pmid: "35214891"
title: "Caracterização Química e Biológica de"
authors: "Borotová P, Galovičová L, Vukovic NL, Vukic M, Tvrdá E, Kačániová M"
journal: "Plants (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2022 Feb 20"
doi: "10.3390/plants11040558"
source: "PMC Full Text"

Caracterização Química e Biológica de

Autores

Borotová P, Galovičová L, Vukovic NL, Vukic M, Tvrdá E, Kačániová M

Periodico

Plants (Basel, Switzerland) (2022 Feb 20)

Conteudo

Caracterização Química e Biológica do Óleo Essencial de Melaleuca alternifolia
O óleo essencial de Melaleuca alternifolia, comumente conhecido como óleo da árvore do chá, possui muitas propriedades benéficas devido aos seus compostos bioativos. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar o óleo essencial da árvore do chá (OEATC) da Eslováquia e suas propriedades biológicas, que são específicas da composição química do óleo essencial. A cromatografia gasosa/espectrometria de massas revelou que o terpinen-4-ol era dominante, com um teor de 40,3%. γ-Terpineno, 1,8-cineol e p-cimeno foram identificados em teores de 11,7%, 7,0% e 6,2%, respectivamente. A atividade antioxidante foi determinada em 41,6% de inibição radicalar, o que equivale a 447 μg de Trolox por 1 mL de amostra. A atividade antimicrobiana foi observada pelo método de difusão em disco contra bactérias Gram-positivas (G+), Gram-negativas (G−) e contra leveduras, onde a melhor atividade antimicrobiana foi contra Enterococcus faecalis e Candida albicans, com uma zona de inibição de 10,67 mm. A concentração inibitória mínima mostrou melhor suscetibilidade por parte das células planctônicas G+ e G−, enquanto as espécies de leveduras e as cepas bacterianas formadoras de biofilme foram mais resistentes. A atividade antibiofilme foi observada contra Pseudomonas fluorescens e Salmonella enterica por MALDI-TOF, onde se obteve degradação dos espectros de proteínas após a adição do óleo essencial. As boas propriedades biológicas do óleo essencial da árvore do chá permitem seu uso na indústria alimentícia ou na medicina como agente antioxidante e antimicrobiano.

1. Introdução
   Melaleuca alternifolia (árvore do chá) é uma pequena árvore da família Myrtaceae nativa da Austrália. O óleo essencial da árvore do chá (OEATC) produzido a partir de suas folhas pode ser classificado em três grandes quimiotipos: terpinen-4-ol, terpinoleno e 1,8-cineol. Outros quimiotipos são uma combinação de constituintes dominantes e não dominantes, com várias composições. O quimiotipo terpinen-4-ol é dominante e também mais interessante do ponto de vista medicinal. Na medicina, o OEATC é usado contra a acne, reduz a dermatite de contato e melhora a cicatrização de feridas.
   Terpinen-4-ol é um álcool monoterpênico natural com boas propriedades antimicrobianas. É eficaz contra S. aureus resistente à meticilina e C. albicans resistente ao fluconazol. Também pode inibir mediadores pró-inflamatórios e atuar como um potencial agente anticancerígeno. α-Terpineno e γ-terpineno são isômeros monoterpênicos que ocorrem naturalmente em diversos óleos essenciais. Ambos os isômeros possuem forte atividade antioxidante e podem ter efeito na proteção da oxidação do DNA. Seu próximo isômero é o terpinoleno (δ-terpineno), encontrado naturalmente em ervas, que é frequentemente usado como agente flavorizante. Possui alta capacidade antioxidante e potenciais propriedades antiproliferativas. 1,8-Cineol, um monoterpenoide bicíclico também conhecido como eucaliptol, é comumente usado no tratamento de doenças respiratórias. Possui boas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Também foi observada atividade antibiofilme contra Streptococcus pyogenes. P-Cimeno pertence a um grupo de alquilbenzenos. Pode ser encontrado em mais de 100 espécies de plantas e possui um amplo espectro de atividades antioxidante, antimicrobiana, antiparasitária e anti-inflamatória. Devido a compostos bioativos como terpinen-4-ol, α-terpinoleno, α-terpineno e γ-terpineno, os TTEOs possuem propriedades antioxidantes potencialmente fortes. Este antioxidante natural possui melhores propriedades do que o butil-hidroxitolueno sintético, o que oferece a possibilidade de prevenir a oxidação de alimentos. A composição do TTEO resulta em boa atividade antimicrobiana contra patógenos bacterianos, fúngicos ou virais. O TTEO é capaz de inibir a respiração e aumentar a permeabilidade da membrana, o que resulta na inibição do metabolismo microbiano. Muitas bactérias são capazes de crescer na forma de biofilme, que é menos vulnerável a efeitos adversos do ambiente externo. A atividade de inibição do TTEO sobre biofilmes patogênicos foi observada contra P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans e V. harveyi. O TTEO também é capaz de inibir bactérias na forma de biofilme. O TTEO é ativo contra S. aureus formador de biofilme, E. coli ou a levedura C. albicans.
   Pseudomonas fluorescens é uma bactéria Gram-negativa móvel que pode formar biofilme em habitats de solo e água. Ela pode influenciar a deterioração de alimentos, a qualidade da água, doenças de plantas e criar infecções nosocomiais. P. fluorescens na forma de biofilme pode ser encontrada causando deterioração de leite e produtos lácteos. Salmonella enterica, uma bactéria Gram-negativa em forma de bastonete, é a principal causa de doenças alimentares agudas e é uma fonte de infecção a partir da carne de aves. Ela pode formar biofilme mesmo em baixas temperaturas e pode causar deterioração de alimentos na geladeira. O biofilme pode ser formado em superfícies de vidro e madeira, o que pode causar contaminação cruzada de vegetais. Os óleos essenciais têm sido usados por muitos anos na medicina, culinária e indústria alimentícia, devido às suas propriedades benéficas. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar o OE da Eslováquia e suas propriedades biológicas. A composição química do OETT foi determinada. A atividade antioxidante e antimicrobiana foi descrita. Este é o primeiro estudo onde a atividade antibiofilme do OETT contra P. fluorescens e S. enterica foi determinada por MALDI-TOF MS, onde foram observadas mudanças moleculares na estrutura proteica.
2. Resultados
   2.1. Composição Química
   No OETT, 47 compostos orgânicos voláteis foram identificados, o que correspondeu a 96,5% da composição total (Tabela 1, componentes traço abaixo de 0,1% não estão listados). O constituinte dominante foi o terpinen-4-ol com 40,3%. O OETT também continha 11,7% de γ-terpineno, 7,0% de 1,8-cineol e 6,2% de p-cimeno como componentes principais.
   2.2. Atividade Antioxidante
   A atividade antioxidante medida pela captura do radical DPPH foi determinada em 41,6% de inibição, o que foi equivalente a 447 μg de Trolox para 1 mL de amostra.
   2.3. Atividade Antimicrobiana Analisada pelo Método de Disco-Difusão
   A maior atividade antimicrobiana foi observada contra E. faecalis e C. albicans com uma zona de inibição de 10,67 mm. Todos os outros microrganismos testados, exceto M. luteus, exibiram atividade moderada com zonas de inibição na faixa de 6,00 a 9,33 mm (Tabela 2). M. luteus exibiu a maior resistência com uma zona de inibição de 4,67 mm.
   2.4. Atividade Antimicrobiana Analisada pelo Método de Microdiluição em Caldo
   A menor concentração de OETT com 50% de inibição dos microrganismos (CIM 50) foi determinada para P. aeruginosa (10,46 μL/mL), S. aureus (11,52 μL/mL) e S. enterica (11,82 μL/mL). Os menores valores de CIM 90 foram observados para P. aeruginosa (12,32 μL/mL), S. aureus (14,26 μL/mL) e P. fluorescens (15,46 μL/mL). Geralmente, as bactérias G+ e G− pareceram ser mais suscetíveis ao OETT em comparação com as leveduras, onde a CIM 50 atingiu concentrações acima de 20 μL/mL. Além disso, as cepas bacterianas formadoras de biofilme foram mais resistentes ao OETT em comparação com as bactérias planctônicas, com valores de CIM 50 de 25,46 μL/mL para P. fluorescens e 23,18 μL/mL para S. enterica (Tabela 3).
   2.5. Análise da Degradação do Biofilme
   O efeito do TTEO contra a bactéria formadora de biofilme P. fluorescens foi avaliado com o MALDI-TOF MS Biotyper®. Os espectros dos grupos de controle (células planctônicas e biofilme não tratado com TTEO) evoluíram igualmente (espectros não mostrados), portanto, células planctônicas de controle foram utilizadas como controle para comparação de alterações moleculares no biofilme.

Com base na análise dos espectros de massa do biofilme em dias individuais (Figura 1A–F), podemos observar que o grupo experimental da superfície de vidro se desenvolveu durante o experimento de forma muito semelhante ao espectro planctônico de controle até o Dia 9. Nos Dias 12 e 14 do experimento, foi observada uma alteração no espectro de massa, que indicou uma mudança na composição proteica do biofilme devido à exposição prolongada ao TTEO.

No grupo experimental da superfície de madeira, observamos um número significativamente menor de picos com baixa intensidade em comparação ao espectro planctônico de controle a partir do Dia 3 do experimento, o que comprova a influência do TTEO na homeostase do biofilme. No Dia 14 do experimento, o número de picos aumentou novamente, o que pode indicar que o óleo essencial teve uma duração de ação limitada, e o biofilme foi capaz de se adaptar a condições adversas.

O dendrograma construído (Figura 2) mostrou que o grupo experimental de vidro apresentou distâncias de MSP mais curtas do que o grupo de controle após o Dia 9. Nos Dias 12 e 14, a distância de MSP dos grupos experimentais foi significativamente maior em comparação ao grupo de controle. Com base nos achados, podemos afirmar que, após exposição mais prolongada, o efeito inibitório do óleo essencial na estrutura do biofilme apareceu na superfície de vidro.

No grupo experimental de madeira, podemos observar distâncias de MSP significativamente maiores em comparação ao grupo de controle após o Dia 7 do experimento. No Dia 9 do experimento, o comprimento do MSP do grupo experimental de madeira e do grupo de controle foi o mesmo. No Dia 12, foi visível uma redução na diferença entre os grupos experimental e de controle. No Dia 14, houve um encurtamento da distância de MSP do grupo experimental em comparação ao controle. Com base nisso, podemos concluir que o óleo essencial teve um efeito inibitório no biofilme de P. fluorescens até 7–9 dias, e após exposição mais prolongada, o biofilme se adaptou a condições adversas.

As análises dos espectros de massa do biofilme de S. enterica mostraram alterações no desenvolvimento do biofilme a partir do Dia 3 após a comparação da exposição ao TTEO (Figura 3A). Alterações estruturais também foram visíveis nos Dias 5, 7, 9, 12 e 14 (Figura 3B–F). As alterações mais visíveis na estrutura proteica foram observadas no Dia 5 na superfície de madeira e no Dia 9 na superfície de vidro.
Com base no dendrograma construído (Figura 4) no Dia 3 do experimento, a distância MSP do grupo controle foi a mesma que a do grupo experimental na madeira, e o grupo experimental no vidro apresentou uma distância menor que o grupo controle. No Dia 5, registramos um aumento na distância dos grupos experimentais MSP em comparação ao grupo controle. No Dia 7, as distâncias MSP foram menores. No Dia 9, ambos os grupos experimentais apresentaram distâncias menores que o grupo controle. No Dia 12, a distância entre o grupo controle MSP e o grupo experimental na madeira permaneceu significativamente maior que o grupo experimental feito de vidro. No Dia 14, por outro lado, observamos uma distância significativamente maior entre o grupo controle e o grupo experimental no vidro, enquanto o grupo experimental na madeira apresentou uma distância significativamente menor do MSP.

O dendrograma mostrou que o desenvolvimento do biofilme de S. enterica e a degradação de proteínas após a exposição ao TTEO não foram tão evidentes quanto em P. aeruginosa, pois o comprimento do MSP entre os grupos controle e experimental não se distinguiu. Embora os espectros de massa tenham mostrado alterações na estrutura proteica, resultado da degradação do biofilme, os comprimentos do MPS não refletiram esse resultado. A concentração de TTEO era muito baixa para observar alterações na formação do biofilme, portanto, a concentração de 0,1% de TTEO não é suficiente para degradar o biofilme em nível proteico e precisa ser aumentada.

3. Discussão
   O TTEO da Eslováquia era rico em compostos e classificado como quimiotipo terpinen-4-ol, que é o quimiotipo mais comum. Entre os quimiotipos de terpinen-4-ol, Liao et al. observaram a composição do TTEO de terpinen-4-ol (40,09%), γ-terpineno (21,85%), α-terpineno (11,34%), α-terpineol (6,91%) e α-pineno (5,86%). Em nosso estudo, o TTEO continha quase a mesma quantidade do constituinte principal terpinen-4-ol. Além disso, o 1,8-cineol estava entre os componentes dominantes. Nosso TTEO também apresentou uma quantidade menor de α-terpineno. Noumi et al. determinaram seu TTEO pela composição de terpinen-4-ol (40,44%), γ-terpineno (19,54%), α-terpineno (7,69%), 1,8-cineol (5,20%), p-cimeno (4,74%) e α-terpineol (3,31%). O TTEO da França tinha uma composição semelhante ao TTEO do nosso estudo. Brun et al. analisaram dez TTEOs, todos pertencentes ao quimiotipo terpinen-4-ol, com teores de aproximadamente 42% a 48%. Esses TTEOs também continham γ-terpineno de 18% a 25% e α-terpineno de 8% a 12%. Nosso TTEO apresentou um teor menor de todos os componentes principais mencionados. A composição do TTEO no estudo de Kim et al. foi terpinen-4-ol (43,2%), γ-terpineno (20,6%) e α-terpineno (9,6%), e Elmi et al. analisaram 41,49% de terpinen-4-ol, 20,55% de γ-terpineno e 9,59% de α-terpineno em sua amostra de TTEO. Ambos os autores determinaram uma porcentagem maior de componentes principais do que o nosso TTEO. Embora a presença de alguns constituintes seja menor do que em outros estudos, nosso TTEO foi comparável a outros TTEOs analisados. Todos os constituintes principais atendem às condições das normas ISO, exceto o teor de α-terpineno, que deve ser superior a 5%. Várias condições afetam a qualidade dos óleos essenciais, como localização geográfica, método de extração, época de colheita ou condições de armazenamento.
   O método de atividade antioxidante ainda está em evolução. Embora a expressão dos resultados não tenha sido padronizada, o sequestro do radical DPPH pode descrever validamente a capacidade antioxidante dos óleos essenciais. Kim et al. descobriram que 10 μL/mL de solução metanólica de TTEO se aproximava de 80% de atividade antioxidante pelo método de sequestro de radicais, o que foi superior aos nossos resultados. Zhang et al. expressaram a atividade antioxidante como EC50, com concentração de TTEO de 48,35 μg/mL, e descreveram o TTEO como um antioxidante potencial. Jeyakani e Rajalakshmi mediram a atividade antioxidante de 58,52% a 70,41%, o que foi superior à nossa atividade antioxidante. Zhao et al. determinaram a atividade antioxidante da solução metanólica como aproximadamente 55%. Em nosso estudo, a atividade antioxidante foi ligeiramente inferior. Shah et al. determinaram a atividade antioxidante na faixa de 39,56% a 60,44%, dependente da concentração, o que estava de acordo com nosso estudo. A atividade antioxidante é variável e está relacionada à composição química, podendo ser afetada por substâncias específicas. Nosso TTEO apresentou propriedades antioxidantes inferiores às dos autores mencionados, o que pode ser causado por diferentes composições químicas. α-Terpineno e α-terpinoleno contribuem grandemente para a capacidade antioxidante do TTEO, mas esses componentes não predominaram em nosso TTEO.
   A atividade antimicrobiana do TTEO determinada pelo método de difusão em disco foi avaliada por Puvača et al., que observaram atividade antimicrobiana contra Citrobacter koseri, Salmonella Typhi e Escherichia coli na faixa de 13 a 21 mm. Essa atividade antimicrobiana foi geralmente mais forte do que os resultados do nosso estudo. Esmael et al. detectaram que o TTEO também era ativo contra Staphylococcus aureus resistente a antibióticos, com uma zona de inibição de 15,5 mm. A zona de inibição de S. aureus do nosso estudo é metade desse tamanho. Melo et al. observaram forte atividade de inibição contra S. enterica sorovar Typhimurium, S. enterica sorovar Enteritidis, E. coli, S. aureus e E. faecalis na faixa de 23,43–50,80 mm. Nesse estudo, eles usaram o dobro do volume de EO em comparação com o nosso estudo. Ergin et al. mediram as zonas de inibição de seis espécies de Candida, com zonas de inibição de 14–42 mm, que também foram maiores do que as nossas zonas de inibição. Li et al. observaram as zonas de inibição de B. subtilis, C. albicans, M. luteus, E. coli, S. enterica sor. Paratyphi B, S. aureus, S. saprophyticus, K. pneumonia, S. pyogenes na faixa de 6,60–15,70 mm. S. aureus apresentou uma zona de inibição menor (6,60 mm) do que em nosso estudo. Por outro lado, M. luteus foi vulnerável ao TTEO com uma zona de inibição de 12,9 mm. Em nosso estudo, M. luteus foi o mais resistente entre os microrganismos testados. Os autores também afirmaram que P. aeruginosa foi resistente ao TTEO, enquanto em nosso estudo, sua zona de inibição atingiu 6 mm. B. subtilis e C. albicans tiveram zonas de inibição maiores do que em nosso estudo (12,6 e 15,7 mm, respectivamente). A atividade antimicrobiana também é variável e dependente de fatores como a composição química. O principal contribuinte antimicrobiano ativo no TTEO é o terpinen-4-ol. No entanto, componentes menores também contribuem para a eficácia antimicrobiana do TTEO.
   Puvača et al. registraram a CIM de S. Typhi, C. koseri e E. coli na faixa de 2,7 mg/mL a 6,2 mg/mL. Eles não determinaram os valores de CIM 50 e CIM 90, como em nosso estudo, mas afirmaram boas propriedades antimicrobianas, o que está de acordo com nosso estudo. Ziółkowska-Klinkosz et al. determinaram a CIM como a concentração que inibiu completamente o crescimento de bactérias anaeróbicas. Eles estabeleceram a concentração na faixa de 0,12–0,5 mg/mL, considerada boa atividade. Os autores também declararam que seu TTEO foi mais eficaz contra bactérias G+ do que G−. Em nosso estudo, não houve diferenças entre bactérias G+ e G−. No entanto, bactérias G− formadoras de biofilme e leveduras foram menos vulneráveis ao TTEO. Zhang et al. determinaram a CIM do TTEO contra S. aureus, E. coli e P. aeruginosa nas concentrações de 2, 8 e 12 mg/mL, respectivamente, o que também foi considerado boa atividade antimicrobiana. Hammer et al. testaram a inibição de 16 espécies de bactérias da pele com TTEO; os valores de CIM 50 foram de 0,25–0,5% v/v, e os valores de CIM 90 foram de 0,25–2% v/v. Bagg et al. observaram a inibição do TTEO contra cepas de leveduras resistentes ao fluconazol e ao itraconazol. A CIM 50 do TTEO foi de 0,5% v/v para C. albicans e 0,25% v/v para C. glabrata, e a CIM 90 atingiu 1% v/v para ambas. As formas de expressão da CIM também são variáveis, mas todos os autores declararam boa atividade inibitória do TTEO, o que corresponde aos nossos achados.

A influência do TTEO na formação de biofilme foi observada por Comin et al., que relataram a influência positiva na inibição de P. aeruginosa após a aplicação de nanopartículas de TTEO. Kwieciński et al. descobriram que o TTEO pode matar todas as cepas clínicas de S. aureus, tanto planctônicas quanto formadoras de biofilme. Eles afirmaram que 0,5% de TTEO matou 99% das bactérias após 60 min. Essa concentração foi mais eficaz, mas também maior do que em nosso estudo. Sadekuzzaman et al. descobriram que o TTEO reduziu a formação de biofilme de E. coli O157:H7, L. monocytogenes e Salmonella spp. na concentração de 0,1%, que é a mesma concentração usada em nosso estudo. Sudjana et al. observaram que o TTEO inibiu a adesão de C. albicans e sua formação de biofilme em superfícies bióticas e abióticas. A adesão ao poliestireno foi significativamente reduzida com 0,25% de TTEO, o que foi maior do que a concentração eficaz em nosso estudo, pois precisamos de apenas 0,1% de TTEO para observar alterações na estrutura proteica. Al-Shuneigat descobriu que o produto TTEO foi capaz de reduzir a adesão ao poliestireno na cepa de Staphylococcus formadora de biofilme. A redução foi significativa a 625 ppm. Song et al. descobriram que o TTEO também pode reduzir efetivamente o metabolismo do biofilme de S. mutans na concentração de 0,125%, o que foi comparável ao nosso estudo. O TTEO mostrou boa inibição do crescimento contra bactérias formadoras de biofilme, o que significa que o TTEO pode potencialmente ser usado na indústria alimentícia e farmacêutica para prevenir cepas formadoras de biofilme.
Os óleos essenciais claramente têm um efeito na produção de proteínas de baixo peso molecular que podem ser detectadas por MALDI-TOF MS. Božik et al. detectaram proteínas ribossomais, relacionadas à membrana, relacionadas ao citosol e relacionadas ao DNA, além de proteínas de estresse, que alteraram o padrão de expressão em B. subtilis após exposição a componentes de óleos essenciais. Tang et al. sugeriram que o óleo essencial causou perda da integridade da membrana, o que levou à inibição da síntese de proteínas e biofilme em S. aureus.

O MALDI-TOF MS é capaz de detectar proteínas na faixa de massa de 2–20 kDa, que pertencem predominantemente a proteínas constitutivas, incluindo proteínas ribossomais, proteínas mitocondriais, proteínas de choque-frio e choque-térmico, e proteínas de ligação ao DNA. A avaliação de bactérias formadoras de biofilme não é padrão para a avaliação da formação de biofilme. Esse método rápido foi descrito em e mostrou que resultados válidos podem ser obtidos. Poucas análises de biofilme foram realizadas por MALDI-TOF, mas parece ser um método promissor para o futuro. A degradação do biofilme foi observada após exposição a C. sativum, T. serpyllum e T. vulgaris. A degradação de proteínas de baixo peso molecular por óleos essenciais nos espectros de proteínas de MALDI-TOF MS de bactérias formadoras de biofilme foi observada.

4. Materiais e Métodos

O óleo essencial de tea tree foi adquirido da empresa eslovaca Hanus s.r.o. (Nitra, Eslováquia). O óleo essencial foi extraído por destilação a vapor de ramos jovens e folhas de Melaleuca alternifolia.

4.1. Microorganismos

Para as análises antimicrobianas, utilizamos quatro bactérias Gram-positivas (Bacillus subtilis CCM 1999, Enterococcus faecalis CCM 4224, Micrococcus luteus CCM 732 e Staphylococcus aureus subsp. aureus CCM 8223), quatro bactérias Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa CCM 3955, Salmonella enterica subsp. enterica CCM 4420, Yersinia enterocolitica CCM 7204 e Serratia marcescens CCM 8587) e quatro leveduras (Candida albicans CCM 8261, Candida glabrata CCM 8270, Candida krusei CCM 8271 e Candida tropicalis CCM 8223), obtidas da Coleção Tcheca de Microorganismos (Brno, República Tcheca). As cepas bacterianas formadoras de biofilme Pseudomonas fluorescens e Salmonella enterica foram utilizadas para análises de atividade antibiofilme. P. fluorescens foi isolada de peixe, e S. enterica foi isolada de carne de frango. As bactérias formadoras de biofilme foram identificadas por sequenciamento do rRNA 16S e MALDI-TOF MS Biotyper.

4.2. Análise da Estrutura Química
A caracterização química do TTEO foi realizada por cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM) e cromatografia gasosa (CG-DIC) utilizando o cromatógrafo a gás Agilent 6890N (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) acoplado a um espectrômetro de massas quadrupolar 5975B (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Foi utilizada uma coluna capilar HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). O programa de temperatura foi definido de 60 °C a 150 °C (taxa de aumento de 3 °C/min) e de 150 °C a 280 °C (taxa de aumento de 5 °C/min), com tempo total de corrida de 60 min. O gás de arraste foi hélio 5.0 com fluxo de 1 mL/min. A temperatura do injetor split/splitless foi ajustada em 280 °C, e 1 μL de amostra de OE diluída em pentano foi injetado. As amostras investigadas foram injetadas no modo split com razão de split de 40,8:1. Os dados espectrométricos de massas por impacto de elétrons (EM-IE; 70 eV) foram adquiridos no modo varredura na faixa de m/z 35–550. As temperaturas da fonte de íons do EM e do quadrupolo do EM foram de 230 °C e 150 °C, respectivamente. As análises por CG-DIC foram realizadas em um cromatógrafo a gás Agilent 6890N acoplado a um detector DIC. As condições da coluna e cromatográficas foram as mesmas da análise por CG-EM. A temperatura do detector DIC foi ajustada em 300 °C. Os constituintes voláteis do OE foram identificados com base nos índices de retenção, comparados a espectros de referência (bases de dados Wiley e NIST). Os índices de retenção foram determinados experimentalmente usando o método padrão dos tempos de retenção de n-alcanos (C6–C34), injetados sob as mesmas condições cromatográficas. As porcentagens dos compostos identificados (superiores a 0,1%) foram derivadas das áreas dos picos da CG. A medição foi realizada em triplicata.
4.3. Atividade Antioxidante
A captação de radicais de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH, Sigma Aldrich, Schnelldorf, Alemanha) foi utilizada para medir a atividade antioxidante do TTEO. O DPPH foi dissolvido em metanol na concentração de 0,025 g/L e ajustado para absorbância de 0,8 no comprimento de onda de 515 nm (por espectrofotômetro Glomax, Promega Inc., Madison, WI, EUA). Um volume de 5 μL de amostra de OE foi adicionado a 195 μL de solução de DPPH em uma microplaca de 96 poços e incubado por 30 min no escuro sob agitação a 1000 rpm. A porcentagem de inibição do DPPH foi calculada de acordo com a fórmula (A0 − AA)/A0 × 100, onde A0 é a absorbância do DPPH com metanol, e AA é a absorbância da amostra. O padrão de referência Trolox (Sigma Aldrich, Schnelldorf, Alemanha) foi utilizado para o cálculo da capacidade antioxidante total. O Trolox foi dissolvido em metanol (Uvasol® para espectroscopia, Merck, Darmstadt, Alemanha) na faixa de concentração de 0–100 µg/mL. A atividade antioxidante total foi expressa de acordo com a curva de calibração como 1 μg de Trolox para 1 mL de amostra de OE (TEAC).
4.4. Método de Difusão em Disco
O método de difusão em disco foi utilizado para determinação da atividade antimicrobiana do TTEO. O inóculo bacteriano foi cultivado por 24 h em ágar triptona soja (TSA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) a 37 °C, e o inóculo de levedura foi cultivado em ágar Sabouraud dextrose (SDA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) a 25 °C. A cultura microbiana foi ajustada com água destilada para densidade óptica padrão 0,5 McFarland (1,5 × 108 UFC/mL). Um volume de 100 μL de cultura bacteriana foi espalhado em ágar Mueller–Hinton (MHA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido), e 100 μL de cultura de levedura foram espalhados em ágar Sabouraud dextrose (SDA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Em seguida, discos estéreis de 6 mm foram saturados com 10 μL de TTEO e colocados sobre a suspensão microbiana, e as amostras foram incubadas a 37 °C para bactérias e 25 °C para leveduras por 24 h.
As zonas de inibição foram medidas em três lados a partir da borda do filtro. A zona de inibição maior que 10 mm foi determinada como atividade antimicrobiana muito forte, a zona de inibição de 10–5 mm foi determinada como atividade moderada, e a zona de inibição de 5–1 mm foi determinada como atividade fraca. Os antibióticos utilizados como controle foram cefoxitina para bactérias G−, gentamicina para bactérias G+, e fluconazol para leveduras. O método de avaliação das zonas de inibição também foi o mesmo para bactérias formadoras de biofilme. A atividade antimicrobiana foi medida em triplicata.
4.5. Método de Microdiluição em Caldo
O inóculo bacteriano foi cultivado por 24 h em caldo Mueller–Hinton (MHB, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) a 37 °C, e o inóculo de levedura foi cultivado em caldo Sabouraud dextrose (SDA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) a 25 °C. Um volume de 50 μL de inóculo com densidade óptica padrão 0,5 McFarland foi adicionado a uma microplaca de 96 poços. Um volume de 100 μL de TTEO foi adicionado à suspensão microbiana em concentrações finais de 400 μL/mL a 0,2 μL/mL. As amostras foram misturadas e incubadas por 24 h a 25 °C (culturas de levedura) e 37 °C (culturas bacterianas).
Após 24 h de incubação, as bactérias formadoras de biofilme foram coradas com violeta cristal. O meio com células não aderidas foi descartado. O biofilme foi lavado três vezes com água destilada. Um volume de 200 μL de violeta cristal (0,1% p/v) foi adicionado, e as amostras foram incubadas por 15 min. A solução foi descartada, e as amostras foram lavadas novamente. O biofilme foi solubilizado em 200 μL de ácido acético (33%). A absorbância foi medida a 570 nm.
MHB com EO foi utilizado como controle negativo, e MHB com inóculo foi utilizado como controle positivo. A absorbância foi medida espectrofotometricamente no início do experimento e após 24 h a 570 nm. A análise foi preparada em triplicata.
4.6. Análise da Degradação do Biofilme
Degradação dos espectros de proteínas durante o desenvolvimento do biofilme foi avaliada em P. fluorescens e S. enterica formadoras de biofilme. A adição de TTEO foi avaliada com MALDI-TOF MS Biotyper. Um volume de 20 mL de MHB foi adicionado a tubos de 50 mL. Um volume de 200 μL de bactérias formadoras de biofilme foi adicionado. Os tubos também continham o palito que simulava a superfície de madeira e a lâmina de microscópio que simulava a superfície de vidro. TTEO foi adicionado aos grupos experimentais na concentração final de 0,1%, e as amostras controle não foram tratadas. As amostras foram incubadas a 37 °C em agitador a 170 rpm e analisadas nos Dias 3, 5, 7, 9, 12 e 14. As amostras de biofilme foram coletadas das superfícies de vidro e madeira com um swab de algodão estéril e adicionadas à placa alvo do MALDI-TOF. As células planctônicas foram coletadas de 300 µL de meio de cultura. A suspensão bacteriana foi centrifugada por 1 min a 12.000 rpm, e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado três vezes em 30 μL de água ultrapura e centrifugado. Após a lavagem, as células planctônicas foram ressuspensas e 1 μL foi aplicado a uma placa alvo.

Um volume de 1 μL da matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/mL) foi aplicado à placa alvo seca com as amostras. O MALDI-TOF MicroFlex (Bruker Daltonics) foi utilizado para análise da estrutura proteica do biofilme. Os espectros foram registrados em modo linear e positivo com uma faixa de relação massa/carga de 200–2000. Os espectros de proteínas foram obtidos por análise automática, e as similaridades dos espectros em uma amostra foram usadas para gerar o espectro global padrão (MSP). Dezenove MSP foram gerados a partir dos espectros pelo MALDI Biotyper 3.0 e agrupados em dendrogramas usando distância euclidiana.

4.7. Avaliação dos Dados Estatísticos
O software SAS® foi utilizado para processamento dos dados. Os valores de CIM (concentração que causou 50% e 90% de inibição no crescimento bacteriano) foram determinados por análise logit.

5. Conclusões
   A atividade biológica e a composição química do TTEO foram avaliadas. O TTEO foi um quimiotipo de terpinen-4-ol que também continha γ-terpineno, 1,8-cineol e p-cimeno. Este TTEO pode ser usado como um potencial antioxidante. A melhor atividade antimicrobiana foi observada contra E. faecalis, e a concentração inibitória mínima C. albicans mostrou melhor suscetibilidade a bactérias G+ e G− do que leveduras e bactérias formadoras de biofilme. O TTEO também foi eficaz contra a formação de biofilme de P. fluorescens, enquanto o biofilme de S. enterica precisa ser testado com concentrações mais altas de TTEO.
   O TTEO da República Eslovaca geralmente apresenta boa atividade biológica, o que confere potencial para uso na indústria alimentícia e na medicina para prevenir a oxidação, inibir o crescimento de bactérias e inibir a formação de biofilme.

Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Contribuições dos Autores
Conceptualização, P.B., L.G. e M.K.; curadoria de dados, P.B., L.G., N.L.V., M.V. e M.K.; metodologia, P.B., L.G., N.L.V., M.V., E.T. e M.K.; supervisão, M.K.; preparação do rascunho original, L.G., P.B., E.T., N.L.V., M.V. e M.K. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Esta pesquisa foi financiada pela bolsa APVV-20-0058 "O potencial dos óleos essenciais de plantas aromáticas para uso médico e conservação de alimentos".
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados estão contidos no artigo.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesse.
Referências
Four Terpene Synthases Contribute to the Generation of Chemotypes in Tea Tree (Melaleuca alternifolia)
Natural Variation in the Essential Oil Content of Melaleuca alternifolia Cheel (Myrtaceae)
Genetic Gains in Oil Yields after Nine Years of Breeding Melaleuca alternifolia (Myrtaceae)
Tea Tree Oil Gel for Mild to Moderate Acne; a 12 Week Uncontrolled, Open-Label Phase II Pilot Study
Tea Tree Oil Attenuates Experimental Contact Dermatitis
The Effect of Tea Tree Oil (Melaleuca alternifolia) on Wound Healing Using a Dressing Model
Comparison of the Cidal Activity of Tea Tree Oil and Terpinen-4-Ol against Clinical Bacterial Skin Isolates and Human Fibroblast Cells
The Influence of Tea Tree Oil (Melaleuca alternifolia) on Fluconazole Activity against Fluconazole-Resistant Candida albicans Strains
Terpinen-4-Ol, the Main Component of the Essential Oil of Melaleuca alternifolia (Tea Tree Oil), Suppresses Inflammatory Mediator Production by Activated Human Monocytes
Terpinen-4-Ol: A Novel and Promising Therapeutic Agent for Human Gastrointestinal Cancers
Unusual Antioxidant Behavior of α- and γ-Terpinene in Protecting Methyl Linoleate, DNA, and Erythrocyte
Anticancer and Antioxidant Properties of Terpinolene in Rat Brain Cells
Eucalyptol (1,8-Cineole): An Underutilized Ally in Respiratory Disorders?
1,8-Cineole: A Review of Source, Biological Activities, and Application
Eucalyptol Inhibits Biofilm Formation of Streptococcus pyogenes and Its Mediated Virulence Factors
Update on Monoterpenes as Antimicrobial Agents: A Particular Focus on p-Cymene
River Tea Tree Oil: Composition, Antimicrobial and Antioxidant Activities, and Potential Applications in Agriculture
Evaluation of Antioxidant Activity of Australian Tea Tree (Melaleuca alternifolia) Oil and Its Components
Melaleuca alternifolia (Tea Tree) Oil: A Review of Antimicrobial and Other Medicinal Properties
Determining the Antimicrobial Actions of Tea Tree Oil
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Atividade dos Óleos Essenciais de Tomilho e Árvore do Chá contra Patógenos Alimentares Selecionados em Biofilmes em Superfícies Abióticas
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Óleo Essencial de Thymus serpyllum e sua Atividade Biológica como Conservante Alimentar Moderno
Óleo Essencial de Thymus vulgaris e sua Atividade Biológica
Identificação de Componentes de Óleos Essenciais por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas
Uma Generalização do Sistema de Índice de Retenção Incluindo Cromatografia de Partição Gás-Líquido com Programação Linear de Temperatura
Métodos de Diluição em Ágar e Caldo para Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de Substâncias Antimicrobianas
Avaliação de Diferentes Métodos de Detecção de Formação de Biofilme em Isolados Clínicos
Uso da Espectrometria de Massas MALDI-TOF para Analisar o Perfil Molecular de Biofilmes de Pseudomonas aeruginosa Cultivados em Superfícies de Vidro e Plástico
Espectros de massa MALDI-TOF do desenvolvimento do biofilme de P. fluorescens após exposição ao TTEO: (A) 3º dia; (B) 5º dia; (C) 7º dia; (D) 9º dia; (E) 12º dia; (F) 14º dia.
Dendrograma do progresso do biofilme de P. fluorescens após exposição ao TTEO. PF—P. fluorescens; C—controle; G—vidro; W—madeira; P—células planctônicas.
Espectros de massa MALDI-TOF do desenvolvimento do biofilme de S. enterica após exposição ao TTEO: (A) 3º dia; (B) 5º dia; (C) 7º dia; (D) 9º dia; (E) 12º dia; (F) 14º dia.
Dendrograma do progresso do biofilme de S. enterica após exposição ao TTEO. SE—S. enterica; C—controle; G—vidro; W—madeira; P—células planctônicas.
Composição química do TTEO.
Índice de Retenção Composto Identificado % 1178 Terpinen-4-ol 40,3 ± 0,02 1060 γ-Terpineno 11,7 ± 0,02 1033 1,8-Cineol 7,0 ± 0,01 1023 p-Cimeno 6,2 ± 0,02 1016 α-Terpineno 3,9 ± 0,01 1189 α-Terpineol 3,9 ± 0,02 938 α-Pineno 3,4 ± 0,01 1088 α-Terpinoleno 2,2 ± 0,01 1443 Aromadendreno 2,0 ± 0,01 1498 Ledeno 1,9 ± 0,01 1525 δ-Cadineno 1,9 ± 0,01 1028 α-Limoneno 1,6 ± 0,01 980 β-Pineno 1,2 ± 0,01 992 β-Mirceno 0,8 ± 0,01 1183 p-Cimen-8-ol 0,8 ± 0,01 1503 Biciclogermacreno 0,8 ± 0,01 1530 cis-Calameneno 0,8 ± 0,01 1422 (E)-Cariofileno 0,7 ± 0,01 926 α-Tujeno 0,6 ± 0,01 1408 α-Gurjuneno 0,6 ± 0,01 1098 Linalol 0,5 ± 0,01 1379 α-Copaeno 0,5 ± 0,01 1652 α-Eudesmol 0,4 ± 0,01 948 Canfeno 0,3 ± 0,01 977 Sabineno 0,3 ± 0,01 1490 β-Selineno 0,3 ± 0,01 1504 α-Muuroleno 0,3 ± 0,01 1542 α-Cadineno 0,3 ± 0,01 1004 α-Felandreno 0,2 ± 0,01 1439 γ-Elemeno 0,2 ± 0,01 1456 α-Humuleno 0,2 ± 0,01 1577 Espatulenol 0,2 ± 0,01 1593 Viridiflorol 0,2 ± 0,01 1353 α-Cubebeno 0,1 ± 0,01 1371 Isoledeno 0,1 ± 0,01
Atividade antimicrobiana do TTEO.
Micro-organismo Zona de Inibição Atividade do OE Controle Bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis 9,33 ± 1,70 ** 31 ± 3,0 Enterococcus faecalis 10,67 ± 1,25 *** 28 ± 0,5 Micrococcus luteus 4,67 ± 0,47 * 26 ± 2,0 Staphylococcus aureus 7,33 ± 0,47 ** 31 ± 1,0 Bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa 6,00 ± 0,82 ** 22 ± 1,0 Yersinia enterocolitica 6,00 ± 0,82 ** 25 ± 2,0 Salmonella enterica 7,33 ± 1,25 ** 25 ± 1,5 Serratia marcescens 6,67 ± 0,94 ** 27 ± 2,0 Biofilme de Pseudomonas fluorescens 6,00 ± 0,00 ** 26 ± 1,0 Biofilme de Salmonella enterica 6,00 ± 0,82 ** 25 ± 1,0 Leveduras Candida albicans 10,67 ± 1,70 *** 25 ± 2,0 Candida glabrata 7,67 ± 2,62 ** 31 ± 1,5 Candida krusei 6,33 ± 0,47 ** 31 ± 3,0 Candida tropicalis 8,33 ± 1,89 ** 31 ± 1,0

• Atividade fraca (zona de 1–5 mm); ** atividade moderada (zona de 5–10 mm); *** atividade forte (acima de 10 mm); antibióticos usados como controle: cefoxitina para bactérias G−, gentamicina para bactérias G+, fluconazol para leveduras.
  Concentrações inibitórias mínimas do TTEO.
  Micro-organismo CIM 50 (µL/mL) CIM 90 (µL/mL) Bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis 14,25 18,36 Enterococcus faecalis 15,86 18,45 Micrococcus luteus 13,58 18,68 Staphylococcus aureus 11,52 14,26 Bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa 10,46 12,32 Yersinia enterocolitica 12,25 15,46 Salmonella enterica 11,82 16,36 Serratia marcescens 13,45 16,24 Biofilme de Pseudomonas fluorescens 25,46 28,59 Biofilme de Salmonella enterica 23,18 25,43 Leveduras Candida albicans 22,52 26,76 Candida glabrata 24,33 29,85 Candida krusei 23,15 26,32 Candida tropicalis 21,86 27,46