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pmid: "22931102"
title: "Farmacocinética e farmacodinâmica da resposta gênica das enzimas de fase II de metabolização de drogas/antioxidantes pelo agente anticancerígeno sulforafano em linfócitos de rato."
authors: "Wang H, Khor TO, Yang Q, Huang Y, Wu TY, Saw CL, Lin W, Androulakis IP, Kong AN"
journal: "Molecular pharmaceutics"
pubdate: "2012 Oct 01"
doi: ""
source: "PMC Full Text"

Farmacocinética e farmacodinâmica da resposta gênica das enzimas de fase II de metabolização de drogas/antioxidantes pelo agente anticancerígeno sulforafano em linfócitos de rato.

Autores

Wang H, Khor TO, Yang Q, Huang Y, Wu TY, Saw CL, Lin W, Androulakis IP, Kong AN

Periodico

Molecular pharmaceutics (2012 Oct 01)

Conteudo

Farmacocinética e Farmacodinâmica da Resposta Gênica de Enzimas Metabolizadoras de Fase II/Enzimas Antioxidantes pelo Agente Anticâncer Sulforafano em Linfócitos de Ratos

OBJETIVO
Este estudo avalia a farmacocinética (FC) e a farmacodinâmica (FD) do aumento da expressão mediada por Nrf2 de enzimas metabolizadoras de fármacos (EMF) de fase II e enzimas antioxidantes, que representa um componente importante da quimioprevenção do câncer em linfócitos de ratos após administração intravenosa (i.v.) do fitoquímico anticâncer sulforafano (SFN).

MÉTODOS
SFN foi administrado por via intravenosa a quatro grupos de ratos machos Sprague-Dawley JVC, cada grupo composto por quatro animais. Amostras de sangue foram coletadas em pontos de tempo selecionados. Plasma foi obtido de metade das amostras de sangue e analisado utilizando um método validado de LC-MS/MS. Linfócitos foram coletados das amostras de sangue restantes utilizando meio de centrifugação Ficoll-Paque™ Plus. RNAs de linfócitos foram extraídos, convertidos em cDNA, e análises de PCR em tempo real quantitativo foram realizadas, e as alterações de expressão relativa dos genes alvo de Nrf2 das EMF de fase II/enzimas antioxidantes foram calculadas em relação ao tempo zero. A modelagem FC-FD foi conduzida com base no modelo de resposta indireta (IDR) de Jusko, utilizando GastroPlus™ e o Método Bootstrap.

RESULTADOS
A concentração plasmática de SFN diminuiu biexponencialmente e os parâmetros farmacocinéticos foram gerados. Os níveis de expressão de mRNA em linfócitos de ratos não mostraram alteração para GSTM1, SOD, NF-κB, UGT1A1 ou UGT1A6. Aumentos moderados (2-5 vezes) em relação ao tempo zero foram observados para HO-1, Nrf2 e NQO1, e aumento significativo (> 5 vezes) para GSTT1, GPx1 e Maf. As análises FC-FD utilizando GastroPlus™ e o Método Bootstrap forneceram ajuste razoável para os perfis e estimativas de parâmetros da FC e FD.

CONCLUSÃO
Nosso presente estudo mostra que o SFN pode induzir a expressão de mRNA de EMF de fase II/enzimas antioxidantes mediada por Nrf2 para NQO1, GSTT1, Nrf2, GPx, Maf e HO-1 em linfócitos de ratos após administração i.v., sugerindo que a expressão de mRNA mediada por Nrf2 em linfócitos pode servir como biomarcadores substitutos. O modelo IDR FC-FD, que simultaneamente relaciona as concentrações plasmáticas de SFN e a resposta FD da expressão de mRNA em linfócitos, é valioso para quantificar os efeitos mediados por Nrf2 do SFN. Este estudo pode fornecer um arcabouço conceitual para futuros estudos clínicos de FC-FD de agentes quimiopreventivos do câncer presentes na dieta em humanos.

INTRODUÇÃO
Sulforafano (SFN, 4-metilsulfinilbutil isotiocianato) é um isotiocianato natural, que foi primeiramente identificado em extratos de brócolis como um indutor principal da atividade da NAD(P)H quinona oxidoredutase 1 (NQO1) ou quinona redutase (QR). Subsequentemente, numerosos estudos celulares e em animais demonstraram seus fortes efeitos quimiopreventivos anticâncer.
O SFN é metabolizado através da via do ácido mercaptúrico, começando pela conjugação com GSH pela glutationa S-transferase (GST) e subsequentemente gerando SFN-cisteína seguido de SFN-N-acetilcisteína (NAC). Após ser identificado como um potencial agente quimiopreventivo do câncer, o SFN tem sido estudado como modulador do metabolismo de fase I através da inibição direta das enzimas do citocromo P450 (CYP) ou da regulação de sua transcrição de mRNA, como um potente indutor das enzimas de metabolismo de fármacos (DME) de fase II/enzimas antioxidantes, e como inibidor da ativação de carcinógenos mediada por DME através da expressão gênica mediada pelo elemento de resposta antioxidante (ARE). Esses genes mediados por ARE incluem NQO1, GST, e a enzima antioxidante heme oxigenase (HO-1), além de outros genes DME de fase II. A regulação dos genes DME de fase II/antioxidantes alvo do ARE para a desintoxicação de carcinógenos/espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (RONS) é tipicamente mediada pelo fator de transcrição, fator nuclear E2 relacionado ao fator 2 (Nrf2).
O Nrf2, um membro da família NF-E2 de zíper de leucina básico (bZIP), é tipicamente sequestrado no citosol da célula pela proteína 1 associada ao ECH tipo Kelch (Keap1), uma proteína rica em cisteína que interage com o Nrf2 em sua forma dimérica sob condição basal não estimulada. O SFN parece reagir com os grupos tiol da Keap1 e promover a dissociação do Nrf2 da Keap1. Subsequentemente, o Nrf2 transloca-se para o núcleo, formando um heterodímero com um grupo de proteínas nucleares bZIP, as proteínas Maf. As proteínas Maf, que não possuem o domínio de transativação, aumentam a ligação do Nrf2/Maf ao enhancer cis-atuante ARE localizado na região promotora de uma série de genes DME de fase II/antioxidantes citoprotetores. O Nrf2 e os genes alvo do Nrf2 estão intimamente ligados à quimioprevenção do câncer. Por exemplo, a deleção genética (KO) do Nrf2 tornaria os animais mais propensos ao câncer induzido por carcinógenos, e que um agente quimiopreventivo como o SFN perderia sua eficácia quimiopreventiva em camundongos Nrf2 KO. As funções do Nrf2 e dos genes alvo downstream do Nrf2, incluindo GSTs, HO-1 e NQO1, mostraram ser importantes para a proteção contra estresse oxidativo ou danos celulares induzidos por produtos químicos no fígado, pulmão, bem como na prevenção do câncer no trato gastrointestinal. Em um de nossos estudos anteriores, o SFN foi estudado no fígado de camundongos Nrf2 selvagens (+/+) e camundongos Nrf2 knockout (−/−). Os genes induzidos pelo SFN nos camundongos selvagens, mas não nos camundongos Nrf2 knockout (KO), foram classificados como genes indutíveis por SFN dependentes de Nrf2. Os genes alvo do Nrf2 que são regulados positivamente em nível indutível pelo Nrf2 foram identificados como potenciais marcadores substitutos de quimioprevenção. Portanto, a expressão gênica de fase II/antioxidante mediada por Nrf2 pode estar ligada à quimioprevenção do câncer com base nesses estudos anteriores e pode servir como biomarcadores valiosos ou marcadores substitutos em ensaios clínicos.
Numerosos estudos foram realizados com SFN sobre os mecanismos de bloqueio preventivo do câncer e a supressão por meio de mecanismos antiproliferativos. Estudos de metabolismo, biodisponibilidade, farmacocinética, pré-clínicos e clínicos sobre SFN também foram conduzidos para entender melhor seu desempenho in vitro e in vivo. Anteriormente, relatamos a farmacocinética in vivo e os perfis de expressão gênica hepática usando análise de microarranjo de 4.967 oligonucleotídeos após administração por gavagem oral de 50 μmol de SFN em ratos, e a farmacocinética e farmacodinâmica de brotos de brócolis que geram SFN na supressão do câncer de próstata em camundongos TRAMP. No entanto, nenhum estudo até o momento envolveu a ligação simultânea da farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD) do SFN, especialmente nos linfócitos, um tecido de fácil acesso. Além disso, não há relato ligando diretamente a concentração plasmática de SFN e a expressão gênica de linfócitos, o que poderia potencialmente ser um biomarcador substituto valioso para a quimioprevenção do câncer em estudos clínicos de SFN ou outros agentes quimiopreventivos do câncer. Neste estudo, relatamos a PK no plasma de ratos e a PD da expressão gênica da Fase II DME/antioxidante em linfócitos de ratos após administração intravenosa (i.v.) de 25 mg/kg de SFN nos ratos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Ratos Sprague-Dawley machos pesando entre 250 e 300 g com cânulas na veia jugular (JVC) foram adquiridos da Hilltop Lab Animals Inc. (Scottdale, PA). Os animais foram alojados no Centro de Cuidados Animais da Universidade Rutgers sob ciclos claro-escuro de 12 horas com livre acesso a água e comida. Ao chegarem, os ratos receberam a dieta AIN-76A (Research Diets, New Brunswick, NJ) livre de antioxidantes e foram aclimatados às condições laboratoriais por 3 dias. Devido à pequena quantidade de linfócitos no sangue e à quantidade limitada de sangue que pode ser coletada em cada ponto temporal de um rato, quatro grupos de ratos, cada um composto por quatro animais (total n=16 ratos), receberam SFN em solução salina a 0,9% por meio de uma dose em bolus i.v. de 25 mg/kg através das cânulas na veia jugular, seguidas de lavagem com um volume de solução salina. Amostras de sangue (300 μL) foram coletadas alternadamente para cada rato em 0, 2, 5, 15, 30, 45 minutos, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 16 ou 24 horas após a administração de SFN, de modo que o volume total de sangue coletado fosse inferior a 10% do volume total de sangue do rato. As amostras de sangue dentro de um grupo (n=3 a 4 ratos) em cada ponto temporal foram misturadas e aproximadamente 1,0 mL de sangue seria usado para a coleta confiável de plasma e linfócitos. O plasma foi imediatamente separado da metade da amostra de sangue coletada por centrifugação e armazenado a −80°C até a análise. Os linfócitos foram extraídos imediatamente das amostras de sangue restantes usando o meio de centrifugação por gradiente de densidade Ficoll-Paque™ PLUS (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) e foram dissolvidos no tampão RLT do kit Qiagen RNeasy® Mini (tampão de lise) (Valencia, CA). As amostras de tampão RLT contendo linfócitos lisados foram congeladas a −80°C até as análises.
Análise Plasmática e Bioanalítica As concentrações do fármaco no plasma foram determinadas usando espectrometria de massa em tandem LC-MS/MS (MicroMass Quattro Ultima). O método foi validado seguindo o Guia da Food and Drug Administration (FDA) para a Indústria para Validação de Métodos Bioanalíticos em um estudo separado. Resumidamente, 50 μL de amostras de plasma foram precipitados usando metanol contendo 0,1% de TFA. O padrão interno, sulforafeno, foi adicionado e as misturas foram vortexadas e centrifugadas a 10.000 g a 4°C por 3 minutos. Os sobrenadantes foram coletados e secos em corrente de nitrogênio e, em seguida, reconstituídos com uma mistura de acetonitrila:água (50/50, v/v) e passados por filtros de náilon (Analytical Sales and Services, Pompton Plains, NJ). O sistema LC-MS/MS era composto por um sistema HPLC Agilent 1100 equipado com uma coluna Develosil® 150 × 4,6 mm 5 μm C30. SFN, seus principais metabólitos SFN-NAC e SFN-GSH (ver estruturas químicas na Figura 1) foram detectados no modo MRM e quantificados pela razão da área do pico. O MassLynx™ versão 3.5 foi usado para o processamento de dados. O limite de quantificação do método foi validado em 1 ng/mL para SFN, 10 ng/mL para SFN-GSH e para SFN-NAC. Os dados farmacocinéticos foram analisados usando o GastroPlus™ versão 6.0.
RNA de linfócitos e qRT-PCR
As soluções de tampão RLT de linfócitos foram descongeladas e processadas para extrair o RNA total seguindo o protocolo do kit Qiagen RNeasy® Mini.
As concentrações de RNA total foram medidas usando reagentes Invitrogen (Carlsbad, CA) Quant-It™ e sua pureza foi verificada usando o método espectrofotométrico A260/A280.
A mesma quantidade de RNA (250 ng) foi usada para transcrição reversa para obter cDNA com reagente Applied Biosystems™ Taqman® e oligo DT.
As análises de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) foram conduzidas usando Applied Biosystems™ SYBR® Green Master Mix (Foster City, CA).
As análises de qRT-PCR foram realizadas em um Applied Biosystems™ PRISM® 7900HT seguindo o protocolo laboratorial estabelecido do método delta-delta Ct.
O ciclo térmico foi realizado em triplicata para cada amostra de cDNA de acordo com o seguinte perfil: 2 minutos a 50,0°C, 10 minutos a 95°C para a reação da transcriptase reversa, seguido por 40 ciclos de PCR em tempo real de 10 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 1 minuto a 68,0°C, com um estágio de dissociação final subsequente de 15 segundos a 95,0°C, 15 segundos a 60,0°C e 15 segundos a 95,0°C.
Os resultados de Quantificação Relativa (RQ) foram processados com o software Applied Biosystems™ Sequence Detection System (SDS) versão 2.0 e o software Relative Quantitation (RQ) Manager versão 1.2 para obter as expressões relativas de mRNA em cada ponto de tempo em relação às suas respectivas expressões no tempo zero.
O gene de manutenção β-actina foi usado para a normalização do nível de mRNA.
Os primers oligonucleotídeos usados para PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) foram desenhados usando Nucleotide do www.ncbi.nlm.nih.gov e PrimerQuest (SM) da Integrated DNA Technologies (www.idtdna.com, Coralville, IA) com tamanho de amplicon de 120 a 200 pb, como em estudos anteriores em nosso laboratório.
Os dados farmacodinâmicos de expressão gênica foram processados com o modelo GastroPlus™ 6.0 Indirect Response (IDR) (Jusko) conforme descrito abaixo.

Desenvolvimento do Modelo PK/PD

O curso temporal da concentração plasmática de SFN combinada foi ajustado de acordo com o seguinte sistema de dois compartimentos de equações diferenciais (1) e (2) e o perfil PK resultante foi inserido no modelo PD (3) abaixo: onde kpc, kcp representam as constantes de taxa intercompartimentais entre os compartimentos central (c) e periférico (p); CL, depuração total do compartimento central; Vc, volume do compartimento central; Ac e Ap, quantidade de fármaco no compartimento central e periférico, respectivamente.
A resposta farmacodinâmica (PD) investigada neste estudo é o nível de expressão relativa dos genes da Fase II/antioxidantes. Um modelo de resposta indireta com estímulo da entrada (kin) pelo tratamento é empregado para descrever o perfil temporal da resposta (PD). A equação é mostrada abaixo: onde a função estimulatória (ou seja, o estímulo de kin) foi dada pela função de para todos os genes da Fase II/antioxidantes investigados neste estudo. A condição inicial é definida como E(0)=1. Os símbolos dos parâmetros estão definidos nas Abreviações. Todos os parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos foram estimados por análise de regressão não linear utilizando o estimador de máxima verossimilhança no GastroPlus™.

Avaliação dos Parâmetros Farmacodinâmicos e Intervalos de Confiança por Métodos Bootstrap Para calibrar os valores estimados pelo GastroPlus™ versão 6.0 acima, aplicamos em seguida um bootstrap em conjunto com métodos de mínimos quadrados. Este método oferece uma estimativa robusta dos valores dos parâmetros, bem como dos intervalos de confiança associados, conforme demonstramos anteriormente no contexto da modelagem de resposta indireta. A vantagem deste método é que ele pode considerar cada réplica em um ponto temporal experimental, em vez de uma estimativa baseada apenas na média de todas as réplicas em um ponto temporal. Para cada execução de bootstrap em cada ponto temporal individual, é realizada uma amostragem com reposição em todas as réplicas naquele ponto temporal, cujo número pode variar com base na coleta de dados do experimento. Cada amostra bootstrap foi utilizada para estimar um conjunto de parâmetros para esses quatro parâmetros Smax, SC50, kin e kout, conforme prescrito pelo modelo de resposta indireta do Dr. Jusko. , a média das múltiplas estimativas bootstrap (1.000 execuções neste estudo) é relatada como o valor mais provável do parâmetro, onde i denota a iteração do bootstrap.

Os intervalos de confiança para cada um dos parâmetros estimados foram calculados aplicando o método dos percentis. O intervalo de confiança estimado para cada parâmetro foi denotado como , onde os subscritos l e u denotam, respectivamente, os limites inferior e superior do vetor do valor estimado do parâmetro β, que foi aproximado por um intervalo de confiança central α. Os valores percentis 100 (α/2) e 100 (1-α/2) dos 1.000 valores de estimativa são usados como os limites de confiança superior e inferior para um parâmetro. A probabilidade α (0<α<1) indica uma confiança de 100α% de que . Neste estudo, α foi escolhido como 0,05; então, os limites de confiança de 95% para β com base em 1.000 replicações bootstrap foram dados pelas maiores estimativas de β. A simulação e a predição bootstrap neste estudo foram realizadas utilizando MATLAB.

RESULTADOS
Farmacocinética do SFN
SFN e seus principais metabólitos SFN-GSH e SFN-NAC, os perfis concentração-tempo são exibidos na Figura 2. Os parâmetros estimados do modelo PK de dois compartimentos estão listados na Tabela 1 para SFN, e nos Dados Suplementares para os metabólitos SFN-NAC e SFN-GSH. Os parâmetros farmacocinéticos revelam que o modelo PK de dois compartimentos se ajustou bem aos perfis de concentração plasmática versus tempo de SFN, SFN-NAC e SFN-GSH, enquanto o %CV dos parâmetros farmacocinéticos estimados foi relativamente baixo. Como em estudos anteriores, o SFN forma primeiro o conjugado SFN-GSH, seguido pelo SFN-NAC. Ambos os metabólitos podem exercer suas atividades biológicas. No entanto, em nosso estudo anterior, verificou-se que o SFN é a forma principal, onde apenas 12,5% e 9,1% da dose de SFN estão nas formas de SFN-GSH e SFN-NAC com base nas razões molares da AUC. Portanto, neste estudo, limitamos nosso esforço de modelagem ao SFN. As estimativas dos parâmetros PK de dois compartimentos do SFN geradas pelo software foram então utilizadas como entrada do PK para ajustar os dados de PK-PD do SFN, conforme descrito abaixo.

qRT-PCR de mRNA de Linfócitos e Relações PK/PD

A expressão de mRNA dos genes selecionados da Fase II DME/antioxidante foi quantificada por qRT-PCR. Utilizando o modelo de resposta indireta Tipo III do Dr. Jusko – estimulação de kin, conforme descrito na Equação 3, as relações PK/PD entre a concentração de SFN e os níveis de expressão de vários genes foram ajustadas usando o GastroPlus™ e os resultados são mostrados na Figura 4. Os perfis observados (fold changes da expressão de mRNA versus tempo) para NQO1, GPx-1, GSTT1, Nrf2, HO-1 e a pequena proteína Maf (uma proteína que heterodimeriza com Nrf2 no núcleo) mostram que a expressão desses genes da Fase II e relacionados nos linfócitos é induzida pelo tratamento com SFN. Os parâmetros farmacodinâmicos estimados são mostrados na Tabela 2. Os valores de SC50 variam de 0,26 μg/mL (1,47 μM) para NQO1 (mais sensível) a 8 μg/mL (45,2 μM) para HO-1 (menos sensível) e Smax varia de 1,55 vezes para HO-1 (menos responsivo) a 39,7 vezes para GPx (mais responsivo). kin e kout são semelhantes para todos os genes da Fase II DME/antioxidante, sugerindo que suas cinéticas de produção e degradação parecem ser semelhantes.

Os mRNAs para os outros genes da Fase II DME/antioxidante mediados por Nrf2, GSTM1, UGT1A1, SOD, NF-κB e UGT1A6 não mostram alterações mensuráveis após o tratamento com SFN na dose administrada no estudo.

Confirmação Bootstrap

A estimativa dos valores dos quatro parâmetros para cada gene e os intervalos de confiança para os parâmetros são mostrados na Tabela 3. Histogramas de 1.000 estimativas bootstrap dos quatro parâmetros para quatro genes selecionados são apresentados na Figura 5. Os valores estimados obtidos pelo GastroPlus™ versão 6.0 (Tabela 2) são semelhantes aos estimados pelo método bootstrap (Tabela 3), o que indica que os parâmetros estão bem estimados.

DISCUSSÃO
SFN, um isotiocianato (ITC), é um antioxidante indireto bem conhecido que induz enzimas DME de fase 2/antioxidantes dependentes de Nrf2. Foi listado como um dos trinta e quatro agentes anticarcinogênese pela Biblioteca Nacional de Medicina (NLM), bem como um dos indutores mais potentes de DME de Fase II entre os muitos compostos fitoquímicos dietéticos de ocorrência natural. Nossos resultados de estudos não publicados anteriores mostraram que doses i.v. de 10 e 25 mg/kg demonstraram comportamentos farmacocinéticos lineares em ratos, e doses i.v. de 50 mg/kg ou superiores exerceram toxicidade de curto prazo ou até morte. Portanto, o nível de dose alto, porém tolerável, de 25 mg/kg foi selecionado neste estudo para estabelecer a relação PK-PD em linfócitos de ratos para uma estimativa de parâmetro mais confiável. O nível de dose de 25 mg/kg de sulforafano em ratos via i.v., que não é alcançável a partir da alimentação, poderia ser usado como um nível de dose equivalente no tratamento clínico. Os resultados mostram que a indução de Nrf2 foi modesta e não foi tão significativa quanto alguns dos outros genes de Fase II (NQO1, GSTT1 ou GPx1). Danilov e colegas descobriram anteriormente que o pré-tratamento com SFN por 48 horas diminuiu a morte celular de astrócitos corticais de ratos cultivados e aumentou a expressão do mRNA de Nrf2 em cerca de 3,44 vezes medida por RT-PCR. O nível de indução de Nrf2 em nosso estudo parece ser semelhante a este e a outros estudos.

NQO1 desintoxica a quinona e seus derivados para proteger as células contra o ciclo redox e o estresse oxidativo. Embora caracterizada como proteína de Fase I com citocromos p450s, bem como enzima de Fase II, a NQO1 tem sido relatada como uma enzima altamente indutível e é regulada pela via Keap1/Nrf2/ARE. Muitos produtos químicos induzem NQO1, que subsequentemente se mostram protetores contra os efeitos tóxicos e carcinogênicos causados por uma ampla variedade de carcinógenos in vivo. SFN tem demonstrado induzir fortemente NQO1. A regulação de NQO1 pela via Keap1/Nrf2/ARE foi recentemente revisada por Dinkova et al. Em nosso presente estudo, SFN induz a expressão do mRNA de NQO1 em cerca de quatro vezes em linfócitos de ratos com o efeito máximo alcançado no tempo de ~1,6 hora após administração i.v. A resposta rápida poderia ser potencialmente alcançada por meio de fatores de transcrição de ação rápida, como Nrf2, que não exigiriam síntese proteica, mas translocação nuclear para a ativação da transcrição de seus genes-alvo.

O fator musculoaponeurótico (Maf) é uma pequena proteína que se associa a fatores de transcrição bZIP, incluindo Nrf2, e se liga ao ARE e inicia a transcrição de genes DME de Fase II/antioxidantes. Após administração i.v. de SFN, o mRNA de Maf aumenta significativamente em linfócitos de ratos com um tempo de efeito máximo de 1,0 hora, semelhante ao de Nrf2 (1,2 hora). Esse aumento pode facilitar sua síntese proteica e subsequente heterodimerização com Nrf2 para aumentar ainda mais a transativação dos genes-alvo a jusante de Nrf2, como DME de Fase II.
HO-1 controla a degradação do heme e o acúmulo de ferro, bilirrubina e monóxido de carbono (CO), o que atenuaria os danos oxidativos nos tecidos/células gastrointestinais. Foi demonstrado que a HO-1 é diretamente regulada pelo Nrf2, embora estudos também tenham descoberto que outros mecanismos de regulação transcricional são conhecidos por existir para a HO-1, por exemplo, Bach1. Como a HO-1 é regulada por múltiplos mecanismos além do Nrf2, outros genes alvo do Nrf2 seriam necessários para quantificar como biomarcadores da ativação do Nrf2. Conforme mostrado em nosso presente estudo, embora o aumento da expressão do mRNA de HO-1 seja observado em linfócitos de ratos após o tratamento com SFN, a expressão do mRNA de HO-1 parece apresentar maior variação dos valores previstos e poderia ser possivelmente explicada por sua regulação transcricional por múltiplos mecanismos, sendo necessário um estudo adicional para compreender completamente os mecanismos de expressão da HO-1 e suas contribuições.

A síntese de glutationa (GSH) é regulada pelo Nrf2/Nrf1 por meio do ARE, da proteína ativadora 1 (AP-1) e do fator nuclear kappa B (NF-κB). As glutationa S-transferases GSTM1 e GSTT1 são os dois subtipos de GST mais estudados. Neste estudo, descobrimos que a GSTM1 não apresentou qualquer alteração óbvia após a administração de SFN, no entanto, a GSTT1 foi moderadamente induzida em linfócitos de ratos 1 hora após a administração de SFN. Esta observação indica que diferentes subtipos de GSTs têm respostas diferentes ao SFN em linfócitos de ratos.

Neste estudo, os genes mediados pelo Nrf2 foram selecionados com base no entendimento atual desta via de sinalização. O Nrf2 é sequestrado pelo Keap1; ao entrar no núcleo, o Nrf2 forma um heterodímero com Maf. NQO1, GST, UGT, HO-1, SOD e GPx1 foram relatados anteriormente em outros tecidos e são genes a jusante bem estabelecidos do Nrf2; NF-κB e Nrf2 podem fazer cross-talk entre si e também podem ser de interesse. Normalmente, as alterações na expressão do mRNA ocorrem em um intervalo de tempo de horas. Portanto, uma coleta de dados de 24 horas é considerada suficientemente longa para observar as alterações da expressão primária do mRNA, sejam elas induzidas ou suprimidas por um fármaco, especialmente neste estudo in vivo com administração i.v.
Alguns genes, como UGT1A1, UGT1A6, SOD, GSTM1 e NF-κB, não apresentaram alterações óbvias nos níveis de expressão de mRNA neste estudo. A UGT é responsável pela glucuronidação e está envolvida em uma via importante para eliminar xenobióticos. Em um estudo que investigou a modulação do resveratrol nas DME em linfócitos de humanos saudáveis, as atividades da UGT1A1 e GST foram minimamente afetadas. Isso parece ser consistente com a observação em nosso estudo. A SOD desempenha um papel antioxidante na célula. Em um estudo recente, o mirtilo causou um aumento médio na atividade da SOD de 1,51 U/mg (grupo controle salino) para 1,63 U/mg (grupo tratado com suco de mirtilo) em células hepáticas de camundongos. Embora o aumento seja estatisticamente significativo nesse estudo, um aumento relativo semelhante pode não ser capturado nos linfócitos do nosso estudo. O NF-κB tem sido um regulador de genes que controlam a resposta imune, inflamação, proliferação celular e sobrevivência celular. Sua possível comunicação cruzada com o Nrf2 parece ser inconclusiva. Neste estudo, o NF-κB não mostrou alteração óbvia no mRNA e mais estudos são necessários para investigar seu possível papel na via do Nrf2.

O método bootstrap é um processo autossustentável que ocorre sem quaisquer entradas instrucionais externas. Ao aplicar esse método em nosso estudo, ele forneceu uma avaliação secundária da estimativa dos parâmetros farmacodinâmicos gerada pelo GastroPlus™, e os resultados obtidos de ambos os métodos foram semelhantes.

No presente estudo, uma dose única de SFN e seus efeitos sobre o mRNA de enzimas de fase II/antioxidantes em linfócitos foram avaliados. No entanto, o nível de dose única pode ter restringido a avaliação farmacológica e de modelagem PK-PD. Embora o nível de expressão gênica no tempo zero (pré-tratamento) em amostras de sangue coletadas em diferentes horas do dia tenha sido estimado, os efeitos circadianos da expressão de mRNA das enzimas de fase II e antioxidantes podem precisar ser avaliados em futuros estudos pré-clínicos. Além disso, após a extração dos linfócitos pelo meio Ficoll-Paque™ PLUS, uma medição da quantidade de células linfocitárias e o uso do mesmo número de linfócitos podem ajudar a reduzir a variabilidade da medição de mRNA. Como as amostras de sangue obtidas de quatro ratos foram misturadas neste estudo, a variabilidade na medição da farmacocinética e farmacodinâmica pode ser diferente daquelas obtidas de ratos individuais.
Em conclusão, neste estudo, realizamos a avaliação farmacocinética e farmacodinâmica após administração i.v. de SFN em ratos. Farmacodinamicamente, o SFN induziu a expressão de mRNA de fase II DME/antioxidante mediada por Nrf2, incluindo NQO1, GSTT1, Nrf2, GPx, Maf e HO-1 em linfócitos de ratos após administração i.v., sugerindo que a expressão de mRNA mediada por Nrf2 em linfócitos pode servir como biomarcadores substitutos potenciais. Relacionamos as concentrações plasmáticas de SFN e os níveis de expressão de mRNA mediada por Nrf2 aplicando os modelos PD IDR. Como a concentração plasmática e os níveis de mRNA foram medidos a partir das mesmas amostras de sangue agrupadas, as relações farmacocinéticas e farmacodinâmicas resultantes puderam ser descritas simultaneamente ao longo do período do estudo. O tecido sanguíneo de fácil acesso, um tecido muito singular em animais, combinado com a moderna LC-MS/MS e PCR quantitativa em tempo real, tornaria possível essa ligação direta PK-PD. A abordagem de estudo pré-clínico apresentada neste relatório pode fornecer uma estrutura para futuros estudos clínicos na avaliação de um candidato a fármaco quanto ao seu possível efeito na expressão gênica de linfócitos, por exemplo, como nos estudos clínicos recentes que utilizaram brotos de brócolis contendo SFN. A extração de linfócitos do sangue humano pode ser facilmente realizada usando kits comerciais. Analisando as alterações na expressão gênica dos linfócitos, em conjunto com estudos farmacocinéticos, nossa abordagem de estudo pode levar a uma melhor compreensão dos efeitos farmacológicos iniciais de um fármaco no organismo e a uma possível modelagem e simulação PK-PD em estudos clínicos.
Material Suplementar
Divulgação de Potenciais Conflitos de Interesse Nenhum potencial conflito de interesses foi divulgado.
Informações de Apoio As Informações de Apoio (SI) incluem tabelas da análise de 2 compartimentos de SFN-GSH e SFN-NAC em plasma de rato. Este material está disponível gratuitamente pela Internet em http://pubs.acs.org.
Abreviações
ARE
elemento de resposta antioxidante
DME
enzima de metabolismo de fármacos;
GSTM1
glutationa S-transferases mu 1
GSTT1
glutationa S-transferases teta 1
HO-1
hemeoxigenase-1
JVC
cânulas na veia jugular
kin
taxa de turnover de entrada
kout
taxa de turnover fracionária para perda
NF-κB
Fator nuclear kappa B
NQO1
NAD(P)H quinona oxidoredutase 1
Nrf2
fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2
qRT-PCR
reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real
ROS
espécies reativas de oxigênio
Smax
efeito máximo atribuído à estimulação do fármaco
SC50
concentração do fármaco que produz 50% da estimulação máxima alcançada no local de efeito
SOD
superóxido dismutase
UGT1A1
UDP glucuronosiltransferase 1 família, polipeptídeo A1
UGT1A6
UDP glucuronosiltransferase 1 família, polipeptídeo A6
REFERÊNCIAS
Isotiocianatos como agentes quimiopreventivos do câncer: suas atividades biológicas e metabolismo em roedores e humanos
Um grande indutor de enzimas protetoras anticarcinogênicas do brócolis: isolamento e elucidação da estrutura
A diversidade química e distribuição de glucosinolatos e isotiocianatos entre plantas
Inibição induzida por sulforafano e isotiocianato de fenetila da genotoxicidade mediada por aflatoxina B1 em hepatócitos humanos: papel do genótipo GSTM1 e expressão do gene CYP3A4
Indução do metabolismo/transporte de fases I, II e III de fármacos por xenobióticos
Regulação da sinalização do fator 2 relacionado ao NF-E2 para quimioprevenção do câncer: antioxidante acoplado ao anti-inflamatório
Regulação do sistema Keap1/Nrf2 pelo sulforafano quimiopreventivo: implicações de modificações pós-traducionais
Integração e diversidade da rede regulatória composta pelas famílias Maf e CNC de fatores de transcrição
Mecanismos regulatórios que controlam a expressão gênica mediada pelo elemento de resposta antioxidante
Direcionamento da sinalização NRF2 para quimioprevenção do câncer
A inibição da tumorigênese cutânea induzida por 7,12-dimetilbenz(a)antraceno em camundongos C57BL/6 pelo sulforafano é mediada pelo fator 2 relacionado ao fator nuclear E2
Fator 2 relacionado ao fator nuclear eritroide 2 como alvo quimiopreventivo no câncer colorretal
Perfis de expressão gênica induzidos pelo isotiocianato sulforafano quimiopreventivo do câncer no fígado de camundongos C57BL/6J e camundongos C57BL/6J/Nrf2 (−/−)
Alvos moleculares do isotiocianato de fenetila dietético e do sulforafano para quimioprevenção do câncer
Farmacocinética in vivo e regulação dos perfis de expressão gênica pelo isotiocianato sulforafano em ratos
Farmacocinética e farmacodinâmica de brotos de brócolis na supressão do câncer de próstata em camundongos com adenocarcinoma transgênico de próstata (TRAMP): implicação da indução de Nrf2, HO-1 e apoptose e da supressão da via da quinase dependente de Akt
Desenvolvimento e validação de um método de cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem para a determinação simultânea de sulforafano e seus metabólitos no plasma de ratos e sua aplicação em estudos farmacocinéticos
Um novo modelo matemático para quantificação relativa em RT-PCR em tempo real
Comparação de quatro modelos básicos de respostas farmacodinâmicas indiretas
Estimativa bootstrap do coeficiente de transferência de massa de uma piscina de líquido em fase não aquosa em dissolução em meios porosos
Um modelo quantitativo de inflamação aguda induzida por lesão térmica
Biotransformação do isotiocianato sulforafano natural em ratos: identificação de metabólitos de fase I e conjugados de glutationa
Efeitos da glutationa na expressão gênica mediada pelo elemento de resposta antioxidante e na apoptose provocada pelo sulforafano
Os níveis de acúmulo intracelular total de isotiocianatos dietéticos determinam sua atividade na elevação da glutationa celular e na indução de enzimas de desintoxicação de Fase 2
O sulforafano protege os astrócitos contra o estresse oxidativo e a morte tardia causados pela privação de oxigênio e glicose
Mecanismo de ação do sulforafano: inibição das isoformas da proteína quinase ativada por mitógeno p38 contribuindo para a indução da heme oxigenase-1 mediada pelo elemento de resposta antioxidante em células de hepatoma humano HepG2
Regulação da expressão da carbonil redutase 3 humana (CBR3; SDR21C2) por Nrf2 em células cancerígenas cultivadas
Mecanismos de indução de enzimas que protegem contra a carcinogênese química
Descoberta e desenvolvimento do sulforafano como um fitoquímico quimiopreventivo do câncer
NAD(P)H:quinona aceitadora oxidoredutase 1 (NQO1), uma enzima antioxidante multifuncional e citoprotetora excepcionalmente versátil
Um heterodímero Nrf2/Maf pequeno medeia a indução de genes de enzimas de desintoxicação de fase II através de elementos de resposta antioxidante
O papel do monóxido de carbono no trato gastrointestinal
Nrf2, um fator de transcrição Cap’n’Collar, regula a indução do gene da heme oxigenase-1
Complexo de ligação ao DNA multivalente gerado por Maf pequeno e Bach1 como uma possível base bioquímica para o complexo da região de controle do locus da beta-globina
A indução da heme oxigenase-1 por NRF2 requer a inativação do repressor transcricional BACH1
Interação de longo alcance de elementos de DNA cis mediada pelo fator de transcrição arquitetural Bach1
Nrf2 ao resgate: efeitos da resposta antioxidante/eletrofílica no fígado
Regulação da síntese de glutationa
Mecanismo diferencial in vivo de quimioprevenção da formação de tumores em camundongos tratados com azoximetano/dextran sulfato de sódio por PEITC e DBM
A ativação da sinalização antioxidante Nrf2 atenua a resposta inflamatória NFkappaB e induz apoptose
Desenvolvimento de modelos farmacocinéticos-farmacodinâmicos translacionais
O resveratrol modula enzimas metabolizadoras de fármacos e carcinógenos em um estudo com voluntários saudáveis
Efeito do mirtilo nas funções hepáticas e imunológicas em camundongos
Modulação do metabolismo de poluentes atmosféricos por bebidas de brotos de brócolis ricas em glucorafanina e sulforafano em Qidong, China
O sulforafano oral aumenta as enzimas antioxidantes de Fase II nas vias aéreas superiores humanas
O sulforafano melhora a proteção e reparo da mucosa gástrica contra o estresse oxidativo in vitro e demonstra efeitos anti-inflamatórios em mucosas gástricas infectadas por Helicobacter pylori em camundongos e humanos
Estruturas de A) Sulforafano e seus principais metabólitos B) Sulforafano-NAC e C) Sulforafano-GSH.
Perfil concentração-tempo do sulforafano (A) após administração i.v. de 25 mg/kg de solução salina de sulforafano em ratos. Principais metabólitos sulforafano-GSH (B) e sulforafano-NAC (C) formados após a administração de sulforafano. Os parâmetros farmacocinéticos dos metabólitos podem ser encontrados nas Informações de Suporte.
Modelagem farmacocinética/farmacodinâmica da estimulação indireta de kin por Jusko. O modelo foi descrito pela primeira vez como Modelo de Resposta Indireta III por Dayneka et al. 1993. C representa o compartimento central; P, compartimento periférico; R, resposta da mudança no nível de expressão de mRNA em relação ao inicial (t=0).
Perfis farmacocinéticos/farmacodinâmicos da mudança na expressão de mRNA ao longo do tempo em vezes para NQO1, GPx-1, GSTT1, Nrf2, HO-1 e Maf. As linhas representam valores previstos pelo modelo. Os dados observados são apresentados como média ± EP.
Histograms of 1,000 bootstrap estimates of 4 parameters of four representative genes. The bars represent frequency. The average bootstrap estimator values of parameters are indicated by a dashed line and its lower and upper confidence limits β1(0.05),βu(0.05) are represented by dotted lines respectively.

Pharmacokinetic parameters of SFN in rat plasma using GastroPlus™. Noncompartmental analysis parameters: AUC, area under the curve; MRT, mean residence time; Vss, volume of distribution at steady state; t1/2, terminal half life; Two-compartment model based parameters: kcp, kpc, central and peripheral intercompartmental rate constants; Vc, volume of distribution of central compartment; and CL, clearance.

Parameter Unit Value %CV Non-compartmental Parameters AUC 0-24 ngh/mL 9272 AUC 0-inf ngh/mL 9787 MRT h 4.2 Vss L 3.7 t1/2 h 7.6 2-Compartment Model Based Parameters kcp 1/h 0.425 54.65% kpc 1/h 0.156 63.33% Vc L 1.235 30.21% CL L/h 0.848 14.67%

Pharmacodynamic analysis of Phase II mRNA expression driven by SFN using Type III Indirect Model for NQO1, GSTT1, Maf, GPx, Nrf2, and HO-1. Data are presented as mean ± S.D. (N = 10~12)

mRNA Smax SC50 (μg/mL) kin(1/hr) kout(1/hr) Max. effecttime (h) NQO1 3.87 ± 0.67 0.26 ± 0.05 1.96 ± 0.20 2.10 ± 0.23 1.60 GSTT1 7.78 ± 1.76 1.50 ± 0.86 1.82 ± 0.35 2.41 ± 0.64 1.04 Maf 25.0 ± 3.85 1.37 ± 0.12 1.76 ± 0.25 2.32 ± 0.09 1.04 GPx 39.7 ± 1.58 4.82 ± 0.34 4.49 ± 0.21 3.14 ± 0.07 0.72 Nrf2 2.92 ± 2.10 1.54 ± 3.18 1.37 ± 1.04 1.78 ± 1.68 1.20 HO-1 1.55 ± 6.56 8.00 ± 49.2 4.79 ± 8.14 4.26 ± 7.59 0.56

Values of the parameters calculated by bootstrap sampling in conjunction with least square method

mRNA Parameter Mean Minimum Maximum 5% Percentile 95% Percentile NQO1 Smax 3.54 0.00 18.57 1.19 4.99 SC50 (μg/mL) 0.74 0.00 9.07 0.06 2.59 kin (1/hr) 2.33 0.09 29.80 1.12 3.93 kout (1/hr) 2.08 0.12 22.19 1.08 3.02 GPx Smax 39.09 0.00 98.12 19.43 62.58 SC50 (μg/mL) 9.57 0.00 100.00 1.36 40.96 kin (1/hr) 8.01 0.30 100.00 1.94 23.80 kout (1/hr) 3.74 0.04 99.45 1.11 7.27 Nrf2 Smax 2.81 0.74 9.25 1.38 4.21 SC50 (μg/mL) 1.63 0.19 5.78 1.05 2.42 kin (1/hr) 1.22 0.54 3.19 0.80 1.87 kout (1/hr) 1.65 0.65 3.82 1.14 2.23 HO-1 Smax 1.97 0.84 4.53 1.32 2.67 SC50 (μg/mL) 8.00 2.09 30.19 7.25 8.59 kin (1/hr) 5.07 2.25 96.18 3.10 5.51 kout (1/hr) 4.94 2.28 100.00 3.03 5.45