram tratadas com SFN (5 µM) na presença de glicose ou do inibidor de G6PD DHEA (100 µM) conforme indicado por 7 h antes do nível de expressão dos genes alvo de Nrf2 glutationa redutase (GR) e heme oxigenase (HO-1), bem como o controle de carga actina, ser determinado por análise de western blot. Blots representativos de três experimentos independentes são mostrados. Os números abaixo do blot indicam a média densitométrica relativa de todos os experimentos realizados (normalizada para o respectivo controle de carga). (D) MEFs foram transfectadas com siRNA scrambled (scr) ou siRNA dirigido contra G6PD conforme indicado. A ativação de Nrf2 foi então obtida por knockout de Keap1 (genético g) ou tratamento com SFN (5 µM) por 7 h (farmacológico p). Lisados celulares foram submetidos à análise de western blot para HO-1, G6PD e actina. Blots representativos de três experimentos independentes são mostrados. Os números abaixo dos blots indicam a média densitométrica relativa de todos os experimentos realizados (normalizada para o controle de carga). (E) MEFs foram transfectadas com siRNA scrambled (scr) ou siRNA dirigido contra G6PD conforme indicado. A ativação de Nrf2 foi então obtida por knockout de Keap1 (g) ou tratamento com 5 µM de SFN (p) por 3 h. Os níveis de mRNA de HO-1 foram determinados por análise de RTqPCR. (n=3, * p<0,05, ANOVA, Bonferroni, média+EPM).
Uma via funcional da pentose fosfato e o subsequente fornecimento de NADPH é fundamental para a expressão mediada por Nrf2 de HO-1 e GR. (A) MEFs selvagens foram tratados conforme indicado com SFN (5 µM) por 7 h, na ausência de glicose, na presença de DHEA (100 µM) ou suplementação com uma mistura exógena de regeneração de NADPH no meio, conforme indicado. Os lisados celulares foram submetidos à análise de western blot para os genes alvo de Nrf2 HO-1 ou GR, bem como para actina como controle de carregamento. Blots representativos de três experimentos independentes são mostrados. Os números abaixo dos blots indicam a média densitométrica relativa de todos os experimentos realizados (normalizada ao controle de carregamento). (B) MEFs selvagens foram tratados conforme indicado com SFN (5 µM) por 3 h, na ausência de glicose, na presença de DHEA (100 µM) ou suplementação com uma mistura exógena de regeneração de NADPH no meio, conforme indicado. Os níveis de mRNA de HO-1 foram determinados por análise de RTqPCR. (n=3, * p<0,05, ANOVA, Bonferroni, média+EPM).