pmid: "38052218"
title: "Sulforafano atenua lesão testicular induzida por irradiação em camundongos."
authors: "Ran Y, Duan N, Gao Z, Liu Y, Liu X, Xue B"
journal: "Redox report : communications in free radical research"
pubdate: "2023 Dec"
doi: "10.1080/13510002.2023.2279818"
source: "PMC Full Text"

Sulforafano atenua lesão testicular induzida por irradiação em camundongos.

Autores

Ran Y, Duan N, Gao Z, Liu Y, Liu X, Xue B

Periodico

Redox report : communications in free radical research (2023 Dec)

Conteudo

Sulforafano atenua lesão testicular induzida por irradiação em camundongos

RESUMO
Objetivo:
O testículo é vulnerável à radiação ionizante, e disfunção sexual e infertilidade masculina são problemas comuns após radiação local ou exposição de corpo inteiro. Atualmente, não existem medicamentos aprovados para a prevenção ou tratamento da lesão testicular por radiação. O sulforafano (SFN) é um antioxidante indireto que induz enzimas de desintoxicação de fase II e genes antioxidantes. Neste estudo, investigamos o efeito protetor da radiação do SFN na lesão testicular em camundongos e seu mecanismo potencial.
Materiais e Métodos:
Camundongos foram divididos aleatoriamente em grupo controle em branco (Ctrl), grupo de radiação + sem pré-tratamento (IR) e grupos de radiação + SFN (IRS). Nos grupos de radiação + SFN, começando 72 h antes da radiação, a solução de SFN foi injetada intraperitonealmente uma vez ao dia até serem sacrificados. Camundongos no grupo controle em branco e no grupo de radiação + sem pré-tratamento foram simultaneamente injetados intraperitonealmente com um volume igual do solvente usado para dissolver o SFN (PBS com concentração final de 0,1% DMSO) até serem sacrificados. Eles foram submetidos à radiação de raios 6Mev na área testicular do abdome inferior (dose total de 2Gy). Vinte e quatro horas após a radiação, seis camundongos de cada grupo foram sacrificados aleatoriamente. Setenta e duas horas após a radiação, os camundongos restantes foram sacrificados.
Resultados:
Os resultados mostraram que os efeitos nocivos da radiação ionizante nos testículos se manifestaram como danos à histoarquitetura, aumento do estresse oxidativo e apoptose, e, portanto, comprometimento da fertilidade masculina. As injeções de SFN podem reverter esses sintomas.
Conclusões:
Os resultados mostraram que o SFN pode melhorar o dano testicular de camundongos causado pela irradiação. Além disso, o SFN previne a disfunção espermatogênica causada pela radiação ionizante ao ativar o Nrf2 e seu gene antioxidante downstream.
Introdução
Com a ampla aplicação da radiação ionizante na indústria e no tratamento clínico, a lesão por radiação tornou-se uma lesão mais comum. O testículo é o órgão sexual primário do homem e é muito sensível à radiação ionizante. A exposição à radiação pode causar lesão testicular, e uma redução na contagem e qualidade dos espermatozoides pode levar à infertilidade temporária ou até mesmo permanente. Além disso, foi relatado que pacientes do sexo masculino frequentemente sofrem de disfunção sexual, oligozoospermia, azoospermia e infertilidade durante o tratamento com radiação ionizante.
A lesão testicular por radiação é o principal fator na redução da fertilidade em pacientes com câncer. As vias moleculares que controlam a espermatogênese sob radiação e os mecanismos de resposta ao dano ao DNA e homeostase nas células-tronco espermatogoniais ainda não são claros. As células-tronco espermatogoniais suportam a diferenciação de células germinativas normais e devem ser preservadas ao longo da vida. No entanto, a recuperação da espermatogênese pode ser prejudicada devido à redução das células-tronco espermatogoniais após a radiação. A dose de radiação começa a afetar adversamente a espermatogênese em 0,1-1,2 Gy, e danos irreversíveis ocorrem em 4 Gy.

Estudos recentes mostraram que a radiação ionizante estimula o estresse oxidativo e gera espécies reativas de oxigênio (ROS), como radicais hidroxila, peróxido de hidrogênio e ânions superóxido, que podem causar dano direto. Indiretamente, a radiação divide moléculas de água e causa maior dano às moléculas biológicas porque os produtos da decomposição da radiação são altamente reativos. O estresse oxidativo ocorre quando a produção de ROS excede a capacidade da célula de se defender contra a oxidação. O uso de compostos químicos na radioterapia é uma estratégia óbvia para melhorar os resultados terapêuticos. No entanto, devido à sua toxicidade inerente e alto custo, a maioria dos compostos protetores radioativos sintéticos estudados é subutilizada clinicamente. Portanto, para lesão testicular por radiação, há uma necessidade urgente de agentes protetores de radiação altamente eficazes com menos efeitos colaterais.

No presente estudo, um composto isotiocianato natural, sulforafano (SFN), encontrado em vegetais crucíferos, foi utilizado para investigar se poderia proteger camundongos do dano testicular induzido por radiação ionizante. Nossos resultados demonstram o efeito radioprotetor do SFN na lesão testicular por radiação. Especificamente, o SFN reduz o acúmulo de danos ao DNA e a apoptose de células germinativas, facilitando a recuperação da espermatogênese pós-irradiação ao preservar o pool de SSCs.

Materiais e métodos
Animais e delineamento experimental
Camundongos machos C57BL/6J, com 7-8 semanas de idade, foram adquiridos e criados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Soochow. Uma temperatura ambiente de 18-24°C e um ciclo contínuo de 12 horas claro/escuro foram mantidos. Cada camundongo teve livre acesso a uma dieta laboratorial padrão e água. 48 camundongos com 7-8 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em seis grupos: controle branco (Ctrl, n = 12), pré-tratamento com 5 mg/kg de SFN (S1, n = 12), pré-tratamento com 10 mg/kg de SFN (S2, n = 12), radiação + sem pré-tratamento (IR, n = 12), radiação + pré-tratamento com 5 mg/kg de SFN (IRS1, n = 12), radiação + pré-tratamento com 10 mg/kg de SFN (IRS2, n = 12). Em todos os grupos SFN, os camundongos receberam injeção intraperitoneal de uma solução de SFN (MedChemExpress, EUA) uma vez ao dia, a partir de 72 horas antes da radiação até serem sacrificados. Os camundongos do grupo controle e do grupo radiação + sem pré-tratamento receberam injeções intraperitoneais de um volume igual do solvente para dissolver o SFN (PBS com concentração final de 0,1% DMSO) ao mesmo tempo até serem sacrificados. Os camundongos do grupo radiação e dos grupos radiação + SFN foram submetidos a radiação de raios de 6 MeV na área testicular inferior do abdômen (dose total de 2 Gy). Vinte e quatro horas após a radiação, seis camundongos foram sacrificados aleatoriamente em cada grupo. Setenta e duas horas após a radiação, os camundongos restantes foram sacrificados. Todos os experimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Soochow e conduzidos de acordo com suas diretrizes.
Análise de sêmen assistida por computador (CASA) e detecção do nível de testosterona testicular
A cauda do epidídimo de um lado do camundongo foi cuidadosamente removida, dissecada e incubada em 1 mL de tampão contendo 75 mM de NaCl, 24 mM de EDTA e 0,4% de FBS por 5 min a 37 °C em banho-maria para permitir a liberação dos espermatozoides. Soprar suavemente e misturar bem, enxaguar 3 μL da suspensão de espermatozoides na placa de contagem correspondente, colocá-la no analisador de sêmen assistido por computador (Beijing Weili New Century Technology, China) e completar a detecção automática. A testosterona foi medida por imunoensaio de eletroquimioluminescência (Roche Science, Alemanha) a partir de amostras testiculares dos camundongos.
Ensaio de biomarcador de estresse oxidativo
O kit de ensaio de MDA obtido da ABclonal Technology (China) foi selecionado para determinar o conteúdo de MDA nos testículos. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.
Avaliação histomorfológica do testículo
Seis testículos de cada grupo foram removidos e fixados em paraformaldeído a 4%, e então embebidos em parafina, seccionados com espessura de 4 μm antes de serem corados com hematoxilina e eosina (H&E). As secções coradas foram estudadas por microscopia de luz para avaliar a espermatogênese e estudos histopatológicos. A espermatogênese foi investigada com o sistema de pontuação de Johnsen. O epitélio germinativo de pelo menos 25–30 túbulos para cada testículo foi avaliado e a pontuação média de Johnsen por camundongo foi calculada. Para avaliação quantitativa, cinco túbulos seminíferos aleatórios de cada testículo foram selecionados e a espessura do epitélio (da membrana basal ao lúmen) foi medida pelo software Image-Pro Plus. A apoptose foi analisada pelo kit de ensaio TUNEL (BOSTER Biological Technology, China) de acordo com as instruções do fabricante.
Extração de RNA e análise de transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)
PLZF direto 5′-CGTTGGGGGTCAGCTAGAA-3′,
reverso 5′-GCATGGGGCTCTCTTTCCTT-3′;
CCNA1 direto 5′-GTGGGTTCCCAAGCAGCA-3′,
reverso 5′-CCCTAGCACGGTTCTCTGTG-3′;
Nrf2 direto 5′-GCCCTCAGCATGATGGACTT-3′,
reverso 5′-AACTTGTACCGCCTCGTCTG-3′;
DMRT1 direto 5′-CGAGAGCTCGAAGGGAGTTC-3′,
reverso 5′-CACCCTGTGACCAGAGTAGC-3;
HO-1 direto 5′-GTCAAGCACAGGGTGACAG-3′,
reverso 5′-CTAGCAGGCCTCTGACGAAG-3′;
SOD1 direto 5′-GGGAAGCATGGCGATGAAAG-3′,
reverso 5′-CCCCATACTGATGGACGTGG-3′;
OVOL2 direto 5′-CTGCGAGTAACCTGGAGTGA-3′,
reverso 5′-GGCATGGTGGGATCCTCTC-3′;
NQO1 direto 5′-CATTGCAGTGGTTTGGGGT-3′,
reverso5′-TCTGGAAAGGACCGTTGTC-3′;
SYCP2 direto 5′-AAGGAGCTGACTTTCCTTGG-3′,
reverso 5′-GCAGAGCCTTTTCCTCTTTCA-3;
Stra8 direto 5′-TTATAATGGCCACCCCTGGAGA-3′,
reverso5′-CCTATTCAGTACCTGCCACAG-3′;
SPO11 direto 5′-GCAACCAAGAGGAGCAATG-3′,
reverso5′-TCCTGGGCACTTTCAGCATA-3′;
Prm1 direto 5′-AGCATCTCGCCACATCTTGA-3′,
reverso 5′-TGACAGGTGGCATTGTTCCT-3′.
Actina direto 5′-TGAGCTGCGTTTTACACCCT-3′,
reverso 5′-GCCTTCACCGTTCCAGTTT-3′.
O RNA total do testículo foi extraído (Vazyme, China), e então transcrito reversamente para cDNA com o HiScript III RT SuperMix para qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme, China). A PCR em tempo real foi realizada em um Sistema de Detecção de Sequência (ABI StepOnePlus, Thermo Fisher Scientific, EUA) usando o Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, China), de acordo com as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores foram sintetizadas pela Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. e foram as seguintes:
A actina serviu como controle interno para cada amostra.
Análise imuno-histoquímica
Após a desparafinização, os cortes foram recuperados por solução de recuperação antigênica por 60 min a 70°C. Todas as secções foram bloqueadas com albumina de soro bovino a 10% (BSA) e depois incubadas com anticorpo anti-p-Nrf2 (Abclonal, 1:100) a 4°C durante a noite. As lâminas foram lavadas em PBS e incubadas com anticorpos secundários por 30 min, seguido de uma lavagem adicional. Eles foram então tratados com reagente DAB (Gene Tech, China). Após lavagem das amostras com PBS, foi realizada contracoloração com hematoxilina e posterior lavagem com água da torneira. Os cortes foram desidratados em álcool graduado e cobertos com lamínula. O número de células coradas foi determinado em quatro campos por lâmina ao microscópio.
Cultura celular
A linhagem celular de espermatogônias de camundongo (GC-1spg) foi adquirida da ATCC (EUA) e cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM, Gibco, China) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cegrogen Biotech, Alemanha) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, China) e incubada em uma incubadora umidificada a 37 ° C sob 5%. CO2.
Medição da geração de ROS
De acordo com as instruções do fabricante, a geração de ROS foi examinada por um Kit de Ensaio de ROS (Beyotime, China) que pode ser detectado com um leitor de enzima fluorescente. O sulforafano foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) para soluções estoque de 100 mM e armazenado a -80 °C. As concentrações de trabalho foram preparadas recentemente em meio de cultura. A concentração final de DMSO foi mantida em 0,1% para todas as amostras, incluindo controles. Após quatro horas de incubação, o meio contendo sulforafano foi removido e substituído por meio de crescimento fresco. o procedimento de tratamento foi repetido por três dias consecutivos. Em seguida, as células foram expostas à radiação ionizante utilizando RS2000 Pro (Rad Source, EUA) a uma taxa de dose de 1,225 Gy/min (total 2Gy). Após 3 horas, as células GC-1 foram incubadas com DCFH-DA 10 mM a 37 ° C durante 20 min. A fluorescência foi determinada com uma varredura de poço de 48 pontos em um Synergy2 (BioTek, EUA).
Western blotting
A proteína testicular total foi extraída e quantificada. As proteínas (40μg) foram separadas por dodecil sulfato de sódio (SDS)-PAGE e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF), que foi então bloqueada em leite desnatado a 5% por 1 h. Anticorpos primários diluídos TBST (1: 1000) contra Nrf2, SOD1, Histona H3 e HO-1 (Proteintech, China); c-Kit, Stra8, 4-hidroxinonenal (4-HNE), NQO1 (1:1000 - 1:3000, Abcam, China); Cleaved-Caspase3, β-actina e γH2AX (1: 1000, Cell Signaling Technology, EUA); 3-nitrotirosina (3-NT), PLZF, Phospho-Nrf2-S40 (1:1000, Abclonal, China), foram incubados com a membrana a 4◦C durante a noite e a membrana foi lavada três vezes com TBST. Posteriormente tratado com segundo anticorpo apropriado (1: 1000, Beyotime, China) durante 1 h à temperatura ambiente, e a membrana foi lavada três vezes com TBST. Em seguida, visualizado usando um kit de detecção de quimioluminescência aprimorado. Os resultados foram analisados ​​pelo FluorChem M (Alpha, Estados Unidos).
Análise estatística
GraphPad Prism 8.0 (San Diego, Estados Unidos) foi utilizado para a análise estatística. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). As comparações entre grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student bicaudal não pareado. Os asteriscos representam os valores de p da seguinte forma: ∗ p < 0,05, ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗ p < 0,001, p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados
O SFN aliviou a lesão do epitélio seminífero induzida por radiação ionizante
O SFN aliviou a lesão do epitélio seminífero induzida por radiação ionizante. (A) Coloração por hematoxilina e eosina das amostras de testículo no dia indicado após a IR (barra = 50 μm). A estrela vermelha mostra a atrofia dos túbulos seminíferos. A estrela amarela mostra a espessura do epitélio. Controle em branco (Ctrl). Irradiação + nenhum pré-tratamento (IR). Irradiação + pré-tratamento com 5 mg/kg de SFN (IRS1). Irradiação + pré-tratamento com 10 mg/kg de SFN (IRS2). (B) Diagrama de barras mostrando o escore de Johnsen do testículo. (C) Diagrama de barras mostrando a espessura epitelial dos túbulos seminíferos. n = 6 pelo menos em cada grupo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs Ctrl; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs IR.
Conforme mostrado na Figura 1A, nenhuma alteração histopatológica significativa foi observada no grupo Ctrl. Em comparação com o grupo controle, os túbulos espermatogênicos atrofiaram, o epitélio espermatogênico afinou com uma grande redução de células espermatogênicas no grupo IR, a espessura epitelial e o escore de Johnsen também diminuíram significativamente (p < 0,001), conforme mostrado na Figura 1B,C. No entanto, os túbulos espermatogênicos estavam ligeiramente degenerados e as células espermatogênicas estavam ligeiramente ausentes nos grupos IRS1 e IRS2. Enquanto isso, o escore de Johnsen e a espessura epitelial dos grupos IRS1 e IRS2 foram maiores do que os do grupo IR (p < 0,001). Mais precisamente, 5 mg/kg de SFN exibiram uma melhor capacidade de lidar com a lesão testicular induzida por irradiação do que 10 mg/kg de SFN. Conforme mostrado na Figura 1D, 24 horas após a radiação, não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no nível de testosterona testicular dos camundongos em cada grupo (p > 0,05). 72 horas após a radiação, também não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no nível de testosterona testicular dos camundongos em cada grupo (p > 0,05).
Efeitos do SFN na apoptose e dano ao DNA de células germinativas testiculares após radiação ionizante.
Efeitos do SFN na apoptose e dano ao DNA de células germinativas testiculares após radiação ionizante. (A) As células em apoptose foram determinadas pela coloração TUNEL. Barra = 50 μm. → Indica células TUNEL-positivas. (B) A frequência de células TUNEL-positivas nos testículos dos camundongos. (C) Níveis relativos de proteína de γH2AX e Cleaved-caspase3 detectados por Western blot, n = 3 para cada grupo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs Ctrl; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs IR.
Como a radiação ionizante pode induzir apoptose das células testiculares, utilizamos o kit de detecção de apoptose TUNEL para detectar o nível de apoptose das células testiculares de camundongos. Conforme mostrado na Figura 2A, em comparação com o grupo IR, o número de células TUNEL-positivas nos grupos IRS1 e IRS2 diminuiu (p < 0,01). Além disso, medimos os níveis de proteínas relacionadas à apoptose. Observamos que a expressão da proteína pró-apoptótica clivada-caspase3 e do marcador de quebra de dupla fita de DNA γH2AX foi marcadamente aumentada no grupo IR, enquanto esses efeitos foram revertidos pelo tratamento com SFN (Figura 2C). No geral, esses resultados indicaram que o SFN confere proteção contra a apoptose induzida por irradiação.

Efeitos do SFN sobre a função espermatogênica após radiação ionizante

Para avaliar o efeito do SFN na melhora da função espermatogênica, realizamos análise de esperma assistida por computador. Os resultados mostraram que o SFN melhorou significativamente a concentração de espermatozoides e a motilidade total dos espermatozoides em camundongos IRS1 e IRS2 (Figura 3A,B). No entanto, o tratamento com 10mg/kg de SFN pareceu obviamente tóxico para os espermatozoides. Em seguida, procuramos determinar os padrões de expressão de genes candidatos que a administração de SFN poderia proteger. IRS1 e IRS2 foram incluídos na análise de expressão gênica para determinar o mecanismo. Descobrimos que 5 mg/kg de SFN melhorou a expressão de alguns genes melhor do que 10 mg/kg de SFN após a radiação ionizante.

Efeitos do SFN sobre a função espermatogênica após radiação ionizante. (A) Concentração de espermatozoides. (B) Motilidade total dos espermatozoides (PR+NP). (C) Expressão do mRNA e proteína PLZF no testículo. (D) Expressão do mRNA e proteína Stra8 no testículo. (E) Expressão do mRNA DMRT1 no tecido testicular. (F) Expressão do mRNA SPO11 no testículo. (G) Expressão do mRNA CCNA1 no testículo. (H) Expressão do mRNA SYCP2 no testículo. (I) Expressão do mRNA OVOL2 no testículo. (J) Expressão do mRNA Prm1 no testículo. (K) Nível relativo da proteína c-kit detectado por Western blot, n = 3 em cada grupo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001vs Ctrl; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001vs IR.

Nossos resultados mostraram que o SFN aumentou significativamente os níveis de genes de autorrenovação das CCE (PlZF, DMRT1) e genes de diferenciação das CCE (incluindo Stra8, SYCP2, SPO11, OVOL2 e CCNA1) em comparação com o grupo IR (P < 0,05) (Figura 3). As expressões de PLZF, DMRT1, SYCP2, SPO11 e CCNA1 aumentaram mais com o tratamento com 5 mg/kg de SFN em comparação ao tratamento com 10 mg/kg de SFN após a radiação ionizante. Os resultados de PLZF e Stra8 foram verificados adicionalmente por western blot. Os níveis do marcador de células espermatogênicas aumentaram significativamente nos grupos IRS1 e IRS2 em comparação com o grupo IR. Também avaliamos a expressão de Prm1 após a administração de SFN (Figura 3J). O resultado mostrou que a expressão de Prm1 aumentou notavelmente com o tratamento com SFN em IRS1 e IRS2.

O SFN inibe o estresse oxidativo testicular induzido por radiação ionizante
SFN inibe o estresse oxidativo testicular induzido por radiação ionizante. (A) A sonda fluorescente DCFH-DA foi utilizada para detectar ROS em células GC-1. (B) Nível de MDA no testículo. (C), (D) Western blotting foi utilizado para detectar a expressão do indicador de estresse oxidativo, 3-NT e 4-HNE. n = 3 em cada grupo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs Ctrl; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs IR
Para investigar a geração de espécies reativas de oxigênio nas células, avaliamos a produção de ROS. Em comparação com o grupo controle, a produção de ROS aumentou significativamente após a radiação ionizante (P < 0,05). A intervenção com SFN reduziu os níveis de ROS induzidos pela radiação em comparação com os níveis no grupo IR (P < 0,05) (Figura 4A). O MDA é o principal produto da peroxidação lipídica e é produzido por ácidos graxos insaturados, aminoácidos livres e DNA expostos à radiação ionizante. A radiação ionizante aumentou rapidamente os níveis de MDA nos testículos, mas a administração de SFN mostrou uma diminuição nos níveis de MDA (Figura 4B). Western blotting foi realizado para detectar o acúmulo dos marcadores de estresse oxidativo 3-nitrotirosina (3-NT) e 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) no testículo. Os resultados mostraram que a radiação ionizante aumentou significativamente a expressão de 3-NT e 4-HNE no testículo em comparação com o grupo Ctrl, enquanto a expressão induzida por radiação de 3-NT e 4-HNE diminuiu significativamente com o tratamento com SFN (Figura 4C,D).
SFN aumentou a expressão de Nrf2 e restringiu a ativação de NFκB no testículo após radiação ionizante
SFN aumentou a expressão de Nrf2 e restringiu a ativação de NFκB no testículo após radiação ionizante. (A) A expressão de Nrf2 em nível de mRNA foi detectada por PCR em tempo real. (B) A expressão de Nrf2 em nível de proteína foi detectada por Western blot. (C) A ativação de Nrf2 foi examinada por imuno-histoquímica (barra = 50μm). →Indica células positivas para p-Nrf2. (D) Western blot para fosforilação de Nrf2 em Ser40 (p-Nrf2), Keap1, p65, p-p65. (E), (F) A função de Nrf2 foi medida determinando a expressão dos genes downstream de Nrf2, SOD1, heme oxigenase 1 (HO-1) e NAD(P)H: quinona oxidoredutase (NQO1) em níveis de mRNA e proteína. n = 3 em cada grupo. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs Ctrl; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs IR.
Esses resultados acima sugerem que o SFN pode prevenir a lesão testicular induzida por radiação. Portanto, primeiro examinamos se o SFN previne esse efeito induzido pela radiação ativando o Nrf2, medindo a expressão de Nrf2 e sua transcrição no testículo. Em comparação com o grupo Ctrl, o tratamento com radiação ionizante diminuiu significativamente a expressão de Nrf2 em nível de mRNA (Figura 5A) no testículo tanto em 1d quanto em 3d. A expressão de Nrf2 em nível de proteína (Figura 5B) diminuiu em 1d com o tratamento com radiação ionizante, mas aumentou em 3d. No entanto, a expressão de Nrf2 no testículo aumentou significativamente tanto em 1d quanto em 3d nos grupos IRS1 e IRS2 em comparação com o grupo IR.
Estudos anteriores relataram que o SFN modificou o resíduo de cisteína da Keap1 e promoveu diretamente o desacoplamento do Nrf2 com a Keap1, translocando assim o Nrf2 para o núcleo. A coloração imuno-histoquímica de p-Nrf2 mostrou que a expressão de p-Nrf2 estava localizada principalmente no núcleo das células espermatogênicas nos grupos tratados com SFN (Figura 5C). A análise quantitativa das expressões de p-Nrf2 por western blotting confirmou que a expressão de p-Nrf2 aumentou significativamente em 1d e 3d nos grupos IRS1 e IRS2, e a Keap1 diminuiu após a radiação ionizante (Figura 5D).
A função transcricional do Nrf2 foi confirmada pelo aumento da expressão de seus genes antioxidantes downstream, SOD1, HO-1 e NQO1, nos níveis de mRNA (Figura 5E) e proteína (Figura 5F). A radiação ionizante diminuiu a expressão desses genes tanto em 1d quanto em 3d. Em comparação com o grupo IR, a expressão testicular desses genes aumentou significativamente nos grupos IRS1 e IRS2 em ambos os tempos 1d e 3d. Considerando o papel importante no dano celular causado pela radiação ionizante, foi investigada a influência do SFN no fator de transcrição regulado por redox, fator nuclear kappa B (NF-κB). O tratamento com radiação ionizante elevou significativamente o nível de fosforilação do NF-κB p65 em comparação com o grupo controle (Figura 5D), o que indicou que a atividade do NF-κB foi ativada pela radiação ionizante no testículo. O tratamento com SFN inibiu grandemente a fosforilação do NF-κB. Esses resultados sugerem que o SFN exerce um papel antioxidante modulando a via de sinalização Nrf2/NFκB.
Discussão
Este estudo mostra que o SFN pode resistir à toxicidade reprodutiva causada pela radiação ionizante in vivo. O SFN reduziu o nível de estresse oxidativo e restaurou efetivamente a microestrutura testicular danificada pela radiação ionizante. O mecanismo pode envolver a resistência à apoptose induzida pelo estresse oxidativo. O SFN pode ser considerado um excelente candidato para potenciais aplicações clínicas no tratamento de lesão testicular associada à radiação.
A radiosensibilidade das células dos tecidos é proporcional à sua capacidade proliferativa. O testículo é onde as espermatogônias no epitélio dos túbulos seminíferos se desenvolvem em espermatozoides após sucessivas mitoses e meiose, sendo muito ativo em proliferação e diferenciação. Neste estudo, observou-se atrofia dos túbulos seminíferos em camundongos após radiação ionizante, acompanhada de redução e afinamento das células espermatogênicas. No entanto, o nível de testosterona não apresentou diferença significativa em cada grupo de camundongos; a possível razão é que as células de Leydig do testículo são notavelmente mais radiorresistentes do que o epitélio germinativo e são lesionadas apenas por altas doses terapêuticas de radiação. Estudos demonstraram que parte da toxicidade da radiação ionizante é causada por apoptose maciça em órgãos radiossensíveis. A apoptose é uma manifestação patológica importante da lesão testicular induzida por irradiação. A radiação pode levar ao aumento da apoptose das células testiculares, diminuir o número total de células germinativas e reduzir a espessura epitelial das células germinativas, e a inibição da apoptose das células germinativas pode reduzir a lesão testicular. Acreditamos que a lesão testicular causada pela radiação ionizante neste estudo foi, em parte, devida à apoptose causada por uma grande quantidade de irradiação, o que leva diretamente a uma grande diminuição no número de células espermatogênicas.

Os resultados do nosso estudo mostraram níveis aumentados de genes de autorrenovação e diferenciação nos testículos administrados com SFN, que são determinantes-chave na espermatogênese. Em um estudo, os resultados mostraram a importância do PLZF para manter a autorrenovação das CSE. Além disso, o Dmrt1 é um regulador gonadal altamente conservado expresso em todas as células germinativas mitóticas de camundongos, incluindo as células-tronco espermatogoniais (CSE), e promove a manutenção das CSE, pelo menos em parte, ativando a transcrição do PLZF para regular a autorrenovação. Parece que o SFN pode promover a autorrenovação nessas células protegendo a expressão dos genes de autorrenovação das CSE, PLZF e DMRT1.
Nossos resultados também mostraram que os genes envolvidos na diferenciação de CCE (c-Kit, Stra8, SPO11, SYCP2, OVOL2, CCNA1) aumentaram significativamente após a administração de SFN. De acordo com estudos anteriores, o c-Kit está envolvido na diferenciação das espermatogônias, é um marcador de espermatogônias diferenciadas do tipo A1-B e desempenha um papel fundamental na sobrevivência e proliferação. A superexpressão de c-Kit induziu a diferenciação espermatogonial e promoveu indiretamente a expressão de Stra8, acelerando assim a espermatogênese e a meiose. O SPO11 é altamente expresso nas células germinativas testiculares e é uma proteína específica para a meiose, iniciando a recombinação meiótica por meio da mediação de quebras de fita dupla (DSBs). A Stra8 é expressa no início da meiose nas células germinativas. O OVOL2, uma família de fatores de transcrição de dedo de zinco, é expresso em espermatócitos na fase de paquíteno e sugere-se que seja um regulador crítico da progressão do paquíteno nas células germinativas masculinas. O SYCP2 é necessário para a montagem do complexo sinaptonêmico e para a sinapse cromossômica durante a meiose masculina. A CCNA1 está localizada em espermatócitos meióticos tardios e desempenha um importante papel regulador no ciclo celular. Assim, parece que o SFN promove a diferenciação das células espermatogoniais ao proteger a expressão de genes que desempenham um papel na diferenciação espermatogonal. Notavelmente, observamos que a capacidade de 5 mg/kg de SFN de prevenir a disfunção espermatogênica causada pela radiação ionizante é melhor do que 10 mg/kg de SFN.

A compactação da cromatina é uma etapa vital na maturação do espermatozoide e na capacidade de fertilização. Ela desempenha um papel fundamental na forma da cabeça do espermatozoide e espera-se que afete a função espermática. A Prm1 substitui as histonas no tecido testicular e desempenha um papel crucial na compactação da cromatina, necessária para manter uma forte qualidade espermática. Podemos concluir que o SFN promove a maturação dos espermatozoides e mantém sua densidade de cromatina durante a espermatogênese ao proteger a expressão do gene Prm1. Nossos resultados mostraram um aumento significativo nos genes associados à espermatogênese após a administração de SFN.
O Nrf2 é um importante fator de transcrição que regula as respostas redox e protege contra o estresse oxidativo ao aumentar os níveis de genes e enzimas antioxidantes. Foi demonstrado que a regulação positiva do Nrf2 inibe os danos cutâneos induzidos por radiação em camundongos. Isso sugere que a interação precisa entre o sistema de defesa antioxidante mediado pelo Nrf2 e a radiação pode desempenhar um papel fundamental na ocorrência e desenvolvimento da lesão testicular induzida por irradiação. Neste estudo, o Nrf2 não foi significativamente regulado positivamente no tecido testicular de camundongos após a irradiação. Notavelmente, o Nrf2 foi significativamente ativado em camundongos tratados com SFN. Assim, hipotetizamos que a regulação positiva e ativação do Nrf2 nos testículos com o tratamento com SFN após a radiação é uma resposta importante na tentativa de superar o estresse oxidativo induzido pela radiação. Isso sugere que direcionar a ativação do Nrf2 é promissor como uma medida protetora viável contra a lesão testicular induzida por IR.
O SFN é um ativador do Nrf2 e demonstrou ativar o Nrf2 e a expressão de genes antioxidantes a jusante nos rins, pele e outros tecidos ou órgãos. Os resultados deste estudo mostraram que o SFN reduziu significativamente o aumento induzido por IR na produção de ROS, MDA e na expressão de 3-NT e 4-HNE, indicadores relacionados ao estresse oxidativo. Além disso, o SFN regulou positivamente a expressão de Nrf2 e seus fatores antioxidantes a jusante SOD1, NQO1 e HO-1, que neutralizam eficientemente as ROS e desintoxicam produtos químicos tóxicos e, portanto, inibem a ativação de NF-κB mediada por ROS. Os resultados sugerem que o SFN pode aliviar os danos testiculares induzidos por irradiação ao ativar os sinais antioxidantes do Nrf2 e inibir a resposta inflamatória do NF-κB.
Conclusão
Em conclusão, nossa identificação do SFN como um potente fármaco contra a radiação ionizante, que ativa as vias antioxidantes dependentes de Nrf2 e inibe a resposta inflamatória envolvendo NF-κB para proteger os testículos da lesão induzida por irradiação, revela oportunidades terapêuticas para terapias de lesão induzida por irradiação.
Declaração de divulgação
Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelo(s) autor(es).
Declaração de disponibilidade de dados
Os dados que suportam as descobertas deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Referências
Pílula Wuzi Yanzong, uma fórmula polierbal chinesa, alivia danos testiculares em camundongos induzidos por radiação ionizante
Radiações e fertilidade masculina
Efeitos da radiação na fertilidade masculina
Função testicular e preservação da fertilidade em pacientes do sexo masculino com câncer
O tratamento antioxidante melhora a apoptose de células germinativas induzida por irradiação ionizante de alta dose em ratos
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Função das células de Leydig e radiação: Uma revisão da literatura
Proteção contra perda de células germinativas masculinas induzida por radiação pela esfingosina-1-fosfato
Regulação da autorrenovação de células-tronco espermatogoniais e da meiose de espermatócitos pela sinalização das células de Sertoli
Plzf é necessário em células germinativas masculinas adultas para a autorrenovação de células-tronco
Dmrt1 é necessário para a manutenção e reposição de células-tronco espermatogoniais de camundongos
Expressão diferencial de c-kit em espermatogônias tipo A indiferenciadas e em diferenciação de camundongos
Padrão de expressão de Ngn3 no testículo de cabra leiteira e sua função na promoção da meiose por regulação positiva de Stra8
Ciclos atípicos de ploidia, Spo11 e a evolução da meiose
O reparo de quebras de fita dupla de DNA exógeno promove a sinapse cromossômica em meiócitos de camundongos mutantes para SPO11 e é alterado na ausência de HORMAD1
Estimulado pelo gene 8 do ácido retinoico (Stra8) desempenha papéis importantes em muitos estágios da espermatogênese
Ovol2, um fator de transcrição com dedo de zinco, é dispensável para a espermatogênese em camundongos
SYCP2 de camundongo é necessário para a montagem do complexo sinaptonêmico e sinapse cromossômica durante a meiose masculina
Níveis elevados e padrões distintos de expressão de ciclinas do tipo A e suas quinases dependentes de ciclina associadas em tumores de células germinativas masculinas
Relação entre condensação da cromatina, integridade do DNA e qualidade dos espermatozoides ejaculados de homens inférteis
Morfologia espermática e condensação da cromatina antes e após o processamento do sêmen
A perda de Prm1 leva a protaminação defeituosa da cromatina, processamento prejudicado de PRM2, redução da motilidade espermática e subfertilidade em camundongos machos
Sinalização Nrf2:INrf2 (Keap1) no estresse oxidativo
A ativação do Nrf2 mediada pelo sulforafano previne lesão cutânea induzida por radiação ao inibir o dano ao DNA ativado pelo estresse oxidativo e o inflamassoma NLRP3
O sulforafano previne a cardiomiopatia induzida por angiotensina II através da ativação do Nrf2 por estimulação da via Akt/GSK-3ß/Fyn