pmid: "29228771"
title: "Derivado de curcumina reativa epigeneticamente a sinalização de estresse antioxidativo Nrf2 em células TRAMP C1 de câncer de próstata de camundongo."
authors: "Li W, Su ZY, Guo Y, Zhang C, Wu R, Gao L, Zheng X, Du ZY, Zhang K, Kong AN"
journal: "Chemical research in toxicology"
pubdate: "2018 Feb 19"
doi: "10.1021/acs.chemrestox.7b00248"
source: "PMC Full Text"

Derivado de curcumina reativa epigeneticamente a sinalização de estresse antioxidativo Nrf2 em células TRAMP C1 de câncer de próstata de camundongo.

Autores

Li W, Su ZY, Guo Y, Zhang C, Wu R, Gao L, Zheng X, Du ZY, Zhang K, Kong AN

Periodico

Chemical research in toxicology (2018 Feb 19)

Conteudo

Derivado de Curcumina Reativa Epigeneticamente a Sinalização Antioxidante de Estresse Mediada por Nrf2 em Células de Câncer de Próstata de Camundongo TRAMP C1

A carcinogênese do câncer de próstata (PCa) no modelo TRAMP é altamente correlacionada com a hipermetilação na região promotora do Nrf2 e a consequente redução da transcrição do Nrf2 e de seus genes detoxificantes regulados. Nosso objetivo foi investigar os efeitos da (3E,5E)-3,5-Bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno)-tetra-hidrotiopiran-4-ona (F10) e da (3E,5E)-3,5-Bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno)-tetra-hidropiran-4-ona (E10), dois derivados sintéticos da curcumina, na restauração da atividade do Nrf2 em células TRAMP C1. Células HepG2-C8 transfectadas com um vetor de luciferase contendo o elemento de resposta antioxidante (ARE) foram tratadas com F10, E10, curcumina e sulforafano (SFN) para comparar seus efeitos nas vias Nrf2-ARE. Realizamos PCR quantitativo em tempo real e western blotting para investigar os efeitos de F10 e E10 sobre o Nrf2 e os genes de desintoxicação de fase II correlacionados. Também medimos a expressão e a atividade das enzimas DNMT e HDAC. O enriquecimento de H3K27me3 na região promotora do Nrf2 foi explorado com um ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP). A metilação da região CpG no promotor do Nrf2 foi examinada duplamente por sequenciamento genômico por bissulfito (BGS) e imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP). Em comparação com a curcumina e o SFN, a F10 é mais potente na ativação das vias Nrf2-ARE. Tanto F10 quanto E10 aumentaram os níveis de Nrf2 e dos genes de desintoxicação de fase II correlacionados. Os ensaios de BGS e MeDIP indicaram que a F10, mas não a E10, hipometilou o promotor do Nrf2. A F10 também reduziu os níveis proteicos de DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, HDAC1, HDAC4 e HDAC7, bem como a atividade das DNMTs e HDACs. A F10, mas não a E10, reduziu efetivamente o acúmulo de H3k27me3 no promotor do Nrf2. F10 e E10 podem ativar a via Nrf2-ARE e aumentar os níveis de Nrf2 e dos genes de desintoxicação de fase II correlacionados. O efeito de reativação do Nrf2 pela F10 em TRAMP C1 pode ser proveniente da desmetilação, da diminuição das HDACs e da inibição do acúmulo de H3k27me3.
Resumo Gráfico
Introdução

De acordo com estudos epidemiológicos, a frequência de diagnóstico de câncer de próstata (PCa) ocupa o segundo lugar entre todos os cânceres nos EUA. Como muitos outros tipos de câncer, ele progride do estágio benigno para o maligno devido a alterações genéticas e epigenéticas. Em comparação com fatores genéticos, as alterações epigenéticas são relativamente reversíveis. Além disso, as alterações epigenéticas são aceitas como um importante preditor da significância do PCa por um número crescente de cientistas. A metilação aberrante de muitos genes, como GSTP1, RASSF1A, RARβ2 e galectina-3, está altamente envolvida na progressão do PCa e pode ser encontrada por detecção precoce em biópsias de tecido, soro e urina, podendo assim ser marcadores promissores para o diagnóstico de PCa e terapias-alvo.
O sistema de defesa antioxidante normalmente exerce um efeito positivo de prevenção do câncer; no entanto, quando esse sistema é desregulado, ele é um dos principais fatores promotores da toxicidade e progressão neoplásica do CP. O fator nuclear (derivado de eritróide 2)-like 2 (Nrf2) é um fator de transcrição de zíper de leucina básica (bZIP), que se mostrou um mediador vital na regulação positiva da transcrição de genes de fase II relacionados ao elemento de resposta antioxidante (ARE), envolvidos na desintoxicação e antioxidação. Esses genes são intimamente regulados pelo Nrf2 e contribuem para a preservação contra a invasão celular de ERO/ERN e metabólitos ativos de carcinógenos.

Em um modelo TRAMP, descobrimos que a carcinogênese do CP está altamente associada à hipermetilação da região promotora do Nrf2 e ao consequente silenciamento do Nrf2 e dos genes de desintoxicação de fase II correlacionados, incluindo a NAD(P)H quinona desidrogenase 1 (NQO1) e a heme oxigenase-1 (HO-1). Muitos fitoquímicos, incluindo 3,3'-diindolilmetano (DIM), sulforafano (SFN) e tocoferóis, demonstraram restaurar a expressão do Nrf2 ao desmetilar as regiões CpG no promotor do Nrf2, aumentando assim seus genes de desintoxicação e antioxidação de fase II a jusante e prevenindo o CP no modelo TRAMP.

F10 ((3E,5E)-3,5-bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno)-tetra-hidrotiopiran-4-ona) e E10 ((3E,5E)-3,5-bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno) tetra-hidropiran-4-ona) são derivados sintéticos da curcumina (Figura 1). Eles exibiram efeitos inibitórios mais fortes em células de câncer de próstata humano do que a curcumina, por meio da inibição da atividade do receptor de andrógeno. A análise de relação estrutura-atividade (SAR) indicou que os efeitos anti-CP mais potentes de E10 e F10 podem estar relacionados à estrutura do heteroátomo. Além disso, alguns grupos adicionais nos anéis aromáticos, como um grupo cetona heterocíclico de enxofre ou oxigênio, anéis benzênicos distais e grupos metoxila, podem potencializar ainda mais os efeitos. No entanto, o mecanismo de E10 e F10 na inibição da progressão do CP não está claro. Em nosso estudo anterior, a curcumina exerceu seu efeito preventivo no CP ao reativar epigeneticamente a transcrição do Nrf2 e ativar sua via antioxidante a jusante. Neste projeto, nosso objetivo foi explorar o mecanismo potencial de F10 e E10 na restauração da expressão do Nrf2 por meio da regulação epigenética em células TRAMP C1.

Materiais e Métodos
Reagentes e Produtos Químicos
Meio essencial mínimo (MEM), meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml), verseno e tripsina-EDTA foram adquiridos da Gibco (Grand Island, NY, EUA). Um kit de ensaio de proliferação celular Cell-Titer 96 AQueous One Solution foi obtido da Promega (Madison, WI). A DNA polimerase Platinum Taq foi adquirida da Invitrogen (Grand Island, NY, EUA). Géis pré-moldados de Tris-HCl, tampão de transferência turbo e membranas de PVDF foram obtidos da Bio-Rad (Hercules, CA, EUA). Tampão de corrida Tris-glicina-SDS e substrato quimioluminescente melhorado Super Signal foram adquiridos da Boston BioProducts (Ashland, MA, EUA) e Thermo (Rockford, IL, EUA), respectivamente. Anticorpos contra Nrf2 (C-20), HO-1 (C-20) e NQO1 (H-90), UGT1A1 (V-19) e actina (I-19) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). O coquetel inibidor de protease, tampão de radioimunoprecipitação (RIPA) e anticorpos contra HDACs (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4 e HDAC6) foram fornecidos pela Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O anticorpo anti-HDAC8 foi obtido do Proteintech Group (Chicago, IL), e os anticorpos anti-NQO1, anti-HDAC7, anti-H3, anti-DNMT3a e anti-DNMT3b foram da Abcam (Cambridge, MA, EUA). O anti-DNMT1 foi fornecido pela Novus Biologicals (Littleton, CO, EUA). E10 e F10 (pureza >95%) foram obtidos do laboratório de Kun Zhang (Laboratório de Química Medicinal Natural e Química Verde, Universidade de Tecnologia de Guangdong, Guangzhou, China), que foram sintetizados por aldeído e cetona em ácido acético glacial seguindo método publicado. Dimetilsulfóxido (DMSO), 5-aza desoxicitidina (5-aza) e tricostatina A (TSA) foram da Sigma (St. Louis, MO, EUA). Todos os outros produtos químicos, salvo indicação em contrário, foram obtidos da Sigma (St. Louis, MO, EUA).
Cultura de Células
Células de câncer de próstata de camundongo TRAMP-C1 (ATCC- CRL-2730) foram adquiridas da ATCC (Rockville, Maryland, EUA) com certificado de análise. As células foram cultivadas em DMEM (pH 7,0) contendo 10% de FBS a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. A linhagem celular HepG2-C8 de hepatocarcinoma humano foi previamente estabelecida por transfecção estável com um construto ARE-luciferase. As células foram cultivadas e mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. O meio de tratamento incluindo 0,1% de DMSO e drogas foi trocado a cada 2 dias.
Ensaio MTS
Células TRAMP-C1 foram semeadas a uma densidade de 1 × 10³ células por 100 μL de meio por poço em placas de 96 poços. Após incubação por 24 h, as células foram tratadas com 0,1% de DMSO (controle) ou concentrações variadas de E10 e F10 em DMEM contendo 1% de SFB por 1, 3 ou 5 dias. Amostras de E10 e F10 diluídas em série foram dissolvidas em DMSO (concentração final no meio de <0,1%), e o meio foi trocado a cada 2 dias. A viabilidade celular foi estimada com um kit de ensaio de proliferação celular Cell-Titer 96 AQueous One Solution (MTS) (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaio de Atividade do Repórter de Luciferase
As células HepG2-C8 transfectadas de forma estável que expressam o vetor ARE-luciferase foram utilizadas para comparar os efeitos de E10, F10, curcumina e SFN na via Nrf2-ARE. A atividade ARE-luciferase nas células HepG2-C8 foi determinada usando um kit de ensaio de luciferase de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI, EUA). Resumidamente, células HepG2-ARE-C8 (1,0 × 10⁵ células/poço) foram semeadas em placas de 12 poços em 1 mL de meio contendo 10% de SFB, incubadas por 24 h e, em seguida, tratadas com várias concentrações de E10, F10, curcumina e SFN. Posteriormente, as células foram lisadas usando o tampão de lise para repórter, e 10 μL do sobrenadante do lisado celular foram analisados quanto à atividade de luciferase usando um luminômetro Sirius (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Alemanha). A normalização da atividade de luciferase foi realizada com base nas concentrações de proteína, determinadas usando um ensaio de proteína BCA (Pierce Biotech, Rockford, IL, EUA). Os dados foram obtidos de três experimentos independentes e são expressos como a mudança de indução em comparação com o controle veicular.
Isolamento de RNA e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real Quantitativa (qPCR)
Células TRAMP-C1 foram semeadas a uma densidade de 1 × 105 células em placas de 10 cm com 10% de FBS/DMEM. Após 24 h, as células foram tratadas com DMEM contendo 1% de FBS com E10 (50 nM e 100 nM), F10 (50 nM e 100 nM) ou com 0,1% de DMSO como controle. O meio de tratamento foi trocado a cada 2 dias. Após o tratamento de 3 dias, o RNA total foi extraído das células usando um kit RNeasy Mini (QIAGEN, Valencia, CA). O cDNA de primeira fita foi sintetizado a partir do RNA total usando o sistema SuperScript III First-Strand Synthesis (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão de mRNA foram determinados por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando cDNA de primeira fita como molde e Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) em um sistema ABI7900HT. As seguintes sequências de primers para Nrf2, HO-1, NQO1 e UGT1A1 foram utilizadas: Nrf2, 5-AGCAGGACTGGAGAAGTT-3′ (sentido) e 5′-TTCTTTTTCCAGCGAGGAGA-3′ (anti-sentido); HO-1, 5′-CCTCACTGGCAGGAAATCATC-3′ (sentido) e 5′-CCTCGTGGAGACGCTTTACATA-3′ (anti-sentido); NQO1, 5 ′-AGCCCAGATATTGTGGCCG-3′ (sentido) e 5′-CTTTCAGAATGGCTGGCAC-3′ (anti-sentido); UGT1A1, 5′-GAAATTGCTGAGGCTTTGGGCAGA-3′ (sentido) e 5 ′-ATGGGAGCCAGAGTGTGTGATGAA-3′ (anti-sentido). β-Actina foi usada como controle interno com primers sentido (5′-CGTTCAATACCCCAGCCATG-3′) e anti-sentido (5′-ACCCCGTCACCAGAGTCC-3′).
Preparação de Lisados Proteicos e Western Blotting
Células TRAMP-C1 foram semeadas a uma densidade de 1 × 105 células em placas de 10 cm com 10% de FBS/DMEM. Após incubação por 24 h, as células foram tratadas com 0,1% de DMSO como controle, E10 (50 nM e 100 nM) e F10 (50 nM e 100 nM). Após o tratamento por 3 dias, as células foram lavadas com PBS gelado e colhidas em tampão RIPA 1× gelado (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) contendo um coquetel inibidor de proteases (Sigma). As concentrações de proteína dos lisados celulares foram medidas usando o método do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA). Concentrações idênticas de proteína (20 μg) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) de 4 a 15% (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e depois transferidas para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA e incubadas sequencialmente com anticorpos primários específicos e anticorpos secundários conjugados com HRP. As proteínas ligadas aos anticorpos foram visualizadas com SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) e medidas com um sistema Gel Documentation 2000 (Bio-Rad).
Sequenciamento Genômico por Bissulfito (BGS)
Células TRAMP-C1 (1 × 10⁵ células por placa de 10 cm) foram tratadas com 0,1% de DMSO como controle, E10 (50 nM e 100 nM), F10 (50 nM e 100 nM) e uma combinação de 5-aza (500 nM) e TSA (100 nM) por 3 dias. O DNA genômico foi então extraído das células com um kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Em seguida, 500 ng de DNA genômico foram submetidos à conversão por bissulfito com um kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corp., Orange, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA convertido foi amplificado com Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) e primers que amplificam os primeiros cinco CpGs do gene Nrf2 murino. As sequências dos primers foram 5′-AGTTATGAAGTAGTAGTAAAAA-3′ (sense) e 5′-AATATAATCTCATAAAACCCCAC-3′ (antisense). Um kit TOPO TA Cloning (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) foi usado para clonar os produtos de PCR no vetor pCR4 TOPO. Plasmídeos contendo produtos de PCR de pelo menos 10 colônias por tratamento em três experimentos independentes foram amplificados e purificados com um kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen), seguido de sequenciamento (GeneWiz, South Plainfield, NJ, EUA).
Extração Nuclear, Ensaio de Atividade de DNMTs e HDACs
Células TRAMP-C1 (1 × 10⁵ células por placa de 10 cm) foram tratadas com 0,1% de DMSO como controle, E10 (50 nM e 100 nM) e F10 (50 nM e 100 nM) por 3 dias. Extratos nucleares foram isolados de células controle e tratadas usando o kit EpiQuik Nuclear Extraction (Epigentek, Brooklyn, NY) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de proteína dos extratos nucleares foi medida pelo Reagente de Ensaio de Proteína BCA (Pierce, Rockford, IL).
As atividades totais de DNMTs das proteínas nucleares isoladas foram quantificadas usando um kit fluorimétrico EpiQuick™ DNMT Activity/Inhibition Assay Ultra (Epigentek, Brooklyn, NY). Um microlitro (5–10 μg) de extratos nucleares e 49 μl de reagente de ensaio foram adicionados a cada poço para testar a atividade de HDACs de acordo com as instruções do fabricante, usando um leitor de microplacas Tecan (Infinite m200 pro; Mannedorf, Suíça) com comprimento de onda de excitação de 530 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. As atividades de DNMTs foram normalizadas pela quantidade de proteína de cada amostra.
As atividades totais de HDACs das proteínas nucleares isoladas foram medidas usando um kit fluorométrico Epigenase™ HDAC Activity/Inhibition Direct Assay (Epigentek, Brooklyn, NY). Um microlitro (5–10 μg) de extratos nucleares e 49 μl de reagente de ensaio foram adicionados a cada poço para testar a atividade de HDACs de acordo com as instruções do fabricante, usando um leitor de microplacas Tecan (Infinite m200 pro; Mannedorf, Suíça) com comprimento de onda de excitação de 530 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. As atividades de HDAC foram normalizadas pela quantidade de proteína de cada amostra.
Análise de Imunoprecipitação de DNA Metilado (MeDIP)
Para verificar as alterações na metilação do DNA, o DNA metilado foi capturado e quantificado utilizando imunoprecipitação de DNA metilado acoplada à análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (MeDIP-qPCR) com base em um procedimento previamente relatado, com algumas modificações . Em resumo, o DNA extraído das células tratadas foi sonicado em gelo até um tamanho de fragmento de aproximadamente 200–1000 pares de base usando um sonicador Bioruptor (Diagenode Inc., Sparta, NJ, EUA). O DNA fragmentado foi desnaturado a 95 °C por 2 min. O DNA metilado foi isolado por imunoprecipitação com anticorpo anti-5′-metilcitosina usando um kit de captura de DNA metilado Methylamp (Epigentek, Farmingdale, NY, EUA) de acordo com o manual do fabricante. Após purificação final e eluição, o status de metilação foi quantificado por amplificação por qPCR do DNA enriquecido por MeDIP usando o conjunto de primers 5′-GAGGTCACCACAACACGAAC-3′ (sense) e 5′-ATCTCATAAGGCCCCACCTC-3′ (antisense) para cobrir a sequência de DNA dos primeiros cinco CpGs do Nrf2 murino. O enriquecimento de DNA metilado em cada tratamento foi calculado de acordo com a curva padrão da diluição seriada do DNA de entrada. As proporções relativas de DNA metilado foram então calculadas com base no controle que apresentou 100% de metilação do DNA.

Ensaio de Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP)
O ensaio de ChIP foi realizado utilizando o sistema MAGnify TM Chromatin Immunoprecipitation System (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, após tratamento com 0,1% DMSO, E10 (50 nM e 100 nM) ou F10 (50 nM e 100 nM) por 3 dias, as células TRAMP-C1 foram lavadas com PBS e tripsinizadas. Após uma lavagem com PBS, a cromatina dessas células (100.000 células foram usadas por IP) foi então reticulada com 1% de formaldeído por 10 min à temperatura ambiente, fragmentada em um comprimento médio de 200–500 pb por sonicação a 4 °C usando um sonicador Bioruptor (Diagenode Inc., Sparta, NJ, EUA) em tampão de lise. A solução de cromatina diluída foi imunoprecipitada com 2 μg de anticorpo anti-trimetil-histona H3-Lis27 (H3K27me3) (Abcam) ou imunoglobulina G de camundongo. Após lavagem, reversão da reticulação, eluição do DNA e purificação do DNA, a quantidade relativa de DNA imunoprecipitado foi quantificada por qPCR usando o primer 1 com 5′-GTATCACTTCATCCACCCAGAG-3′ (sense) e 5′-GTACGTGTAAAGGAACCCTGAG-3′ (antisense) e o primer 2, 5′-GGGTTCCTTTACACGTACTTACTC-3′ (sense) e 5′-GGTCACCACAACACGAACTAT-3′ (antisense), que cobrem as regiões promotoras do Nrf2. O enriquecimento do DNA precipitado foi calibrado usando a curva padrão da diluição seriada dos inputs, e os dados são apresentados como as alterações na razão sinal-input normalizadas em relação ao controle.
Análise Estatística
Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão de três experimentos independentes. Análise de variância de uma via (ANOVA) e teste de comparação múltipla de Duncan (SAS Institute Inc., Cary, NC) foram realizados para determinar diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05).
Resultados
E10 e F10 Aumentaram a Expressão de Nrf2 pelo Ensaio Repórter de Luciferase ARE
A atividade relativa da luciferase foi analisada em células HepG2-C8 transfectadas com o vetor repórter de luciferase ARE (Figura 2) pelo sinal de fluorescência da luciferase normalizado pela expressão proteica. E10 e F10 aumentaram maior atividade da luciferase do que o controle negativo (0,1% DMSO em meio) em proporção direta à concentração variando de 50 a 1000 nM, o que sugere que esses dois compostos podem ativar a expressão de Nrf2 e, consequentemente, aumentar a expressão dos genes antioxidantes / detoxificação com uma sequência ARE em suas regiões promotoras. Ao comparar a eficácia de ativação em termos de sinal de luciferase normalizado pela concentração proteica, F10 produziu um efeito muito mais potente a 1000 nM do que E10, curcumina e SFN.
E10 e F10 Induziram Citotoxicidade em TRAMP-C1
Com base em ensaios MTS, E10 e F10 foram encontrados para diminuir a viabilidade das células TRAMP-C1 em proporção direta ao tempo e à concentração do fármaco após 24h, 72h, e 120h de incubação (Figura 3). Uma vez que a taxa de sobrevivência das células TRAMP-C1 incubadas com E10 e F10 abaixo de 100 nM foi superior a 80%, tanto 50 quanto 100 nM de E10 e F10 foram selecionados para estudar o mecanismo epigenético de restauração de Nrf2.
E10 e F10 Aumentaram a Expressão de Nrf2 e os genes Antioxidantes e Detoxificação correlacionados
O Nrf2 é um fator de transcrição vital para ativar enzimas antioxidantes e de desintoxicação do tipo II, como HO-1, NQO1 e UGT1A1. No modelo de CaP TRAMP, relatos anteriores demonstraram que a expressão de Nrf2 é reduzida devido à sua região promotora altamente metilada. Para avaliar a influência de E10 e F10 sobre o Nrf2 e seus genes correlacionados de enzimas antioxidantes e de desintoxicação do tipo II, realizamos qPCR para comparar a alteração nos níveis de mRNA de Nrf2, HO-1, NQO1 e UGT1A1 em células TRAMP-C1 após um tratamento de 3 dias com E10 e F10 (Figuras 4A-D). E10 e F10 a 100 nM aumentaram significativamente a expressão de mRNA de Nrf2 (Figura 4A); E10 (50, 100 nM) e F10 (100 nM) induziram uma regulação positiva significativa em HO-1 (Figura 4B); E10 (50, 100 nM) e F10 (100 nM) elevaram significativamente NQO-1 (Figura 4C); no entanto, nem E10 nem F10 induziram qualquer aumento significativo na expressão de mRNA de UGT1A1 (Figura 4D). A expressão proteica dos genes acima sob o mesmo tratamento foi analisada por western blotting. Após um tratamento de 3 dias, E10 aumentou significativamente a expressão proteica de Nrf2 e NQO1 a 50 e 100 nM e de HO-1 e UGT1A1 a 100 nM (Figura 4E). Da mesma forma, concentrações mais altas de F10 também aumentaram significativamente o nível proteico de Nrf2 (100 nM), HO-1 (50, 100 nM), NQO1 (50, 100 nM) e UGT1A1 (100 nM) (Figura 4F). Portanto, tanto E10 quanto F10 são capazes de elevar o nível de Nrf2 e dos genes correlacionados de enzimas antioxidantes e de desintoxicação de forma transcricional e pós-transcricional, de maneira dose-dependente.
F10, mas não E10, reduziu a taxa de metilação das regiões CpG no promotor de Nrf2.
A alta taxa de metilação nas posições relativas (−1226 a −1086) ao sítio de início da transcrição (TSS) do Nrf2 indicou uma correlação estreita com a diminuição da expressão do Nrf2 no modelo TRAMP. Assim, empregamos BGS para examinar se E10 ou F10 podem reverter o status de metilação aberrante em células TRAMP-C1. Os resultados mostraram uma grande proporção de metilação (88,13%) da região de CpGs no promotor do gene Nrf2 nas células não tratadas (tratamento de 3 dias com DMSO 0,1%) (Figura 5A). No grupo controle positivo, tratamento de 3 dias com 5-aza-TSA (combinação de 5-aza (500 nM) e TSA (100 nM)), a taxa de metilação foi reduzida para 63,89% (Figura 5A). No grupo E10 (100 nM por 3 dias) e F10 (100 nM por 3 dias), a proporção de metilação foi alterada para 85,64% e 76,80%, respectivamente (Figura 5A). O tratamento com 5-aza e TSA ou com F10 por 3 dias induziu significativamente hipometilação na região promotora do Nrf2 (p < 0,05). Para confirmar ainda mais os achados, realizamos um teste MeDIP-qPCR. Após sonicação e pull-down com anticorpo anti-5-metilcitosina, as primeiras 5 regiões CpG localizadas nas posições relativas (−1226 a −1086) ao TSS do promotor do Nrf2 foram amplificadas e analisadas por qPCR. Os resultados mostraram que o grupo de tratamento de 3 dias com 5-aza-TSA ou o grupo F10 (tratamento de 3 dias com F-10 100 nM) diminuiu significativamente a taxa de metilação na região promotora do Nrf2 (p < 0,01, Figura 5B), enquanto não houve diferença significativa entre o grupo E10 e o controle (Figura 5B), o que ressoa com os dados de BGS. Em resumo, F10, mas não E10, pode diminuir a taxa de metilação das primeiras cinco regiões CpG no promotor do Nrf2, o que pode contribuir para a restauração da expressão do Nrf2.
Regulação das Enzimas de Modificação Epigenética por F10 e E10
Para analisar a influência de E10 ou F10 em enzimas vitais de regulação epigenética, a expressão proteica de DNMTs e HDACs com tratamento com E10 ou F10 foi examinada. As DNMTs (DNMT1, DNMT3a e DNMT3b) foram todas significativamente diminuídas apenas com o tratamento com F10 (p < 0,05, Figura 6B). No ensaio de atividade de DNMT, F10 a 50 nM e 100 nM inibiu a atividade total das DNMTs (p < 0,01, Figura 7A). Além disso, o tratamento com F10 também reduziu significativamente a expressão proteica de HDAC1, 4 e 7 (p < 0,05, Figura 6B). O tratamento com F10 na concentração de 50 nM também reduziu significativamente a atividade total das HDACs (p < 0,05, Figura 7B). Em contraste, E10 (100 nM) aumentou o nível proteico de DNMT1 e não afetou os níveis de DNMT3a ou 3b (p < 0,05, Figura 6A). E10 pode induzir uma diminuição significativa no nível proteico de HDAC4 e 7 (p < 0,05, Figura 6A). No ensaio de atividade, E10 a 100 nM diminuiu o nível total de DNMTs (p < 0,01, Figura 7A). E10 em ambas as concentrações aumentou a atividade total das HDACs (p < 0,01, Figura 7A).
O Tratamento com F10, mas não com E10, Diminuiu o Enriquecimento de H3K27me3 no Promotor do Nrf2 e em Nível Global
A trimetilação da histona 3 no resíduo de lisina 27 (H3K27me3) é comumente associada à repressão gênica e é um marcador importante para o estudo da influência transcricional. Para explorar a influência de F10 ou E10 no enriquecimento de H3K27me3 na região promotora do gene Nrf2, um ensaio de ChIP foi realizado com as células TRAMP-C1 tratadas com F10 ou E10 utilizando anticorpo anti-H3K27me3. Dois pares de primers foram utilizados para testar o acúmulo de H3K27 em diferentes regiões promotoras de Nrf2 (Figura 8A). Os resultados indicaram que o tratamento com F10 (100 nM) por 3 dias diminuiu significativamente o enriquecimento de H3K27me3 nas regiões promotoras de Nrf2, enquanto o tratamento com E10 (100 nM) por 3 dias aumentou o enriquecimento (Figuras 8B e C). Para examinar se o tratamento com E10 ou F10 teve algum efeito global sobre H3K27me3, a técnica de western blot foi utilizada para comparar a quantidade total de H3K27me3 nas células TRAMP-C1. Descobrimos que o tratamento com E10 (50 ou 100 nM) e uma dose elevada de F10 (100 nM) não afetaram a quantidade total de H3K27me3, enquanto F10 em dose baixa (50 nM) reduziu drasticamente a quantidade (Figuras 8D e E), o que sugere que F10 pode potencialmente ativar outros genes além de Nrf2 ao influenciar a quantidade total ou o enriquecimento de H3K27me3.
Discussões
Muitos fitoquímicos naturais, incluindo a curcumina, possuem propriedades quimiopreventivas contra o CP. F10 e E10 exibiram atividade inibitória mais potente do que a curcumina nas células de CP CWR-22Rv1 e LNCaP. Em nossos experimentos, E10 e F10 demonstraram a capacidade de limitar a expansão da célula de adenocarcinoma prostático TRAMP-C1. Resumidamente, E10 e F10 são capazes de prevenir a carcinogênese prostática in vitro.
A expansão excessiva e a viabilidade robusta das células cancerígenas podem ser induzidas por estresse oxidativo hiperativo. O Nrf2 pode regular o estresse oxidativo excessivo ao aumentar a transcrição de genes da fase II de desintoxicação e antioxidantes. Devido às suas capacidades de conservação celular, o Nrf2 é frequentemente inibido no estágio inicial do câncer. Em nossos experimentos, descobrimos que F10 e E10 poderiam aumentar o nível de Nrf2 e as enzimas antioxidantes e desintoxicantes da fase II correlacionadas, o que indica que F10 e E10 podem ter capacidade quimiopreventiva através da ativação da via do Nrf2.
Alterações epigenéticas intimamente correlacionadas com a carcinogênese do CP (câncer de próstata) têm recebido muita atenção. As DNA metiltransferases (DNMT1, DNMT3a e DNMT3b) podem metilar as bases 5' citosina em dinucleotídeos CpG. A taxa de metilação nas regiões promotoras de genes supressores tumorais é baixa, mantendo assim a atividade desses genes intacta. No entanto, em células tumorais, esses genes são geralmente silenciados por hipermetilação nas regiões promotoras. O silenciamento de genes supressores de câncer devido à hipermetilação aberrante em suas regiões promotoras demonstrou estar altamente correlacionado com a carcinogênese e progressão do CP. Nosso grupo descobriu que, de forma semelhante a outros genes supressores de câncer, a expressão de Nrf2 é epigeneticamente reduzida pela hipermetilação de seu promotor durante o desenvolvimento do CP em camundongos TRAMP e células TRAMP-C1. Nossos resultados de BGS e MeDIP (Figura 5) confirmaram duplamente que F10, e não E10, pode desmetilar eficientemente as primeiras cinco regiões CpG no promotor de Nrf2 em células TRAMP-C1, o que demonstrou estar altamente associado à restauração da expressão de Nrf2. O efeito desmetilante de F10 pode contribuir grandemente para sua capacidade de reduzir a expressão e atividade de DNMT1, 3a e 3b.

As modificações pós-traducionais (MPTs) de histonas, outro mecanismo importante na regulação epigenética, acredita-se serem cruciais na manipulação da transcrição gênica, alternando a cromatina para uma estrutura frouxa ou condensada ou introduzindo modificadores de histonas. As MPTs de histonas consistem principalmente na adição de grupos acetil via HATs, grupos metil via histona metiltransferases (HMTs) e grupos fosforil via histona quinases, e na remoção de grupos acetil via HDACs, grupos metil via histona demetilases (HDMs) e grupos fosforil via histona fosfatases.

Entre elas, a acetilação de histonas na cromatina, que é coordenada pelo equilíbrio de HATs e HDACs, está altamente relacionada à regulação da transcrição gênica. O aumento inadequado de HDACs no câncer pode ser a causa da diminuição dos genes supressores de câncer. Em nosso estudo, tanto E10 quanto F10 reduziram significativamente a expressão proteica de HDAC4 e 7; F10 também diminuiu os níveis de HDAC1. O tratamento com F10 na concentração de 50 nM também reduziu significativamente a atividade total das HDACs. Esses achados podem, até certo ponto, explicar o efeito quimiopreventivo de E10 e F10.

A metilação de lisinas de histonas, que inclui mono (me1)-, di (me2)- e tri (me3)-metilação, pode ativar ou reprimir genes relacionados. Como a modificação de histonas é um fator epigenético crucial na regulação da expressão gênica, a trimetilação da histona 3 no resíduo de lisina 27 (H3K27me3), que é catalisada pelo Complexo Repressivo Polycomb 2, está intimamente relacionada à repressão gênica no desenvolvimento. F10 (100 nM) pode reduzir significativamente o enriquecimento relativo de H3K27me3 por diferentes primers direcionados à região promotora de Nrf2, o que sugere um papel epigenético fundamental de F10 na restauração do nível de Nrf2 em células de CP.
No PCa, o nível global de H3K27me3 pode estar relacionado à gravidade. Em um estudo clínico, o nível geral de H3K27me3 indicou um aumento maior no PCa metastático do que no PCa localizado e no tecido prostático normal. O aumento de H3K27me3 também está associado a um escore de Gleason mais alto. O H3K27me3 global também foi demonstrado por Ngollo M et al. como um marcador crítico na carcinogênese e progressão prostática . Em nosso estudo, F10 (50 nM) reduziu grandemente o nível global de H3K27me3, o que pode ser um dos mecanismos de prevenção do câncer por F10.
Em relatos anteriores, análises de SAR foram realizadas entre a curcumina e seus cinco derivados A10, B10, C10, E10 e F10 na viabilidade das células de câncer de próstata humano CWR-22Rv1 e LNCaP. Os autores descobriram que E10 e F10 têm melhor efeito inibitório principalmente devido à estrutura de heteroátomo. Com base em nossos resultados, pode-se sugerir que os derivados da curcumina com anel heterocíclico contendo oxigênio exibem maior potência em influenciar enzimas de modificação epigenética do que a estrutura heterocíclica contendo enxofre. No entanto, mais experimentos são necessários para confirmar a suposição acima.
Conclusões
Em conclusão, os derivados da curcumina F10 e E10 são ambos eficazes na inibição da carcinogênese do PCa no modelo TRAMP. Ambos podem aumentar os níveis de mRNA e proteína de Nrf2 e dos genes correlacionados de desintoxicação de fase II e antioxidantes. Nosso trabalho é o primeiro a explorar os efeitos epigenéticos de E10 e F10. Embora sejam muito próximos em estrutura, F10, mas não E10, desempenha um papel importante na restauração epigenética da expressão diminuída de Nrf2 em células TRAMP-C1, reduzindo a taxa de metilação do promotor de Nrf2 e diminuindo o nível de HDACs. Além disso, apenas F10, mas não E10, pode reduzir o enriquecimento de H3K27me3 na região promotora de Nrf2. F10 e E10 são fitoquímicos quimiopreventivos potenciais promissores para o PCa, e sua eficácia clínica e perfis farmacocinéticos merecem mais estudos.
Notas
Os autores declaram que não há conflitos de interesse.
Abreviaturas
Nrf2
Fator nuclear eritroide-2 relacionado ao fator 2
HO-1
heme oxigenase-1; NQO1, NAD[P] H:quinona oxidoredutase-1
SOD
superóxido dismutase
GST
glutationa S-transferase
γ-GCL
γ-glutamil cisteína ligase
ARE
elemento de resposta antioxidante
Keap-1
Proteína 1 associada a ECH semelhante a Kelch
PCa
câncer de próstata
ROS
espécies reativas de oxigênio
DIM,
3,3'-diindolilmetano
F10
(3E,5E)-3,5-Bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno)-tetraidiotiopiran-4-ona
E10
((3E,5E)-3,5-Bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno) tetraidropiran-4-ona (E10))
DMEM
Meio Eagle Modificado por Dulbecco
MEM
Meio essencial mínimo
FBS
soro fetal bovino
DMSO
Dimetilsulfóxido
5-aza
5-azadesoxicitidina
TSA
Tricostatina A
SFN
sulforafano
BGS
Sequenciamento Genômico por Bissulfito
MeDIP
Imunoprecipitação de DNA Metilado
Referências
Tendências do câncer de próstata nos Estados Unidos
As alterações na metilação do DNA exibem estabilidade intraindividual e heterogeneidade interindividual nas metástases do câncer de próstata
Assinatura Epigenética: Um Novo Fator como Preditor de Câncer de Próstata Clinicamente Significativo (CP) em Pacientes em Vigilância Ativa (VA)
Metilação anômala do DNA e câncer de próstata
Metilação de promotores no câncer de próstata e sua aplicação para a detecção precoce do câncer de próstata usando amostras de soro e urina
Barreira de sinalização de danos ao DNA, estresse oxidativo e alterações de fatores de reparo de DNA relevantes para o tratamento durante a progressão do câncer de próstata humano
Fitoquímicos da Dieta e Quimioprevenção do Câncer: Uma Perspectiva sobre Estresse Oxidativo, Inflamação e Epigenética
O papel do Nrf2 no aumento de espécies reativas de oxigênio e danos ao DNA na tumorigênese da próstata
Farmacodinâmica da curcumina como agente de hipometilação do DNA na restauração da expressão de Nrf2 via desmetilação de CpGs do promotor
A expressão de Nrf2 é regulada por mecanismos epigenéticos no câncer de próstata de camundongos TRAMP
Modificações epigenéticas do Nrf2 pelo 3,3'-diindolilmetano in vitro na linhagem celular TRAMP C1 e in vivo em tumores prostáticos TRAMP
Sulforafano aumenta a expressão de Nrf2 em células TRAMP C1 de câncer de próstata através da regulação epigenética
Uma mistura de tocoferóis rica em gama-tocoferol mantém a expressão de Nrf2 em tumores prostáticos de camundongos TRAMP através da inibição epigenética da metilação de CpG
Análogos de curcumina com alta atividade para inibir o crescimento de células de câncer de próstata humano e a ativação do receptor de andrógeno
Síntese e avaliação de compostos relacionados à curcumina para atividade anticancerígena
Efeitos da glutationa na expressão gênica mediada pelo elemento de resposta antioxidante e na apoptose eliciada pelo sulforafano
Marcas repressivas e ativas de metilação de histonas distinguem promotores distintos em espermatozoides humanos e de camundongos
A inibição do eixo PI3K/AKT/mTOR interrompe a sobrevivência de células de melanoma mediada por estresse oxidativo
A perda de GSTP1 resulta no acúmulo de danos oxidativos à base do DNA e promove a sobrevivência de células de câncer de próstata após exposição a estresse oxidativo prolongado
Perfil epigenômico da metilação do DNA em câncer de próstata pareado versus tecido benigno adjacente
MIR137 é um repressor regulado por andrógeno de uma rede estendida de correculadores transcricionais
Altos níveis de 5-hidroximetilcitosina (5hmC) são um preditor adverso de recorrência bioquímica após prostatectomia em câncer de próstata ERG-negativo
Metilação do DNA e metiltransferases do DNA
Epigenômica do câncer: metilomas do DNA e mapas de modificação de histonas
Epigenética no câncer
Hipermetilação da ilha CpG em múltiplos sítios gênicos no diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata
Reativação epigenética do Nrf2 em células TRAMP C1 de próstata pelo análogo de curcumina FN1
Perfis de modificação de histonas caracterizam a regulação gênica específica da função
Biomarcadores de instabilidade genômica e epigenética do câncer
Perfil de expressão gênica de múltiplos inibidores de histona desacetilase (HDAC): definindo um conjunto genético comum produzido pela inibição de HDAC em linhagens celulares de carcinoma T24 e MDA
Modificações de cromatina e sua função
Os níveis globais de metilação da histona H3K27 são diferentes no câncer de próstata localizado e metastático
Análise global de H3K27me3 como marcador epigenético na progressão do câncer de próstata
Estrutura química do F10, ((3E,5E)-3,5-Bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno)-tetra-hidrotiopiran-4-ona) e E10 ((3E,5E)-3,5-Bis(3,4,5-trimetoxibenzilideno) tetra-hidropiran-4-ona (E10)).
Ensaio de atividade de luciferase ARE na avaliação da potência de E10, F10, curcumina e SFN na ativação de células HepG2-C8 transfectadas com luciferase ARE. A atividade da luciferase foi normalizada pela concentração de proteína do lisado celular. Os dados foram resumidos a partir de 3 testes independentes e são indicados como a mudança relativa em relação ao controle. *, p < 0,05; **, p < 0,01 comparado ao controle.
Mudança na viabilidade celular após tratamento com E10 e F10 por 1, 3 e 5 dias. Mil células TRAMP- C1 foram plaqueadas em cada poço de placas de noventa e seis poços por 24 horas e, em seguida, o meio de cultura foi trocado para E10 e F10 em diferentes doses por 1, 3 ou 5 dias. O meio de tratamento contendo 0,1% DMSO e os fármacos foram trocados a cada dois dias. O ensaio MTS foi utilizado para testar a viabilidade celular. Os dados são expressos como média ± DP de 3 testes independentes. *, p < 0,05; **, p < 0,01 comparado ao controle.
A influência de E10 (0, 50 e 100 nM) e F10 (0, 50 e 100 nM) nos níveis de mRNA e proteína de Nrf2 e seus genes downstream em células TRAMP-C1 após tratamento de 3 dias foi analisada por qPCR em tempo real e western blotting. Os dados são expressos como média ± DP de 3 testes independentes. *, p < 0,05 e **, p < 0,01 comparado ao controle. Nível relativo de mRNA de Nrf2 (Figura 4A), HO-1 (Figura 4B), NQO1 (Figura 4C) e UGT1A1 (Figura 4D) em células TRAMP-C1 de 3 testes independentes após incubação de três dias com E10 (0, 50 e 100 nM) e F10 (0, 50 e 100 nM). beta-Actina foi usada como controle interno. A influência do tratamento de 3 dias com E10 (0, 50 e 100 nM) e F10 (0, 50 e 100 nM) na expressão proteica dos genes correlacionados a Nrf2 (HO-1, NQO1 e UGT1A1) está indicada em (Figura 4E) e (Figura 4F). Os níveis relativos de expressão proteica são avaliados e comparados com base na intensidade do sinal das bandas relacionadas de três experimentos independentes. Os resultados foram normalizados usando a intensidade de β-actina para o nível total de proteína celular e são indicados como média ± DP.
Razão de metilação determinada por BGS e MeDIP dos primeiros 5 CpGs de −1226 a −1086 a montante do TSS do promotor Nrf2 em células TRAMP C1 após 3 dias de tratamento com 0,1% DMSO (controle), mistura de 5-aza (500 nM) e TSA (100 nM), E10 (100 nM) ou F10 (100 nM). Os dados são indicados como médias ± DP de 3 testes independentes.*. p < 0,05 e **, p < 0,01 em comparação com o grupo controle. Ensaio de BGS na avaliação da influência de E10 (100 nM) e F10 (100 nM) em comparação com o controle (0,1% DMSO), 5-aza (500 nM) e TSA (100 nM) na metilação do promotor Nrf2. Círculos sólidos denotam CpGs metilados, enquanto círculos vazios os não metilados (Figura 5A). Ensaio de MeDIP no exame dos efeitos de E10 (100 nM) e F10 (100 nM) em comparação com o controle (0,1% DMSO), 5-aza (500 nM) e TSA (100 nM) no status de metilação do promotor Nrf2. qPCR foi utilizado para quantificar a quantidade de DNAs MeDIP em relação aos seus inputs, calculando a curva padrão a partir de uma diluição serial de seus DNAs de input. A razão relativa de DNA metilado foi comparada com o controle (Figura 5B).

Efeitos de E10 (Figura 6A) e F10 (Figura 6B) na expressão das proteínas DNMT e HDAC. Células TRAMP-C1 foram submetidas a tratamentos de três dias com E10 (0, 50 e 100 nM) e F10 (0, 50 e 100 nM). A expressão relativa das proteínas foi medida de acordo com a intensidade das bandas relacionadas, normalizada pela β-actina. Os resultados são representados como média ± DP. *, p < 0,05 e **, p < 0,01 em comparação com o controle.

Influência de E10 e F10 na atividade de DNMTs (Figura 7A) e HDACs (Figura 6B) em células TRAMP-C1. Após tratamentos de três dias, a atividade relativa de DNMTs e HDACs foi calculada como a razão das atividades enzimáticas relativas dos grupos de tratamento em relação ao controle. *, p < 0,05 e **, p < 0,01 em comparação com o controle.

Células TRAMP C1 foram tratadas com controle (0,1% DMSO), E10 (50 e 100 nM) e F10 (50 e 100 nM) por 3 dias. A cromatina foi precipitada usando um anticorpo contra H3K27me3 e então usada como molde para qPCR. Dois sítios diferentes de enriquecimento de H3K27me3 foram selecionados na região promotora dos genes Nrf2 (Figura 8A), com o número à direita indicando as posições relativas dos dois primers (a e b) e éxons em relação ao sítio de início da transcrição (TSS). O enriquecimento relativo de H3K27me3 analisado por qPCR usando o primer A (Figura 8B) e o primer B (Figura 8C) foi comparado com o do controle. O efeito global de F10 (50, 100 nM) (Figura 8D) e E10 (50, 100 nM) (Figura 8E) foi analisado por western blotting. Os níveis relativos de expressão proteica foram quantificados com base na intensidade das bandas relacionadas e normalizados pela β-actina. *, p < 0,05 e **, p < 0,01 em comparação com o controle.