pmid: "32549980"
title: "Os papéis protetores dos extratos de óleo de melaleuca em células epiteliais mamárias bovinas e leucócitos polimorfonucleares."
authors: "Zhan K, Yang T, Feng B, Zhu X, Chen Y, Huo Y, Zhao G"
journal: "Journal of animal science and biotechnology"
pubdate: "2020"
doi: "10.1186/s40104-020-00468-9"
source: "PMC Full Text"

Os papéis protetores dos extratos de óleo de melaleuca em células epiteliais mamárias bovinas e leucócitos polimorfonucleares.

Autores

Zhan K, Yang T, Feng B, Zhu X, Chen Y, Huo Y, Zhao G

Periodico

Journal of animal science and biotechnology (2020)

Conteudo

Os papéis protetores dos extratos de óleo de melaleuca em células epiteliais mamárias bovinas e leucócitos polimorfonucleares

Contexto
O óleo de melaleuca (TTO) desempenha um papel importante na atividade antibacteriana e na atenuação das respostas inflamatórias. O epitélio mamário bovino e os leucócitos polimorfonucleares (PMNL) podem responder ativamente à infecção por mastite bovina. No entanto, os efeitos reguladores dos extratos de TTO na resposta imune inata das células epiteliais mamárias bovinas (BMECs) e dos PMNL ainda não foram relatados. Portanto, o objetivo do estudo foi avaliar os efeitos dos extratos de TTO nos níveis de mRNA dos genes envolvidos na resposta imune inata das BMECs e dos PMNL.

Resultados
Nossos resultados demonstraram que a adição de 0,025% e 0,05% de TTO aumentou a proliferação das BMECs e melhorou significativamente (P < 0,05) a viabilidade das BMECs expostas ao Staphylococcus aureus (S. aureus). Um efeito inibitório foi observado contra o crescimento de S. aureus pela incubação com TTO. O TTO a 0,05% reduziu a formação de biofilme de S. aureus, a associação e invasão de S. aureus às BMECs, e alterou as características morfológicas e estruturais de S. aureus. As citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α foram diminuídas (P < 0,001) pela incubação com TTO. Curiosamente, a expressão de IL-8, conhecida pela função quimiotática dos PMNL, foi elevada (P < 0,05) pelo tratamento com TTO a 0,05%. Consistentemente, o TTO a 0,05% aumentou a migração de PMNL nas BMECs expostas a S. aureus quando comparado ao tratamento apenas com S. aureus (P < 0,05). Além disso, os PMNL incubados com TTO a 0,05% diminuíram os níveis do inibidor alfa do NFKB (NFKBIA) e do TNF-α.

Conclusões
Nossos resultados indicam que o uso de TTO pode aliviar a resposta pró-inflamatória das BMECs causada por S. aureus e promover a migração de PMNL para montar as respostas imunes inatas, e pode ser uma nova estratégia para o tratamento da mastite bovina causada por S. aureus.

Introdução
A mastite bovina, uma inflamação da glândula mamária, é uma doença infecciosa grave envolvida na infecção por um patógeno, como Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli e Streptococcus, e resulta em diminuição da qualidade do leite e perdas econômicas. A mastite bovina é dividida em mastite clínica e subclínica. A mastite clínica é facilmente observada e detectada por secreções anormais do leite, enquanto a mastite subclínica é assintomática e difícil de ser observada, sendo diagnosticada pelo reservatório de infecção do patógeno no leite. Investigação recente mostrou que S. aureus é uma das principais causas de mastite subclínica contagiosa bovina. No entanto, o surgimento de cepas de S. aureus resistentes a antibióticos, conhecidas como S. aureus resistente à meticilina (MRSA), é um grave risco à saúde em todo o mundo, e infecções por MRSA foram observadas em casos de mastite bovina.
Alguns antibióticos para curar a mastite bovina clínica têm sido amplamente utilizados em estudos anteriores. No entanto, muitas preocupações dos consumidores sobre o desenvolvimento de resistência a agentes antibióticos são motivo de preocupação em alguns países em desenvolvimento. Além disso, os antibióticos para tratar a mastite bovina desencadeada por S. aureus têm baixa eficácia devido a uma baixa taxa de cura na mastite clínica. Importante, o tratamento da mastite bovina com antibióticos é preocupante para a saúde humana devido à presença de resíduos desses antibióticos no leite. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas alternativas que tanto inibam o patógeno quanto tenham a capacidade de montar a resposta imune inata para matar o patógeno é uma necessidade urgente para melhorar a qualidade do leite e a saúde humana.
Muitos extratos de plantas e óleos essenciais derivados de algumas plantas contêm metabólitos secundários que apresentam propriedades de atividade antibacteriana. O óleo da árvore do chá (TTO), um óleo essencial extraído das folhas de Melaleuca alternifolia (M. alternifolia), desempenha um papel importante na atividade antibacteriana e nas propriedades anti-inflamatórias. O extrato de TTO das folhas de M. alternifolia contém terpinen-4-ol, γ-terpineno, α-terpineno, 1,8-cineol e α-terpineol. A atividade antibacteriana do TTO depende principalmente de sua capacidade de resultar em aumento da permeabilidade da membrana, e também interrompe as estruturas e funções da membrana celular bacteriana. Além disso, estudos anteriores investigaram que as respostas imunes inatas desempenham um papel importante na resistência ao patógeno e na melhora das células somáticas no leite. Durante a mastite bovina, o recrutamento de PMNL do sangue circulante para a glândula mamária para montar as respostas imunes inatas é crítico para aliviar a resposta inflamatória das células epiteliais mamárias bovinas (BMECs) e a resolução da mastite. No entanto, até onde sabemos, nenhum estudo investigou os efeitos do TTO na resposta imune inata das BMECs e na função dos PMNL. Nossa hipótese é que o TTO pode aliviar as respostas pró-inflamatórias das BMECs expostas ao S. aureus e montar as respostas imunes inatas das BMECs e dos PMNL.
Portanto, os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos dos extratos de TTO na expressão de genes envolvidos na resposta inflamatória das BMECs expostas ao S. aureus, na resposta imune inata das BMECs e dos PMNL, e na capacidade quimiotática dos PMNL.
Materiais e métodos
Preparação dos extratos de óleo da árvore do chá
O produto preliminar de óleo essencial de melaleuca foi obtido da True Blue Organics (Nova Zelândia). A extração do TTO foi realizada pela Wuxi Chenfang Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Jiangsu, China). O produto preliminar do óleo foi carregado em um destilador de reação. Em seguida, o nitrogênio foi adicionado ao destilador de reação. Além disso, o destilador de reação manteve continuamente a pressão de 0,2 kg/cm² a 1 kg/cm² a 30–45 °C, 45–70 °C e 70–85 °C por 1 h, respectivamente. A bomba de óleo foi operada para manter os óleos essenciais de melaleuca circulando no destilador de reação. Eventualmente, a água de resfriamento foi usada para resfriar os tubos à temperatura ambiente. O compressor de ar e o nitrogênio foram desligados, interrompendo a circulação dos óleos essenciais. Os extratos de TTO foram separados usando um cromatógrafo a gás 9790 equipado com um detector de ionização de chama. As amostras foram injetadas através do porta de injeção split (50:1) em uma coluna de 35% difenil-65% metilsiloxano polímero de 60 m × 0,25 mm com um filme de 0,25 μm. A temperatura do forno foi inicialmente de 50 °C por 1 min, e então aumentada a 10 °C/min até 250 °C e mantida por 9 min. As temperaturas do injetor e do detector foram mantidas a 200 °C e 300 °C, respectivamente.

Animais
Este estudo foi realizado de acordo com os princípios da Universidade de Yangzhou, do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (SYXK (Su) IACUC 2012–0029). Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais vivos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. Seis vacas Holstein em lactação média foram utilizadas neste estudo. Todas as vacas estavam livres de sinais clínicos de doença antes do isolamento de leucócitos polimorfonucleares (PMNL). Essas vacas foram alimentadas com uma dieta TMR para atender 100% das exigências do NRC. As vacas foram ordenhadas três vezes ao dia, às 8:00, 14:00 e 21:00, respectivamente. O sangue (aproximadamente 10 mL) foi coletado por punção venosa da veia jugular em anticoagulante citrato dextrose ácido (ACD-A) (Solarbio, Xangai, China) de cada vaca antes da alimentação matinal. Esses tubos foram levemente invertidos para misturar e colocados no gelo. As amostras de sangue foram imediatamente transportadas para o laboratório e processadas dentro de 30 min após a coleta.

Cultura de células
Células epiteliais mamárias bovinas (BMECs) de três vacas Holstein em lactação média foram obtidas do Instituto de Coleção e Aplicação de Culturas Animais, Universidade de Yangzhou. Esses tecidos mamários bovinos foram digeridos por colagenase tipo I (Invitrogen, Xangai, China) por 3 h, e as células foram filtradas por malha de nylon (75 μm) para obter as BMECs. As BMECs foram semeadas em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 4 mm/L de glutamina, 1× insulina, transferrina, selenito de sódio (10 μg/mL de insulina, 5,5 μg/mL de transferrina, 0,0067 μg/mL de selenito de sódio, Invitrogen, Xangai, China), 15 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (Peprotech, Xangai, China), 1 μg/mL de hidrocortisona e 4 μg/mL de prolactina (Sigma-Aldrich, Xangai, China).

Isolamento de PMNL
Os PMNL foram isolados e obtidos conforme descrito anteriormente, com pequenas adaptações. Seis vacas Holandesas em lactação média foram utilizadas para isolar os PMNL. O sangue venoso foi transferido para tubos estéreis de 15 mL contendo 2,2 mL de ACD-A, invertido suavemente para misturar e colocado em gelo. Esses tubos foram centrifugados a 1000×g a 4 °C por 20 min, e o plasma, a camada leucocitária e um terço das hemácias foram removidos. As células restantes foram transferidas para tubos estéreis de 50 mL e tratadas com 18 mL de água deionizada gelada, permitindo que os tubos fossem invertidos suavemente por no máximo 45 s. Em seguida, 2 mL de solução de PBS 10× foram adicionados aos tubos para restaurar as condições de isotonicidade, e centrifugados a 1000×g a 4 °C por 10 min para remover o sobrenadante. O pellet foi ressuspenso e lavado com 20 mL de solução HBSS livre de cálcio e magnésio e centrifugado a 850×g a 4 °C por 5 min. Finalmente, os PMNL isolados foram cultivados com meio RPMI-1640 suplementado com 5% de SBF inativado e 4 mmol/L de glutamina.

Cepa bacteriana e cultura
Staphylococcus aureus (ACTT29213) foi obtido da American Type Culture Collection. Esta cepa é isolada da mastite bovina. O S. aureus foi cultivado em meio infusão cérebro-coração (LandBridge, Pequim, China) a 37 °C e cultivado por 12–18 h antes do uso.

Ensaio de atividade proliferativa
Os efeitos proliferativos do TTO sobre as BMECs foram determinados utilizando o kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Xangai, China), de acordo com o protocolo do fabricante. As BMECs (5 × 10³ células/poço) foram semeadas em placas de 96 poços. Após 12 h, as BMECs foram incubadas em meio DMEM/F12 com 0,1% de DMSO e 0, 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 4) por 6 h. Subsequentemente, 10 μL de reagente CCK-8 foram adicionados às células, seguido de incubação a 37 °C, 5% CO2 por 2 h. A absorbância a 450 nm foi então medida em cada poço usando um leitor automático de microplacas (Thermo Scientific, Xangai, China).

Ensaio de viabilidade celular
As BMECs foram semeadas em placas de 96 poços (5 × 10³ células/poço), e S. aureus (5 × 10³ UFC/poço) foi adicionado após 12 h. As células foram então cultivadas em meio DMEM/F12 na ausência de S. aureus e TTO (grupo controle), na presença de S. aureus e ausência de TTO (grupo S. aureus), e na presença de S. aureus e 0, 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (grupos tratados com TTO) por 6 h (n = 4). Após a incubação, as células foram vigorosamente lavadas cinco vezes com 200 μL de água estéril e incubadas com 200 μL de DMEM/F12 suplementado com 10 μL de CCK-8 a 37 °C e 5% CO2 por 2 h. A absorbância a 450 nm foi então medida em cada poço usando um leitor automático de microplacas. Viabilidade celular (%) = (DO tratamento – DO branco) / (DO controle – DO branco).

Ensaio de crescimento de S. aureus
S. aureus foram semeados em placas de 96 poços (1 × 10⁵ UFC/poço) em meio BHI suplementado com TTO nas concentrações de 0, 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 3) a 37 °C, 5% CO2 por 3, 6, 12 ou 24 h, respectivamente. Isso foi diluído em série e plaqueado em ágar nutriente BHI sólido. O número de S. aureus foi determinado pela contagem de colônias após 12 h de cultura a 37 °C.
Ensaio de formação de biofilme de S. aureus
A formação de biofilme foi avaliada conforme descrito anteriormente. Resumidamente, S. aureus foram semeados em placas de 96 poços (2 × 10⁶ UFC/poço) e incubados a 37 °C, 5% CO2 por 24 h. Os sobrenadantes foram então removidos, meio BHI suplementado com 0 (grupo controle), 0,00625%, 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 4) adicionado, e as placas envolvidas com Parafilm e incubadas a 37 °C, 5% CO2 por 36 h. Em seguida, as placas foram lavadas cinco vezes com água destilada estéril, e S. aureus fixados com 100 μL de álcool metílico por 15 min, e o sobrenadante removido. As placas foram secas naturalmente à temperatura ambiente e, em seguida, tratadas com 200 μL de violeta cristal a 0,1% à temperatura ambiente por 10 a 15 min. As placas foram então lavadas cinco vezes, secas ao ar durante a noite, e 30% de ácido acético em água destilada estéril (200 μL) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas com agitação por 1 h, e a solução em cada poço transferida para uma nova placa de 96 poços. Para examinar a formação de biofilme de S. aureus, a absorbância a 540 nm foi medida usando um leitor automático de microplacas.
Ensaio de associação e invasão de S. aureus
Para determinar o número de associação de S. aureus às BMECs e invasão de S. aureus nas BMECs em diferentes concentrações de TTO, seguimos um método descrito anteriormente. BMECs cultivadas em placas de 24 poços foram infectadas usando meio DMEM/F12 contendo S. aureus (1 × 10⁵ UFC/poço) com MOI de 1, e tratadas com 0 (grupo controle), 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 3) a 37 °C, 5% CO2 por 3 h. As células foram então lavadas cinco vezes com PBS estéril e tratadas com Triton X-100 a 0,1%, e incubadas por 15 min a 37 °C, 5% CO2. A associação de S. aureus às BMECs foi então diluída em série e plaqueada em ágar nutriente BHI sólido para contagem de colônias. Para a análise da invasão de S. aureus nas BMECs, as BMECs foram tratadas com 250 μg/mL de gentamicina a 37 °C, 5% CO2 por 1 h, depois lavadas cinco vezes com PBS para remover a gentamicina. As células foram lisadas com Triton X-100 a 0,5% por 15 min. As bactérias vivas restantes foram então diluídas em série, semeadas em placas de ágar BHI sólido, e as UFCs contadas.
Microscópio eletrônico de varredura
S. aureus (4 × 10⁵ UFC/poço) foram semeados em lâminas de câmara de vidro de 8 poços em meio BHI, e incubados por 6 h a 37 °C, 5% CO₂. Em seguida, S. aureus foram lavados três vezes com 200 μL de PBS estéril, e incubados com 0,05% de TTO por 6 h a 37 °C, 5% CO₂. S. aureus sem tratamento com TTO foram usados como controle. Em seguida, S. aureus foram lavados três vezes com 200 μL de PBS estéril e fixados com 200 μL de glutaraldeído a 2,5% a 4 °C durante a noite. Então, S. aureus foram lavados três vezes com 200 μL de PBS estéril, e desidratados sucessivamente com álcool etílico a 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, e álcool etílico 100% com Na₂SO₄ por 15 min. Essas lâminas foram secas por secador automático de ponto crítico (EM CPD-300, Leica, Alemanha), e a superfície dessas lâminas foi banhada a ouro por evaporador turbo de alto vácuo (EM SCD500, Leica, Alemanha). As amostras de S. aureus foram observadas por MEV (Gemini SEM 300, Carl Zeiss, Alemanha).

Ensaio de quimiotaxia de PMNL
As BMECs foram semeadas em placas de 6 poços (2,5 × 10⁵ células/poço). Após 12 h, o sobrenadante foi removido e as células lavadas três vezes com PBS. As BMECs foram então incubadas em meio RPMI-1640 (como grupo controle), na presença de 0,05% de TTO e ausência de S. aureus (grupo tratado com TTO), na presença de S. aureus e ausência de TTO (grupo tratado com S. aureus), ou na presença de S. aureus e 0,05% de TTO (grupos tratados com TTO e S. aureus) por 6 h (n = 3). Em seguida, os sobrenadantes foram filtrados através de filtros estéreis de 0,22 μm para coletar o meio contendo altos níveis do quimioatraente, IL-8. Em seguida, 500 μL de meio contendo IL-8 foram adicionados aos poços inferiores de placas de 24 poços. As câmaras (tamanho do poro, 5,0 μm; diâmetro, 6,5 mm; Corning) foram colocadas no topo dos poços, e 100 μL de suspensão de PMNL (5 × 10⁵ células/câmara) foram semeadas nas câmaras. Todas as amostras foram incubadas a 37 °C, 5% CO₂ por 2 h. Posteriormente, as câmaras foram enxaguadas vigorosamente três vezes com 100 μL de CMF-HBSS, e o número de PMNL que migraram para os poços inferiores foi determinado. Para o efeito do TTO na quimiotaxia de PMNL, os PMNL foram semeados em placas de 12 poços (6 × 10⁶ células/poço) e pré-tratados com meio RPMI-1640 contendo 0,05% de TTO (n = 5) por 2 h a 37 °C, 5% CO₂. Em seguida, 600 μL de meio contendo uma concentração final de 100 ng/mL de IL-8 (Peprotech) foram adicionados aos poços inferiores de placas de 24 poços. As câmaras (tamanho do poro, 5,0 μm; diâmetro, 6,5 mm) foram colocadas no topo dos poços, e 100 μL de suspensão de PMNL (6 × 10⁵ células/câmara) foram semeadas nas câmaras. Todas as amostras foram incubadas a 37 °C, 5% CO₂ por 2 h. Posteriormente, as câmaras foram enxaguadas vigorosamente três vezes com 100 μL de CMF-HBSS, e o número de PMNL que migraram para os poços inferiores foi determinado.

RT-PCR quantitativo
Para a expressão de genes envolvidos na resposta inflamatória de BMECs expostas ao S. aureus, BMECs (2 × 105 células/poço) foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas a 37 °C, 5% CO2. As células foram divididas em quatro grupos experimentais da seguinte forma: 1) Controle, meio DMEM/F12; 2) Tratamento com TTO, meio DMEM/F12 contendo 0,05% TTO; 3) Tratamento com S. aureus, meio DMEM/F12 suplementado com S. aureus; 4) Tratamento com S. aureus e 0,05% TTO, meio DMEM/F12 suplementado com ambos S. aureus e 0,05% TTO. Todos os tratamentos foram incubados por 6 h.
Seis vacas Holstein em lactação média foram selecionadas para isolar os PMNL para a expressão de genes envolvidos na resposta inflamatória de PMNL expostos ao TTO. PMNL (1,3 × 106 células/poço) foram semeados em placas de 24 poços e tratados com 0% TTO ou 0,05% TTO por 2 h (n = 6).
Iniciadores para análises de PCR em tempo reala
Gene Sequência do iniciador (5′ para 3′) Número de acesso Tamanho, pb GAPDH F:GGGTCATCATCTCTGCACCT NM_001034034 176 R:GGTCATAAGTCCCTCCACGA IL-6 F:TCCTTGCTGCTTTCACACTC NM_173923.2 129 R:CACCCCAGGCAGACTACTTC IL-1β F:CAGTGCCTACGCACATGTCT NM_174093.1 209 R:AGAGGAGGTGGAGAGCCTTC TNF-α F:GCCCTCTGGTTCAGACACTC NM_173966.3 192 R:AGATGAGGTAAAGCCCGTCA TLR-2 F:CAGGCTTCTTCTCTGTCTTGT NM_174197.2 140 R:CTGTTGCCGACATAGGTGATA IL-8 F:TGGGCCACACTGTGAAAAT NM_173925.2 136 R:TCATGGATCTTGCTTCTCAGC κ-caseína F: CCAGGAGCAAAACCAAGAAC NM_174294.2 148 R: TGCAACTGGTTTCTGTTGGT IL-10 F:TGTATCCACTTGCCAACCAG NM_174088.1 126 R:CAGCAGAGACTGGGTCAACA L-selectina F:CTCTGCTACACAGCTTCTTGTAAACC NM_174182.1 104 R:CCGTAGTACCCCAAATCACAGTT IRAK1 F: CCTCAGCGACTGGACATCCT NM_001040555.1 103 R:GGACGTTGGAACTCTTGACATCT NFKBIA F:GGGAGACCTGGCCTTCCTC NM 001045868.1 101 R:CCAGAAGTGCCTCAGCGATT TRAF6 F:AGAACAGATGCCCAATCACTATGAT NM_001034661.2 100 R:GTGATTCCTCTGCATCTTTTCATG Lisozima F:GAGAGATGTGAGCTTGCCAGAA NM_001078159.1 120 R:TGTAGCTTGTGTGTTGTAATTGCTTTC SOD2 F:GAGAAGGGTGATGTTACAGCTCAGA NM_201527.2 100 R:GGCTCAGATTTGTCCAGAAGATG TLR-4 F:GACCCTTGCGTACAGGTTGT NM_174198.6 103 R:GGTCCAGCATCTTGGTTGAT β-actina F:GACCCAGATCATGTTCGAGA NM_173979.3 145 R:CTCATAGATGGGCACCGTGT
aAbreviaturas: GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, IRAK1 Quinase 1 associada ao receptor de interleucina 1, NFKBIA Inibidor alfa do NFKB, TRAF6 Fator 6 associado ao receptor de TNF, SOD2 Superóxido dismutase 2, TLR-2 Receptor do tipo Toll 2, TLR-4 Receptor do tipo Toll 4, F Direto; R Reverso
Após a incubação, o RNA total foi isolado das células cultivadas usando um kit TRIzol (Tiangen, Pequim, China). A transcrição reversa (RT) foi realizada usando um kit RT (Takara, Pequim, China). As misturas da reação de RT continham 1 μg de RNA total e 1 × PrimeScript RT Master Mix em um volume final de 20 μL, e as reações foram realizadas por 15 min a 37 °C. A transcriptase reversa foi inativada por aquecimento a 85 °C por 5 s. Os ensaios de qRT-PCR foram realizados usando o kit SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara). A mistura da reação de qRT-PCR continha 1 × SYBR® Premix Ex Taq™ II, 0,4 μmol/L de cada primer direto e reverso e 100 ng de cDNA molde em um volume final de 20 μL, e as reações foram realizadas da seguinte forma: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos a 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s. Antes da qRT-PCR das amostras, as eficiências de amplificação de todos os primers foram determinadas usando séries de diluição padrão. Os primers listados na Tabela 1 são de estudos anteriores. A eficiência desses primers foi determinada nos dois estudos. A expressão relativa dos genes alvo foi normalizada pela média geométrica dos 2 genes de referência selecionados, GAPDH e β-actina, e calculada usando o método 2−ΔΔCT.

Análise estatística
Antes da análise dos dados, a distribuição de normalidade e homogeneidade das variâncias foram estudadas com um teste de Kolmogorov-Smirnov e Levene, respectivamente. Se os dados apresentassem distribuição de normalidade e homogeneidade das variâncias iguais, a análise estatística foi avaliada por análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pela determinação da diferença mínima significativa (DMS) para comparações post-hoc múltiplas das médias dos tratamentos e testada pelo teste t de amostras independentes, usando o software SPSS 19.0 (SPSS Inc.; Chicago, IL, EUA). Caso contrário, um teste de Kruskal-Wallis foi realizado usando o teste não paramétrico para análise estatística. A expressão gênica para os ensaios de 2−ΔΔCt e viabilidade celular foram transformados em log10 para análise estatística. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

Resultados
Composição fitoquímica dos extratos de TTO
A análise do componente principal dos extratos de TTO. Cromatograma representativo com os picos dos componentes principais identificados
A composição fitoquímica do produto preliminar de óleo essencial de melaleuca tratado por variação de pressão e temperatura em reator ainda mostrou a presença de terpinen-4-ol, α-terpineno, α-terpineol, α-pineno, p-cimeno, 1,8-cineol, γ-terpineno, terpinoleno e pinocarveol (Fig. 1). De acordo com a Norma Neozelandesa, a concentração de terpinen-4-ol constitui 30–48% do total de componentes eficazes no produto preliminar de óleo essencial de melaleuca. Notavelmente, o teor de terpinen-4-ol aumentou para 60,23% após o produto preliminar ser tratado por variação de pressão e temperatura em reator. Além disso, os extratos de TTO (óleo essencial de melaleuca) apresentam menos de 0,05% de p-cimeno, que é prejudicial para humanos e animais, em comparação com o p-cimeno (1,7%) na Norma Neozelandesa. Adicionalmente, α-pineno, α-terpineno, γ-terpineno diminuíram aproximadamente 4, 8 e 3 vezes, respectivamente, em relação ao α-pineno (2,1%), α-terpineno (3%) e γ-terpineno (17,8%) na Norma Neozelandesa.
Avaliação dos efeitos proliferativos do TTO em células epiteliais mamárias bovinas (BMECs)
Os efeitos protetores do TTO em células epiteliais mamárias bovinas (BMECs). (a) Avaliação dos efeitos proliferativos do TTO em BMECs. As BMECs foram incubadas com 0 (grupo controle), 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO por 6 horas. (b) Viabilidade de BMECs expostas a S. aureus com ou sem tratamento com TTO. As BMECs foram cultivadas na ausência de S. aureus e TTO (grupo controle), na presença de S. aureus e ausência de TTO (grupo S. aureus), e na presença de S. aureus e 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (grupos tratados com TTO) por 6 horas. Os dados são apresentados como médias ± EPM (n = 4). Médias em diferentes concentrações de TTO com letras diferentes (a-d) diferem significativamente quanto ao efeito do tratamento.
A relação entre a concentração de TTO e seu efeito proliferativo em BMECs foi examinada pelo ensaio CCK-8. Conforme mostrado na Fig. 2, os resultados dos ensaios proliferativos demonstraram que as concentrações de 0,025% (P = 0,02) e 0,05% (P = 0,02) de TTO foram capazes de aumentar a proliferação de BMECs, em comparação com o grupo controle não tratado (Fig. 2a). Em contraste, 0,1% de TTO inibiu significativamente a viabilidade das BMECs, em relação às concentrações de 0,025% e 0,05% (Fig. 2a). Em comparação com os controles, as BMECs expostas a S. aureus apresentaram (P < 0,001) viabilidade reduzida, enquanto 0,0125% (P = 0,002), 0,025% (P = 0,015) e 0,05% (P = 0,01) de TTO aumentaram a viabilidade das BMECs expostas a S. aureus, em relação ao tratamento apenas com S. aureus (Fig. 2b). No entanto, a viabilidade das BMECs expostas a S. aureus foi inibida na concentração de 0,1% de TTO (Fig. 2b). Os resultados atuais demonstram que a adição de 0,0125%, 0,025% e 0,05% de TTO in vitro pode promover a viabilidade de BMECs expostas a S. aureus.
Atividade antibacteriana
Avaliação do efeito antibacteriano do TTO. (a) Inibição do crescimento de S. aureus durante tratamento de 24 h com 0, 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 3). Log UFC de bactérias foi medido após 3 h, 6 h, 12 h e 24 h. Médias no mesmo ponto de tempo com letras diferentes (a, b) diferem significativamente quanto ao efeito do tratamento. (b) Formação de biofilme. As culturas de S. aureus foram incubadas com 0 (grupo controle), 0,00625%, 0,0125%, 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 6) e a absorbância a 540 nm foi medida. (c) Associação às BMECs. As BMECs foram incubadas em meio DMEM/F12 contendo S. aureus e 0 (grupo controle), 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 3). (d) Invasão das BMECs. As BMECs foram incubadas em meio DMEM/F12 contendo S. aureus e 0 (grupo controle), 0,025%, 0,05% ou 0,1% de TTO (n = 3). Os dados são apresentados como médias ± EPM. Médias nas diferentes concentrações de TTO com letras diferentes (a-c) diferem significativamente quanto ao efeito do tratamento.
Microscopia eletrônica de varredura para avaliar o estado morfológico de S. aureus com TTO. S. aureus foram incubados com 0 (controle) ou 0,05% de óleo de melaleuca (TTO) por 6 h in vitro. Pontas de seta brancas indicam S. aureus apresentando estado morfológico afundado.
O crescimento de S. aureus foi reduzido na maioria das concentrações de TTO e pontos de tempo (Fig. 3a). S. aureus tratados com extratos de TTO apresentaram crescimento lento durante a incubação de 3 e 6 h (Fig. 3a). Além disso, também avaliamos o efeito do TTO na formação de biofilme de S. aureus no presente estudo. Nossos dados mostraram que, nas concentrações de 0,025%, 0,05% e 0,1%, o TTO não conseguiu formar um biofilme de S. aureus em comparação com os controles (Fig. 3b). Subsequentemente, também investigamos o efeito do TTO na associação de S. aureus às BMECs e na invasão de S. aureus nas BMECs. O presente estudo mostrou que a associação de S. aureus às BMECs e a invasão de S. aureus nas BMECs foram significativamente reduzidas pelo tratamento com 0,05% e 0,1% de TTO, em comparação com o grupo controle (Fig. 3c e d). Para validar se a adição de TTO causa uma alteração profunda no estado morfológico e na estrutura de S. aureus, observamos o estado morfológico de S. aureus por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O S. aureus mantém o estado morfológico e a estrutura intactos na superfície celular na ausência do tratamento com TTO, enquanto o tratamento com TTO mostrou uma alteração profunda na superfície celular, e a superfície de S. aureus tornou-se afundada (Fig. 4). Esses resultados demonstraram que o TTO pode reduzir o crescimento de S. aureus e a formação de biofilme, e também previne a invasão de S. aureus nas BMECs, auxiliando os agentes antimicrobianos a curar infecções persistentes e crônicas.
Efeito do TTO na resposta imune inata dos PMNL
Expressão de genes em PMNL incubados com 0 (controle) ou 0,05% de óleo de melaleuca (TTO) in vitro
Símbolo Tratamento1 EPM  Valor-P  Controle TTO IL-1β 1,43 0,86 0,23 0,38 IL-6 1,19 1,38 0,22 0,81 IL-8 1,21 1,25 0,18 0,93 IL-10 1,24a 0,16b 0,18 0,001 TNF-α 1,14a 0,42b 0,46 0,02 TLR-2 1,49 0,41 0,47 0,05 TLR-4 1,25 0,94 0,13 0,49 L-seletina 1,07 1,13 0,11 0,88 IRAKI 1,05 0,83 0,12 0,24 NFKBIA 1,05a 0,52b 0,13 0,02 TRAF-6 1,04 0,93 0,09 0,51 Lisozima 1,30 0,74 0,21 0,23 SOD2 1,16 0,67 0,20 0,14
a, b Médias na mesma linha com sobrescritos diferentes diferem significativamente para o efeito do tratamento
1PMNL de seis vacas Holandesas em lactação média foram incubadas em meio DMEM/F12 na ausência de TTO (grupo controle) ou na presença de 0,05% de TTO (n = 6)
Número de PMNL migradas em resposta à quimiocina IL-8 após as PMNL terem sido pré-tratadas com 0 (controle) ou 0,05% de TTO por 2 h in vitro. Os dados são apresentados como médias ± EPM (n = 5)
Os níveis de mRNA dos genes que codificam as citocinas, fatores de sinalização, receptor de reconhecimento e elementos de resposta a patógenos foram determinados por qRT-PCR (Tabela 2). Comparado com o grupo controle não tratado, as PMNL tratadas com 0,05% de TTO não apresentaram alterações profundas (P > 0,05) na expressão de IL-1β, IL-6 e IL-8. Além disso, a capacidade quimiotática das PMNL pela indução de IL-8 não foi alterada (P = 0,098) após o pré-tratamento das PMNL com 0,05% de TTO (Fig. 5). Notavelmente, IL-10 (P = 0,001) e TNF-α (P = 0,02) foram significativamente atenuados nas PMNL incubadas com 0,05% de TTO. Para molécula de adesão e receptor de reconhecimento de padrão, a expressão de TLR-2, TLR-4 e L-selectina não foi alterada (P > 0,05) pelo tratamento com TTO. Para esses genes envolvidos na via de sinalização do NF-κB, a expressão da quinase 1 associada ao receptor de interleucina 1 (IRAKI) não foi alterada após o pré-tratamento das PMNL com TTO. Notavelmente, o inibidor alfa do NFKB (NFKBIA) foi significativamente atenuado (P = 0,02) nas PMNL incubadas com TTO. Para genes relacionados à morte de patógenos, a expressão de lisozima não foi afetada pela incubação das PMNL com TTO.
Efeito do TTO na resposta imune inata das BMECs expostas ao S. aureus
Expressão gênica em BMECs incubadas com 0 (controle) ou 0,05% de óleo de melaleuca (TTO) ou S. aureus ou S. aureus com 0,05% de TTO in vitro
Símbolo Tratamento1 Valor-P Controle TTO S. aureus S. aureus com TTO EPM A B A×B TLR-2 1,00 0,46 1,80 0,52 0,25 0,02 0,22 0,28 TLR-4 1,00 0,83 0,61 0,64 0,26 0,63 0,06 0,49 IL-1β 1,00 0,39 1,25 0,59 0,37 < 0,001 0,02 0,75 IL-6 1,00 0,22 1,18 0,59 0,41 < 0,001 0,008 0,25 TNF-α 1,01 0,08 0,97 0,14 0,47 < 0,001 0,91 0,51 IL-8 1,00 3,69 1,97 3,57 1,26 < 0,001 0,20 0,12 κ-caseína 1,00 1,48 1,24 1,06 0,25 0,22 0,42 0,02
1As BMECs foram cultivadas em meio DMEM/F12 na ausência de S. aureus e TTO (grupo controle), ou na ausência de S. aureus e presença de 0,05% de TTO, ou na presença de S. aureus e ausência de TTO, ou na presença de S. aureus e 0,05% de TTO (n = 3). A, tratamento com TTO; B, tratamento com S. aureus
Número de PMNL migrados em resposta a altos níveis da quimiocina IL-8 após BMECs serem incubadas com 0% TTO (grupo controle), 0,05% TTO, na presença de S. aureus e ausência de TTO, ou na presença de S. aureus e 0,05% TTO in vitro. Os sobrenadantes do meio foram de BMECs com diferentes tratamentos e adicionados aos poços inferiores de placas de 24 poços. As câmaras foram colocadas no topo dos poços, e 100 μL de suspensão de PMNL (5 × 10⁵ células/câmara) foram semeadas nas câmaras. Os dados são apresentados como médias ± EPM (n = 3). Médias nos diferentes tratamentos com letras diferentes (a-c) diferem significativamente para o efeito do tratamento.

Os resultados do desempenho da PCR quantitativa relacionados à resposta inflamatória das BMECs são mostrados na Tabela 3. As citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α foram significativamente reguladas negativamente (P < 0,001) pela incubação com TTO. Curiosamente, a adição de TTO aumentou (P < 0,001) a expressão de IL-8 nas BMECs, em relação ao controle não tratado. Notavelmente, o TTO melhorou a capacidade de migração de PMNL em BMECs expostas a S. aureus, em comparação com S. aureus sozinho (Fig. 6). Em comparação com o controle, o TLR-2 foi atenuado pela incubação com TTO (P = 0,02), mas o TLR-4 não foi afetado. Importante, o TTO não alterou a expressão de κ-caseína em BMECs desafiadas com S. aureus quando comparado ao tratamento apenas com S. aureus.
O epitélio mamário bovino é a primeira linha de defesa contra a invasão de bactérias patogênicas, e desempenha um papel vital na resposta imune inata para aliviar a gravidade das infecções. O epitélio mamário infectado com patógenos provoca a liberação de mediadores inflamatórios, montando as respostas imunes inatas para melhorar a resolução da infecção bacteriana patogênica.

No entanto, a resposta inflamatória do epitélio mamário causada pela infecção por S. aureus é geralmente lenta, e a infecção frequentemente se torna persistente. A adesão de S. aureus às células epiteliais mamárias é um passo inicial na patogênese. A adesão está associada à ligação não específica ou específica entre ligantes associados à célula bacteriana e receptores da superfície celular do hospedeiro, e há fortes evidências de que a invasão das células epiteliais mamárias pela bactéria está relacionada a um processo endocítico, permitindo a interação entre bactérias e células hospedeiras via proteínas de superfície.

Infecções persistentes e crônicas causadas por S. aureus são um problema sério devido à invasão de S. aureus nas BMECs, e apenas bactérias extracelulares são tratadas por agentes antimicrobianos, mas S. aureus dentro das células é protegido dos antimicrobianos. Além disso, a matriz do biofilme é uma mistura complexa de macromoléculas contendo exopolissacarídeos, proteínas e DNA que se ligam à superfície bacteriana. Os biofilmes de superfície são resistentes ao tratamento com antibióticos e atuam como barreira eficaz contra a resposta das células imunes, e respondem ativamente a algumas infecções persistentes e crônicas.

No presente estudo, a composição fitoquímica do extrato de TTO exibiu a presença de terpinen-4-ol, α-terpineno, α-terpineol, α-pineno, p-cimeno, e 1,8-cineol, γ-terpineno, terpinoleno e pinocarveol. Notavelmente, a concentração de terpinen-4-ol envolvida na atividade antibacteriana contém aproximadamente 60,23%. A composição fitoquímica do p-cimeno envolvida nos perigos para humanos e animais mostra concentração inferior a 0,05%. Esses resultados indicam que os extratos de TTO exibiram um papel positivo para as propriedades antibacterianas e são mais seguros para humanos e animais.

Até onde sabemos, nenhum estudo investigou o efeito do TTO na formação de biofilme de S. aureus, na associação de S. aureus às BMECs e na invasão de S. aureus nas BMECs. Portanto, o desenvolvimento de agentes alternativos e não tóxicos para a resolução da mastite bovina desencadeada por S. aureus é uma necessidade urgente para melhorar a qualidade do leite e a saúde humana.
O TTO tem um papel benéfico na atividade antibacteriana e nas propriedades anti-inflamatórias. Nossos resultados demonstraram que 0,025% e 0,05% de TTO foram capazes de aumentar a proliferação de BMECs. Estudos anteriores relataram que 10% de TTO é capaz de inibir a proliferação de células de melanoma e superar a resistência a múltiplos fármacos. Nossos resultados indicam que baixas concentrações de TTO não prejudicaram a função das BMECs e podem promover a resposta imune inata das BMECs para desempenhar um papel eficaz na resolução da mastite bovina. Notavelmente, 0,0125%, 0,025% e 0,05% de TTO aumentaram significativamente a viabilidade das BMECs expostas ao S. aureus, em comparação com o tratamento apenas com S. aureus, sugerindo que o TTO pode ser capaz de montar respostas imunes inatas para reduzir os danos causados pelo S. aureus às BMECs. Nesse processo, o TTO exerce um papel positivo ao reduzir os efeitos do S. aureus sobre as BMECs, mas não por moderar os efeitos das BMECs. Quanto à atividade antibacteriana, a adição de TTO diminui o crescimento de S. aureus e a formação de biofilme, indicando que o TTO tem um papel positivo na prevenção e controle da estratégia de formação de biofilme no contexto da mastite bovina causada por S. aureus. A associação de S. aureus às BMECs e a invasão de S. aureus nas BMECs foram significativamente reduzidas pelo tratamento com 0,05% e 0,1% de TTO, sugerindo que o TTO pode promover e ajudar os agentes antimicrobianos a curar as infecções persistentes e crônicas causadas por S. aureus. Durante a mastite bovina, a bactéria frequentemente ataca as células epiteliais mamárias e prejudica a função celular, que falha em resolver a resposta imune contra a infecção bacteriana, enquanto o TTO provavelmente desempenha um papel eficaz na mediação da resposta imune protetora das BMECs.
Durante a mastite bovina, os PMNL do sangue circulante foram recrutados ativamente para a glândula mamária infectada pelo patógeno para aliviar a resposta inflamatória e eliminar o patógeno, e, eventualmente, esses PMNL migraram para a glândula mamária, tornando-se as células somáticas predominantes no leite. Portanto, os PMNL desempenham um papel decisivo na resolução da mastite. O processo de recrutamento dos PMNL é controlado por quimioatraentes, como IL-8, ligante de motivo C-C, e quimiocinas de ligante de motivo C-X-C liberadas por células imunes residentes e células epiteliais mamárias. No presente estudo, a capacidade quimiotática dos PMNL induzida por IL-8 não foi alterada após o pré-tratamento dos PMNL com 0,05% de TTO. Durante a infecção bacteriana, os PMNL podem desencadear mudanças profundas nas moléculas de adesão para a resolução das bactérias patogênicas. A molécula de adesão semelhante a Toll e os receptores de reconhecimento de padrões podem ativar as vias de sinalização pró-inflamatórias NF-κB que respondem à ativação de IRAKI e TRAF-6, e induzem ainda o complexo IKK a desencadear a fosforilação de IκB e a liberação de NF-κB. Subsequentemente, o NF-κB se liga aos promotores de TNF-α, IL-6 e IL-1β, levando à sua elevação no nível transcricional. Até o momento, nenhum estudo investigou o efeito do TTO nas respostas imunes inatas dos PMNL. O TLR-2 e o TLR-4 reconhecem as bactérias gram-positivas e gram-negativas, respectivamente. Nossos resultados mostram que o nível de mRNA de TLR-4 não foi alterado após o pré-tratamento dos PMNL com TTO, mas o TLR-2 foi significativamente atenuado nos PMNL tratados com TTO. Estudo anterior demonstrou que o extrato de óleos essenciais de plantas não teve um efeito positivo contra as bactérias Gram-negativas. Portanto, o TTO modifica as respostas imunes inatas dos PMNL por uma atenuação no TLR-2, em vez de no TLR-4. Além disso, os PMNL tratados com 0,05% de TTO não apresentaram mudanças profundas na expressão de TRAF-6 e IRAKI. O NFKBIA, que codifica o gene IκBα, foi reduzido nos PMNL com 0,05% de TTO. Essa regulação negativa do NFKBIA provavelmente está envolvida em uma atenuação na expressão de NF-κB, porque é amplamente aceito que o NF-κB se liga ao promotor de genes para induzir sua transcrição, levando, em última análise, à diminuição geral no nível de mRNA de genes pró-inflamatórios. Consistentemente, nossos resultados também mostram evidências de que o TNF-α foi atenuado após o tratamento de PMNL com TTO, indicando que o TTO tem um papel positivo para aliviar a resposta inflamatória.
As BMECs desencadeiam a ativação de respostas imunes inatas e formam a primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos. Durante as infecções crônicas desencadeadas por S. aureus, a glândula mamária exerce ativamente a resposta imune protetora por meio de quimiocinas e moléculas de adesão induzidas pelas células epiteliais mamárias. A expressão do gene TLR-2 envolvido na resposta imune inata foi regulada negativamente pelo tratamento com TTO em BMECs desafiadas com S. aureus em comparação com S. aureus isoladamente, no entanto, o TLR-4 não foi afetado. Notavelmente, IL-1β, IL-6 e TNF-α foram atenuados pela incubação com 0,05% de TTO em BMECs expostas a S. aureus, em relação a S. aureus isoladamente, sugerindo que o TTO pode aliviar os efeitos pró-inflamatórios sobre BMECs expostas a S. aureus. Curiosamente, BMECs expostas a S. aureus com tratamento com TTO aumentaram a expressão de IL-8. Consistentemente, 0,05% de TTO aumentou a capacidade de migração de PMNL em BMECs expostas a S. aureus em comparação com S. aureus isoladamente e controle, pois aumentou a síntese de IL-8 conhecida pela função quimiotática de PMNL. Essa descoberta sugere que a migração de PMNL do sangue para as células mamárias foi elevada para promover a eliminação de S. aureus e a resolução da mastite bovina quando o tratamento com TTO induz a expressão de IL-8 na glândula mamária bovina infectada por S. aureus. Para avaliar a segurança dos extratos de TTO para aplicação in vivo em bovinos, a medição do nível de mRNA da caseína foi determinada para avaliar os efeitos citotóxicos do TTO em BMECs. Nosso resultado demonstrou que 0,05% de TTO não teve alteração profunda em todos os grupos experimentais. Além disso, a adição de TTO pode reduzir o crescimento de S. aureus, a formação de biofilme de S. aureus e a invasão de S. aureus em BMECs. Esses resultados indicam que o TTO pode ser benéfico para mastite profilática e anti-inflamatória e provavelmente é seguro para uso in vivo em bovinos.
Conclusões
O presente estudo indica que as concentrações de 0,025% e 0,05% de TTO aumentaram a proliferação de BMECs e melhoraram a viabilidade de BMECs expostas a S. aureus. BMECs incubadas com TTO podem aliviar as respostas inflamatórias desencadeadas por S. aureus e aumentar a expressão de IL-8 para recrutar os PMNL para a glândula mamária, a fim de montar a resposta imune inata de BMECs e PMNL. Importante, o TTO não afetou a expressão de κ-caseína em BMECs expostas a S. aureus. Portanto, o TTO deve ser considerado para uso como uma nova estratégia terapêutica para a mastite bovina causada por S. aureus, para melhorar a produção e a qualidade do leite.
Abreviaturas
BMECs
Células Epiteliais Mamárias Bovinas
FBS
Soro Fetal Bovino
GAPDH
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
IRAK1
Quinase associada ao receptor de interleucina 1
NFKBIA
Inibidor alfa do NFKB
PMNL
Leucócitos polimorfonucleares
S. aureus
Staphylococcus aureus
SOD2
Superóxido dismutase 2
TLR-2
Receptor do tipo Toll 2
TLR-4
Receptor do tipo Toll 4
TRAF6
Fator 6 associado ao receptor de TNF
TTO
Óleo de melaleuca
Kang Zhan e Tianyu Yang contribuíram igualmente para este trabalho.
Contribuições dos autores
ZK realizou o trabalho experimental, analisou os dados e redigiu o manuscrito. YTY e FBB também realizaram o trabalho experimental. CYY revisou o manuscrito. ZXY e HYJ forneceram o suporte do extrato de TTO. O Professor ZGQ contribuiu com a ideia experimental. Os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Financiamento
Este estudo foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (SBK2019043455), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 31972589), pelo Sistema de Pesquisa Agrícola da China (CARS-36) e pelo Projeto de Desenvolvimento da China (2017YFD0502104–3).

Disponibilidade de dados e materiais
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão disponíveis junto ao autor correspondente mediante solicitação. Os conjuntos de dados que suportam as conclusões deste artigo estão incluídos no artigo.

Aprovação ética e consentimento para participação
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Yang Zhou.

Consentimento para publicação
Não aplicável.

Interesses concorrentes
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.

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