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pmid: "24559113"
title: "Piper betle induz genes das fases I e II através da via de sinalização Nrf2/ARE em fibroblastos embrionários de camundongos derivados de células do tipo selvagem e knockout para Nrf2."
authors: "Wan Hasan WN, Kwak MK, Makpol S, Wan Ngah WZ, Mohd Yusof YA"
journal: "BMC complementary and alternative medicine"
pubdate: "2014 Feb 23"
doi: "10.1186/1472-6882-14-72"
source: "PMC Full Text"

Piper betle induz genes das fases I e II através da via de sinalização Nrf2/ARE em fibroblastos embrionários de camundongos derivados de células do tipo selvagem e knockout para Nrf2.

Autores

Wan Hasan WN, Kwak MK, Makpol S, Wan Ngah WZ, Mohd Yusof YA

Periodico

BMC complementary and alternative medicine (2014 Feb 23)

Conteudo

Piper betle induz genes de fase I e II através da via de sinalização Nrf2/ARE em fibroblastos embrionários de camundongos derivados de células de tipo selvagem e knockout para Nrf2
Introdução
O fator nuclear eritroide 2 p45 relacionado ao fator 2 (Nrf2) é um fator de transcrição primário, protegendo as células do estresse oxidativo ao regular uma série de antioxidantes e enzimas de detoxificação de fase II. Componentes dietéticos como sulforafano no brócolis e quercetina na cebola demonstraram ser indutores do Nrf2. Piper betle (PB) cresce bem em clima tropical e as folhas são usadas em várias práticas tradicionais para o tratamento de doenças estomacais e infecções entre asiáticos. O objetivo deste estudo foi elucidar o efeito do extrato de folhas de Piper betle (PB) na via de sinalização Nrf2 utilizando dois tipos de células; fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) derivados de camundongos de tipo selvagem (WT) e knockout para Nrf2 (N0).
Métodos
Células WT e N0 foram tratadas com 5 e 10 μg/ml de PB por 10 e 12 h para determinação da translocação nuclear da proteína Nrf2. A atividade do gene repórter da luciferase foi realizada para avaliar a indução do elemento de resposta antioxidante (ARE) pelo PB. PCR em tempo real e Western blot foram realizados em células WT e N0 após o tratamento com PB para determinação das enzimas antioxidantes [superóxido dismutase (SOD1) e heme-oxigenase (HO-1)], enzimas oxidoredutases de fase I [NAD(P)H: quinona oxidoredutase (NQO1)] e enzima de detoxificação de fase II [glutationa S-transferase (GST)].
Resultados
A translocação nuclear do Nrf2 pelo PB em células WT foi melhor após 10 h de incubação em comparação com 12 h. A análise de PCR em tempo real e Western blot mostrou aumento das expressões dos genes Nrf2, NQO1 e GSTA1, com aumentos correspondentes nas proteínas glutationa, NQO1 e HO-1 em células WT. O gene repórter ARE foi estimulado pelo PB, conforme demonstrado pelo ensaio ARE/luciferase. Curiosamente, o PB induziu as expressões do gene e da proteína SOD1 em células N0, mas não em células WT.
Conclusão
Os resultados deste estudo confirmaram que o PB ativou a via de sinalização Nrf2-ARE, que subsequentemente induziu a expressão de alguns genes de oxidoredutase de fase I, detoxificação de fase II e antioxidantes através do gene repórter ARE envolvido na via Nrf2, com exceção do SOD1, que pode não ser dependente dessa via.
Piper betle L. (PB) da família Piperaceae cresce bem no Sudeste Asiático. As folhas de PB são usadas como mastigatório em muitos países asiáticos, incluindo a Malásia. O eugenol e o hidroxicavicol são dois compostos bioativos em PB que foram relatados como tendo propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. O maior fitocomposto presente no extrato aquoso das folhas de PB é o hidroxicavicol, que contribuiu para sua atividade antioxidante. O PB melhorou o status antioxidante aumentando as atividades de enzimas desintoxicantes de radicais livres, como superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase durante o envelhecimento em eritrócitos de camundongos C57BL/6 e aumentou os níveis de antioxidantes não enzimáticos, como a glutationa reduzida no fígado e rim de ratos tratados com etanol. O extrato aquoso das folhas de PB melhorou o potencial antioxidante aumentando a atividade da SOD e catalase e também reduzindo a peroxidação lipídica no fígado e rim de ratos Wistar diabéticos induzidos. Uma descoberta recente mostrou que o PB inibiu a proliferação de linhagens de células de câncer de mama, MCF-7, e aumentou as atividades antioxidantes como SOD1 e CAT.

O estresse oxidativo resulta de um desequilíbrio entre a produção excessiva de ROS e a defesa antioxidante celular limitada. O fator de transcrição básico de zíper de leucina fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 45 (Nrf2) desempenha um papel vital na proteção das células contra o estresse oxidativo. O Nrf2 normalmente é sequestrado no citoplasma como um complexo inativo pela interação com seu repressor Keap1. Existem dois modelos predominantes que propõem como o Nrf2 é liberado do Keap1 em resposta ao estresse oxidativo; (1) o modelo "dobradiça e trinco", no qual modificações nos resíduos de tiol do Keap1 interrompem a interação com o Nrf2 causando desalinhamento dos resíduos de lisina dentro do Nrf2 que não podem mais ser poliubiquitinilados, e (2) o modelo no qual a modificação do tiol causa dissociação do Cul3 do Keap1. Em ambos os modelos, o Keap1 modificado pelo indutor e ligado ao Nrf2 é inativado e, consequentemente, as proteínas Nrf2 recém-sintetizadas contornam o Keap1 e translocam para o núcleo, ligam-se ao Elemento de Resposta Antioxidante (ARE) e levam à indução transcricional de genes alvo do Nrf2, como heme oxigenase-1 (HO-1), superóxido dismutase (SOD1), catalase (CAT), NAD(P)H quinona oxidoredutase (NQO1), glutationa S-transferase (GST), e incluindo enzimas de biossíntese de glutationa: subunidade modificadora da glutationa cisteína ligase (GCLM) e subunidade catalítica da glutationa cisteína ligase (GCLC).
Alguns compostos fitoquímicos que foram relatados por ativar a via Nrf2/ARE incluem sulforafano do brócolis, quercetina da cebola e epigalocatequina-3-galato do chá verde. Até onde sabemos, não há informações disponíveis sobre a associação de PB com a via de sinalização Nrf2/ARE. O objetivo deste experimento foi avaliar se PB pode modular a via Nrf2/ARE com subsequente aumento de enzimas antioxidantes endógenas e de fase 2, utilizando fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) de camundongos tipo selvagem e nocante para Nrf2.

Métodos
Materiais
Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) foram um gentil presente de Kwak Mi-kyoung (Universidade Católica da Coreia, Bucheon, Coreia do Sul) e Nobunao Wakabayashi (Universidade de Pittsburgh, EUA), que prepararam a linhagem celular de camundongos ICR tipo selvagem (Nrf2+/+) e com disrupção de nrf2 (Nrf2-/-). O plasmídeo repórter contendo NQO1 ARE-luciferase também foi um gentil presente de Kwak Mi-kyoung.

Cultura de células
As células MEFs foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Iscove (Invitrogen, EUA) suplementado com 10% de SBF (PAA, EUA), 10 unidades/ml de penicilina-estreptomicina e 2,5 μg de anfotericina-B (PAA, EUA).

Ensaio MTS
As células foram plaqueadas a uma densidade de 5 × 10³ células/poço em placas de 96 poços. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com várias concentrações de extrato aquoso de PB. Em seguida, 20 μl de solução MTS (Promega, EUA) foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas por mais 4 h. A absorbância foi medida a 490 nm usando um leitor de microplacas Versamax (Sunnyvale, CA, EUA).

Extração aquosa de folhas de Piper betle
Folhas secas de PB foram adquiridas da Ethno Resources Company (Sungai Buloh, Selangor, Malásia) e a confirmação da identificação da planta foi obtida do Herbário, Universidade Kebangsaan Malaysia, Bangi, com número de voucher UKMB 29768. A extração aquosa de PB foi preparada de acordo com Pin et al. com algumas modificações. Resumidamente, as folhas foram moídas até formar pó e uma concentração de 10% de PB foi preparada, e o processo de extração foi realizado utilizando um Extrator Soxhlet (Eyela, Japão). O extrato aquoso de PB foi liofilizado (Labconco, EUA) até formar pó e armazenado a 4°C até uso posterior.

Transfecção do plasmídeo repórter e medição da atividade da luciferase
As células foram transfectadas com plasmídeos a 50% de confluência usando o reagente de transfecção Welfect-Ex Plus (WelGene, Daegu, Coreia do Sul). Brevemente, as células foram incubadas com o complexo de transfecção contendo 0,5 µg de plasmídeo ARE-luciferase, 0,05 µg de plasmídeo controle pRLtk e o reagente de transfecção (2 µg de Welfect-Ex e 1,5 µg de Enhancer-Q) em OptiMEM sem soro e antibiótico (Invitrogen, EUA). A transfecção continuou por 18 h; as células foram então recuperadas em meio completo pelas próximas 8 h. As células foram tratadas com 5 e 10 µg/ml de PB por 24 h e então lisadas com tampão de lise [tampão RIPA (Sigma, EUA) e comprimido de coquetel inibidor de protease (Roche, Suíça)]. As atividades de luciferase de firefly e Renilla nos lisados celulares totais foram determinadas usando um kit Dual-Luciferase Assay (Promega, Wisconsin, EUA) com um luminômetro 20/20n (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, EUA). Células do tipo selvagem foram tratadas com 5 µM de sulforafano (SFN) por 6 h como controle positivo.
Preparação de extratos nucleares
Para detecção de Nrf2 no núcleo, as células foram cultivadas com uma densidade de 6×105 e tratadas com 5 e 10 µg/ml de PB por 10 e 12 h. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS gelado. Frações nucleares brutas foram obtidas lisando as células em tampão de homogeneização [2 M de sacarose, 1 M de Hepes, 2 M de MgCl2, 2 M de KCl, 30% de glicerol, 0,5 M de EDTA, 1 M de ditiotreitol, coquetel inibidor de protease (Sigma, EUA) e 0,2% de NP-40 (Sigma, EUA)], raspadas, vortexadas por 30 min a 4°C e seguidas de centrifugação a 12.000 × g por 15 min. A concentração de proteína foi determinada usando o corante de ensaio de proteínas Bio-Rad (Hercules, CA).
Extração de RNA e PCR quantitativo em tempo real
As células foram semeadas em placas de 6 poços a 2x105/poço e cultivadas por 24 h. Após 24 h de tratamento com 5 e 10 µg/ml de extrato de PB, as células foram lavadas com PBS e o RNA foi isolado usando reagente TRI (Molecular Research Centre, Inc., EUA). A amplificação por PCR foi realizada com um termociclador (BioRad, EUA). O nível de mRNA foi quantificado pelo Bio-Rad iCycler e a condição para amplificação por PCR foi de 40 ciclos de 10 seg a 95°C para desnaturação e 30 seg a 56°C para anelamento. As sequências de iniciadores para os genes estão listadas na Tabela 1 e foram sintetizadas pela FirstBase (Cingapura).
Sequências de oligonucleotídeos para PCR em tempo real de enzimas de fase 2 e antioxidantes murinas
Gene   Sequências (5’-3’) Nº de acesso β-actina Direto GAAGAGCTATGAGCTGCCTGA NM_007393.3 Reverso GCACTGTGTTGGCATAGAGGT   Nrf2 Direto GAACTGTAGGAAAAGGAAGC U20532 Reverso GAGTATTCACTGGGAGAGTA   NQO1 Direto TTCTCTGGCCGATTCAGAGT X13356 Reverso GGCTGCTTGGAGCAAAATAG   SOD1 Direto CGGATGAAGAGAGGCATGTT Z18857 Reverso CACCTTTGCCCAAGTCATCT   GSTA1 Direto CCGTTACTTGCCTGCCTTTG NM_145740 Reverso CTTCTTCACATTGGGGAGGCT  
Análise de Western blot
As células foram incubadas com 5 e 10 μg/ml de PB por 24 h para detecção da expressão proteica de NQO1, HO-1 e SOD1. Resumidamente, 2×104 células foram cultivadas em placa de Petri de 60 mm e, após 24 h de tratamento, as células foram lisadas usando tampão de lise [tampão RIPA (Sigma, EUA) e comprimido de inibidor de protease (Roche, Suíça)] para extrair a proteína do citosol. Finalmente, os lisados celulares foram centrifugados a 16.100 × g por 30 min e o sobrenadante foi armazenado a -80°C. Ambos os lisados celulares do extrato citosólico e nuclear foram carregados em géis de SDS-poliacrilamida a 12 ou 15% e separados por eletroforese a 70 V usando o sistema Mini-PROTEAN 3 cell (BioRad, EUA). As proteínas nos géis foram transferidas para membranas de PVDF (Amersham Biosciences, Reino Unido) e as membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em tampão TPBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 e 2 ml/L de Tween 20) por 1 h. Os anticorpos contra β-actina, lamin B, SOD1 e NQO1 foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA), enquanto os anticorpos contra HO-1 e HO-1 foram adquiridos da Abcam (Cambridge, Reino Unido). A incubação com anticorpo primário foi realizada durante a noite, seguida de incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (SantaCruz, EUA) por 1 h. A detecção das proteínas foi realizada usando o reagente de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Reino Unido).

Análise estatística
A análise estatística foi conduzida usando o software SPSS para Windows, versão 16.0. As diferenças entre os valores médios de múltiplos grupos foram analisadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) com teste post-hoc de Tukey HSD. O nível de confiança de 95% (P < 0,05) foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados
Viabilidade das células WT e N0 ao tratamento com PB
O ensaio MTS foi realizado para medir a viabilidade celular após 24 h de tratamento com doses crescentes de PB. As células N0 exibiram sensibilidade aumentada em quase 2 vezes (IC50) ao PB em comparação com as células WT (Figura 1). Esse resultado indicou que as células N0 são mais suscetíveis à citotoxicidade do tratamento com PB em comparação com as células WT.

As células N0 apresentam toxicidade aumentada ao extrato aquoso de PB. Células WT e N0 foram tratadas com doses crescentes de PB por 24 h e a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTS. A viabilidade celular média é expressa como porcentagem do controle. Os dados representam ± E.P.M. de três experimentos independentes. aP < 0,05, comparado ao controle; bP < 0,05, comparado às células WT na mesma concentração.

Translocação de Nrf2 para o núcleo pelo PB
Para verificar a dissociação de Nrf2 de Keap1, medimos a translocação da proteína Nrf2 para o núcleo em células WT e N0 após 10 e 12 h de tratamento com PB. Após 10 h de tratamento com 10 μg/ml de PB, o nível nuclear de Nrf2 em células WT foi significativamente diferente (p < 0,05) em comparação com células N0, enquanto o tratamento por 12 h não resultou em alterações significativas das proteínas Nrf2 entre os dois tipos de células (Figura 2). Quando comparado ao controle positivo de 5 μM de sulforafano em WT por 6 h, o tratamento com PB por 10 h ativou Nrf2 e o translocou para o núcleo em um nível mais baixo em comparação com SFN. Isso sugeriu que o PB ativou a proteína Nrf2, que subsequentemente se translocou do citosol para o núcleo melhor após 10 h de tratamento quando comparado ao tratamento de 12 h.
Análise de Western blot da translocação nuclear de Nrf2 por PB em fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) de tipo selvagem (WT) e células knockout para Nrf2 (N0) para tratamento de 10 e 12 h. Os blots mostrados são exemplos de três experimentos separados (A) da proteína Nrf2 no núcleo após 10 e 12 h. O tratamento com SFN por 6 h serve como controle positivo para ativação de Nrf2 e translocação para o núcleo. Células MEF foram tratadas com PB (5 e 10 μg/ml) por (B) 10 h (C) 12 h, após o que as células foram coletadas e a proteína Nrf2 foi extraída do núcleo. Lamin B foi usado como controle interno. Os dados representam ± E.P.M. de três experimentos independentes. aP < 0,05, comparado às células WT controle; bP < 0,05, comparado ao respectivo grupo de células WT.
Atividade do gene repórter ARE-luciferase
O efeito indutor do PB sobre os genes antioxidantes e de fase 2 mediado via ARE foi verificado conforme mostrado na Figura 3. Células WT e N0 foram transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase contendo o NQO1-ARE. O tratamento de células WT transfectadas com NQO1-ARE a 10 μg/ml de PB por 24-h mostrou um aumento de 1,6 vezes na atividade da luciferase em comparação ao controle (Figura 3).
Atividades de luciferase dirigidas por ARE após tratamento com PB em células MEF WT e N0. As células foram transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase contendo o ARE de NQO1 e foram tratadas com PB (5 e 10 μg/ml) ou SFN (5 μM) por 24 h. A medição das atividades de luciferase foi realizada usando o sistema Dual-Luciferase e os níveis de luciferase de Firefly foram normalizados para os níveis de luciferase de Renilla. Os dados representam ± E.P.M. de quatro experimentos independentes. aP < 0,05, comparado às células WT controle; bP < 0,05, comparado ao respectivo grupo de células WT.
Efeitos do PB nas expressões gênicas de antioxidantes, enzimas de detoxificação de fase I e fase II
Para explorar o efeito do PB nos genes Nrf2, células WT e N0 foram tratadas com PB e os níveis de transcrição dos genes Nrf2, NQO1, SOD e GSTA1 foram analisados por PCR em tempo real. Na linha de base, os genes Nrf2, NQO1 e GSTA1 foram altamente expressos em células WT em comparação com células N0 (Figura 4). O tratamento com PB a 10 μg/ml por 24 h para ambos os tipos de células aumentou significativamente a expressão dos genes Nrf2, NQO1 e GSTA1 em WT, mas não em células N0. A expressão do gene SOD1 foi significativamente maior em células N0 em comparação com células WT na linha de base. No entanto, quando as células foram tratadas com PB, não houve diferença significativa na expressão de SOD1 entre células WT e N0.
Níveis de transcrição dos genes Nrf2, NQO1 e SOD1 após tratamento com 5 e 10 μg/ml de PB por 24 h. Os RNAs foram isolados e transcritos reversamente para cDNA, depois amplificados por sistema de detecção por PCR em tempo real para medir os níveis de mRNA para beta actina, Nrf2 (A), NQO1 (B) e SOD1 (C), HO-1 (D) e GSTA1 (E). Os genes alvo foram normalizados para beta actina. Os dados representam ± E.P.M. de três experimentos independentes. aP < 0,05, comparado às células WT controle; bP < 0,05, comparado ao respectivo grupo de células WT.
Efeitos do PB nas expressões proteicas de NQO1 e HO-1
Para verificar a indução do PB nas proteínas reguladas por Nrf2, medimos a expressão das proteínas NQO1 e HO-1 pela técnica de Western blot. No nível basal, as proteínas NQO1 e HO-1 foram significativamente expressas em células WT em comparação com células N0 (Figura 5A). Quando as células foram tratadas com 10 μg/ml de PB por 24 h, as proteínas NQO1 e HO-1 aumentaram significativamente em células WT, mas não em células N0. A proteína SOD1, no entanto, foi significativamente expressa em células N0 (Figura 5D), de acordo com a expressão dos genes SOD1 (Figura 4C) com o tratamento com PB. No entanto, não houve diferença significativa na expressão de SOD1 entre células WT e N0.
Western blot das proteínas NQO1, HO-1 e SOD1 em células WT e N0 tratadas com PB (5 e 10 μg/ml). Os blots mostrados são exemplos de três experimentos separados (A) a partir de 20 μg de proteínas citosólicas e intensidades relativas sobre β-actina para a expressão proteica de NQO1 (B), HO-1 (C) e SOD1 (D) após 24 h de tratamento com PB. O tratamento com SFN a 5 μM foi usado como controle positivo. Os dados representam ± E.P.M. de três experimentos independentes. aP < 0,05, comparado às células WT controle; bP < 0,05, comparado ao respectivo grupo de células WT.
Discussão
O mecanismo subjacente pelo qual a planta local Piper betle (PB) estimula a via Nrf2 ainda não foi elucidado. Nossos resultados sobre a atividade da luciferase NQO1-ARE, mRNA, oxidoredutase de fase I e enzimas detoxificantes de fase II mostraram que o PB induziu a via Nrf2/ARE.
Este estudo demonstrou que a deficiência de Nrf2 em células MEF (N0) resultou em aumento da citotoxicidade com o tratamento com PB em comparação com células WT. O hidroxichavicol, encontrado no PB, mostrou exercer atividade antioxidante em baixa concentração, mas exibir efeito pró-oxidante em concentrações superiores a 0,1 mM. Da mesma forma, células MEF Nrf2-/- mostraram ser mais sensíveis ao tratamento com SFN, peróxidos, fármacos anticancerígenos (cisplatina) e compostos que geram radicais livres em comparação com células MEF Nrf2+/+.

O sistema de sinalização Nrf2-Keap1-ARE é central para a indução de genes da fase 2 por eletrófilos e antioxidantes. Mostramos que o PB foi capaz de ativar a Nrf2 e translocá-la para o núcleo, com aumento da expressão dos genes e proteínas NQO1 e HO-1. Postulamos que o mecanismo de interação entre o PB e o complexo Nrf2-Keap1 pode mimetizar a ação de outros indutores de Nrf2, como sulforafano e extrato de Ginkgo biloba. A proteína Keap1 contém múltiplos resíduos de cisteína, e especificamente C257, C273, C297 e C288 mostraram ser os resíduos mais reativos que podem interagir com indutores da fase 2, incluindo o sulforafano. Após exposição aos indutores, os resíduos reativos de cisteína formam pontes dissulfeto intermoleculares e alteram sua conformação, o que leva à dissociação da Nrf2 da Keap1, translocando a Nrf2 para o núcleo e ativando a expressão de genes da fase 2. O extrato de Ginkgo biloba estimulou a Nrf2 e a translocou para o núcleo, com subsequente aumento de genes da fase 2, como GCLC, GST e NQO1, por meio da via de sinalização Keap1-Nrf2-ARE em células Hepa1c1c7 e HepG2. O composto ativo do café, o ácido 5-O-cafeoilquínico (CGA), modula a translocação nuclear da Nrf2 e a expressão gênica dependente de ARE, como HO-1, Nrf2, GST, γGCL em células HT29.

Neste estudo, mostramos que a translocação da Nrf2 é melhor após 10 h de incubação com PB e, para a indução de ARE, expressão de genes e proteínas, incubamos as células com PB por 24 h, o que é semelhante a outros estudos. O sulforafano causou translocação nuclear da Nrf2 após 6 h de tratamento por Western blotting; no entanto, dados de imunocitoquímica revelaram que a translocação da Nrf2 para o núcleo não foi observada em muitas células no tratamento de 6 h em comparação com a incubação de 24 h, que exibiu grande quantidade de Nrf2 no núcleo de queratinócitos humanos.
Os elementos de resposta antioxidante (ARE) são uma sequência intensificadora atuante em cis localizada na região promotora 5' flanqueadora de genes antioxidantes e desintoxicantes, como GST, HO-1, GCLC e NQO1. O ensaio repórter da luciferase confirmou ainda que o PB induziu a região promotora de ARE no núcleo. Nossos resultados são apoiados por Shin et al., que relataram que o sulforafano, um conhecido ativador de Nrf2, aumentou a atividade da luciferase em 3,5 vezes em células epiteliais renais de rato NRK. Outros agentes dietéticos que ativam o gene repórter ARE com expressão aumentada de genes-alvo do Nrf2, como NQO1, HO-1 e GCLC, incluem resveratrol e xantohumol. Outro antioxidante, a curcumina, ativou a expressão do gene glutationa S-transferase P1 (GSTP1) ao ativar a expressão do gene da luciferase a partir de um construto repórter contendo GSTP1-ARE.
As expressões aumentadas dos genes Nrf2, NQO1 e GSTA1 em células WT, mas não em células N0, validaram ainda mais nossa afirmação de que o PB é um indutor de Nrf2/ARE. McWalter et al. relataram que o fator de transcrição Nrf2 foi ativado por sementes de brócolis e isotiocianatos, com indução dos genes e proteínas NQO1, GST e GCLC em camundongos Nrf2+/+, mas não em camundongos Nrf2-/-. Nossos resultados são apoiados pela descoberta de Yoon et al., que constataram que o sulforafano aumentou as proteínas NQO1 e HO-1 em células proximais humanas. Cho et al. mostraram que o gene Nrf2 foi regulado positivamente pelo menos 2 vezes mais em camundongos Nrf2+/+ do que em camundongos Nrf2-/- no nível basal e também em camundongos induzidos por hiperóxia. A possibilidade de polifenóis no PB, como chavicol ou eugenol, induzirem Nrf2 também foi relatada por um estudo de Tsai et al., que mostraram que compostos fenólicos do alecrim e do ácido carnósico induziram a transcrição de Nrf2, a atividade repórter da luciferase ARE e aumentaram a expressão do gene e da proteína NQO1 em células clone 9 de rato. O metabólito do licopeno, apo-8'-licopenal, que pode ser encontrado no fígado de rato e no plasma humano após o consumo de alimentos contendo licopeno, induziu a translocação nuclear, a atividade de ligação Nrf2-ARE e a expressão dos genes e proteínas HO-1 e NQO1 em linhagens celulares de hepatoma humano, HepG2. O isotiocianato sulforafano e o flavonoide apigenina aumentaram a expressão gênica de enzimas desintoxicantes de fase II, como glutationa S-transferase (GSTA1) e UDP-glucuronosiltransferase (UGT1A1) em adenocarcinoma de cólon humano. O L-sulforafano modula genes regulados por Nrf2, incluindo a biossíntese de GSH (GCLC), glutationa S-transferases (GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTM1) e NQO1 no intestino delgado de camundongos Nrf2+/+ e Nrf2-/-.
Nossos resultados mostraram diminuição da expressão de mRNA de HO-1 após 24 h de tratamento com PB, enquanto seu nível proteico foi encontrado aumentado. Essa descoberta é semelhante a um estudo de curso temporal de Motterlini et al., que mostraram que a expressão de mRNA de HO-1 em células endoteliais da aorta bovina atingiu o máximo após 6 h de tratamento com 5 μM de curcumina e diminuiu após 24 h de tratamento.
Ao contrário de muitos achados, observamos que o gene e a proteína SOD1 não foram expressos em WT, mas foram significativamente expressos em células N0. Outros que encontraram resultados semelhantes relataram que o nível basal de algumas enzimas antioxidantes pode não estar sob influência do gene Nrf2. Kwak et al. descobriram que o gene MnSOD foi 1,31 vezes maior em camundongos com disrupção de Nrf2 em comparação com camundongos selvagens em níveis constitutivos, sugerindo que Nrf2 é um fator essencial para modular muitas, mas não todas, enzimas antioxidantes e de fase 2. A disrupção do gene Nrf2 em Nrf2-/- pode alterar a expressão basal e induzível de alguns genes, incluindo SOD1.

Conclusão
Em resumo, nossos achados indicam que PB ativou a via Nrf2/ARE ao dissociar Nrf2 de Keap1, translocar a proteína Nrf2 para o núcleo, induzir o elemento de resposta antioxidante (ARE), aumentando assim os genes regulados por Nrf2 (Nrf2, NQO1 e GSTA1) e proteínas como NQO1 e HO-1.

Interesses concorrentes
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.

Contribuições dos autores
WNWH realizou experimentos e analisou dados. WZWN e YAMY delinearam o estudo. KMY forneceu as células e supervisão geral. SM auxiliou na interpretação dos dados de expressão gênica. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Histórico de pré-publicação
O histórico de pré-publicação deste artigo pode ser acessado aqui:
http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/72/prepub

Agradecimentos
Nossa sincera gratidão a Nobunao Wakabayashi e Kwak Mi-Kyoung por nos fornecerem células MEFs (WT e N0) e o plasmídeo Nqo1 ARE. Este projeto de pesquisa foi financiado pela bolsa de pesquisa da Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-GUP-07-21-201) e pelo Programa de Mobilidade (Outbound).

Avaliação das atividades antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória do hidroxicavicol para seu potencial uso como agente de cuidados bucais
Atividades antioxidante e anti-inflamatória de extratos de folhas de betel (Piper betle) de solventes com diferentes polaridades
A atividade da enzima antioxidante e os níveis de malondialdeído podem ser modulados por Piper betle, fração rica em tocotrienol e Chlorella vulgaris em camundongos C57BL/6 envelhecidos
Influência de Piper betle nas enzimas marcadoras hepáticas e no status antioxidante tecidual em ratos Wistar tratados com etanol
Atividade antioxidante do extrato foliar de Piper betle L. in vitro
Piper betle apresenta atividades antioxidantes, inibe a proliferação de células MCF-7 e aumenta as atividades da catalase e superóxido dismutase
Estresse oxidativo: Oxidantes e Antioxidantes
Papel do sistema antioxidante Nrf2 na citotoxicidade mediada pelo cisplatina anticancerígena: Implicação na resistência das células cancerígenas
Perfil de expressão gênica da proteção mediada por NRF2 contra lesão oxidativa
Evidência direta de que os grupos sulfidrila de Keap1 são os sensores que regulam a indução de enzimas de fase 2 que protegem contra carcinógenos e oxidantes
Mecanismos moleculares da via Keap1–Nrf2 na resposta ao estresse e evolução do câncer
Regulação transcricional do gene da subunidade Ya da glutationa S-transferase de rato: Caracterização do elemento responsivo a xenobióticos que controla a expressão induzível por antioxidantes fenólicos

Identificação de um novo elemento de resposta antioxidante (ARE) regulado por Nrf2 no gene 1 da NAD(P)H:quinona oxidoredutase de camundongo: reavaliação da sequência consenso do ARE

Diferentes potenciais eletrostáticos definem os motivos ETGE e DLG como dobradiça e trinco na resposta ao estresse oxidativo

Keap1 reprime a ativação nuclear de elementos responsivos a antioxidantes por Nrf2 através da ligação ao domínio Neh2 amino-terminal

Identificação de genes regulados por Nrf2 induzidos pelo agente quimiopreventivo sulforafano por microarray de oligonucleotídeos

Modulação da expressão gênica por ditioletionas quimiopreventivas do câncer através da via Keap1-Nrf2: Identificação de novos agrupamentos gênicos para sobrevivência celular

Identificação de genes regulados por Nrf2 induzidos pelo isotiocianato quimiopreventivo PEITC por microarray de oligonucleotídeos

Regulação da expressão gênica mediada por Nrf2 e AP1 por epigalocatequina-3-galato e sulforafano na próstata de camundongos Nrf2-knockout ou C57BL/6J e células PC-3 AP-1 de câncer de próstata humano

O sistema NRF2–heme oxigenase-1 modula a transição epitélio-mesenquimal e a fibrose renal induzidas por ciclosporina A

Após internalização celular, a quercetina causa translocação nuclear de Nrf2, aumenta os níveis de glutationa e previne a morte neuronal contra um insulto oxidativo

Antioxidantes aumentam a expressão do proteassoma de mamíferos através da via de sinalização Keap1-Nrf2

Expressão aumentada do fator de transcrição Nrf2 por agentes quimiopreventivos do câncer: Papel de sequências semelhantes ao elemento de resposta antioxidante no promotor de Nrf2

Indução da parada do ciclo celular e apoptose de células de carcinoma oral KB por hidroxichavicol: papéis da glutationa e espécies reativas de oxigênio

O fator de transcrição Nrf2 medeia uma resposta adaptativa ao sulforafano que protege fibroblastos in vitro contra os efeitos citotóxicos de eletrófilos, peróxidos e agentes de ciclagem redox

Proteção contra estresse eletrofílico e oxidante pela indução da resposta de fase 2: Destino das cisteínas do sensor Keap1 modificadas por indutores

Extrato de Ginkgo biloba induz genes de fase 2 através da via de sinalização Keap1-Nrf2-ARE

Constituintes do café como moduladores da translocação nuclear de Nrf2 e da expressão gênica dependente de ARE (EpRE)

Sulforafano, mas não ascorbigeno, indol-3-carbinol e ácido ascórbico, ativa o fator de transcrição Nrf2 e induz enzimas de fase 2 e antioxidantes em queratinócitos humanos em cultura

Regulação da expressão do gene da subunidade Ya da glutationa S-transferase: identificação de um elemento responsivo a xenobióticos único que controla a expressão induzível por compostos aromáticos planares

Elementos responsivos a antioxidantes funcionais

Indução paralela da heme oxigenase-1 e enzimas quimioprotetoras de fase 2 por eletrófilos e antioxidantes: regulação por elementos responsivos a antioxidantes (ARE) a montante
Regulação transcricional do gene da NAD(P)H:quinona redutase de rato: identificação de elementos reguladores que controlam a expressão em nível basal e a expressão induzível por compostos aromáticos planares e antioxidantes fenólicos
Sobreposição do elemento de resposta antioxidante e sequências do elemento de resposta ao PMA medeiam a expressão basal e induzida por β-naftoflavona do gene da subunidade catalítica da γ-glutamilcisteína sintetase humana
Ativação do gene da glutationa S-transferase classe Pi de camundongo por Nrf2 (fator 2 relacionado ao NF-E2) e androgênio
O resveratrol confere proteção endotelial através da ativação do fator de transcrição antioxidante Nrf2
A atividade anti-inflamatória do xantumol envolve a indução da heme oxigenase-1 via sinalização NRF2-ARE em células microgliais BV2
A curcumina ativa a expressão da glutationa S-transferase P1 humana através do elemento de resposta antioxidante
O fator de transcrição Nrf2 é essencial para a indução da NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1, glutationa S-transferases e glutamato cisteína ligase por sementes de brócolis e isotiocianatos
O sulforafano protege os rins contra lesão de isquemia-reperfusão através da indução da enzima de fase 2 dependente de Nrf2
O ácido carnósico induz a expressão da NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1 em células clone 9 de rato através da via p38/fator nuclear eritroide-2 relacionado 2
Apo-8'-licopenal induz a expressão de HO-1 e NQO-1 via via ERK/p38-Nrf2-ARE em células HepG2 humanas
Interações entre sulforafano e apigenina na indução de UGT1A1 e GSTA1 em células CaCo-2
Curcumina, um agente antioxidante e anti-inflamatório, induz heme oxigenase-1 e protege células endoteliais contra estresse oxidativo
O aumento da ativação de Nrf2 em fígados de camundongos com knockdown de Keap1 aumenta a expressão de genes citoprotetores que desintoxicam eletrófilos mais do que aqueles que desintoxicam espécies reativas de oxigênio
Papel da sinalização de Nrf2 na regulação de antioxidantes e enzimas de fase 2 em fibroblastos cardíacos: Proteção contra lesão celular induzida por espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio
Papel do fator de transcrição Nrf2 na indução de enzimas hepáticas de fase 2 e antioxidantes in vivo pelo agente quimiopreventivo do câncer, 3H-1,2-ditiol-3-tiona