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pmid: "37896249"
title: "Melhorando as Propriedades Funcionais do Óleo de Melaleuca: Atividade Antimicrobiana In Vitro e Estratégia de Microencapsulação."
authors: "Manzanelli FA, Ravetti S, Brignone SG, Garro AG, Martínez SR, Vallejo MG, Palma SD"
journal: "Pharmaceutics"
pubdate: "2023 Oct 19"
doi: "10.3390/pharmaceutics15102489"
source: "PMC Full Text"

Melhorando as Propriedades Funcionais do Óleo de Melaleuca: Atividade Antimicrobiana In Vitro e Estratégia de Microencapsulação.

Autores

Manzanelli FA, Ravetti S, Brignone SG, Garro AG, Martínez SR, Vallejo MG, Palma SD

Periodico

Pharmaceutics (2023 Oct 19)

Conteudo

Melhorando as Propriedades Funcionais do Óleo da Árvore do Chá: Atividade Antimicrobiana In Vitro e Estratégia de Microencapsulação

No contexto do combate à resistência antimicrobiana a medicamentos em infecções perioculares, o Óleo da Árvore do Chá (OAC) surgiu como uma opção terapêutica promissora. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do OAC contra cepas bacterianas isoladas de infecções oculares, com foco particular em sua capacidade de inibir a formação de biofilme. Além disso, projetamos e analisamos microcápsulas contendo OAC para superar certas propriedades físico-químicas desfavoráveis e melhorar seus atributos biológicos inerentes. A qualidade do OAC foi confirmada por meio de análise rigorosa utilizando as técnicas de GC-MS e UV-Vis. Nosso ensaio de difusão em ágar demonstrou a eficácia do Óleo da Árvore do Chá (OAC) contra cepas bacterianas oculares, incluindo Corynebacterium spp., Staphylococcus spp. coagulase-negativa e Staphylococcus aureus, bem como uma cepa de referência de Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Notavelmente, a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) para todos os microrganismos testados foram de 0,2% e 0,4%, respectivamente, com exceção de Corynebacterium spp., que apresentou resistência ao OAC. Além disso, o OAC exibiu uma redução substancial na biomassa do biofilme, variando de 30% a 70%, conforme determinado pelo método MTT. Através da técnica de secagem por atomização, preparamos com sucesso duas formulações contendo OAC com altos rendimentos de encapsulação (80–85%), eficiência de microencapsulação (90–95%) e taxas de incorporação (aproximadamente 40%). Essas formulações produziram microcápsulas com diâmetros de 6–12 μm, conforme determinado pela análise de distribuição de tamanho de partículas por dispersão a laser, e exibiram morfologias esféricas e regulares sob microscopia eletrônica de varredura. Importante, a análise por UV-Vis pós-encapsulação confirmou a presença de OAC dentro das cápsulas, com atividades antioxidante e antimicrobiana preservadas. Em resumo, nossos achados destacam o substancial potencial terapêutico do OAC e de suas microcápsulas para o tratamento de infecções oculares.

1. Introdução

A indústria farmacêutica explora continuamente novas alternativas terapêuticas para a prevenção e tratamento de diversas doenças. Com foco naquelas provenientes de fontes naturais, uma opção atraente são os óleos essenciais (OEs) biossintetizados por plantas. Esses produtos naturais são obtidos principalmente por destilação, aplicando diferentes técnicas de extração convencionais e não convencionais. Isso é viável porque os OEs são uma mistura de substâncias voláteis de composição química diversa, principalmente terpenos, fenilpropanoides e derivados aromáticos, que variam de acordo com a espécie e fatores ambientais e antropogênicos.
Os OEs têm sido utilizados há milhares de anos na atenção primária à saúde, demonstrando um amplo espectro de atividades farmacológicas. Hoje, sabe-se que essas propriedades medicinais são conferidas porque os componentes dos OEs são capazes de modular numerosas vias de transdução de sinal, individualmente ou de forma sinérgica.
Dentre as diversas atividades farmacológicas, as propriedades antimicrobianas dos OEs ganharam importância, particularmente diante do desafio crescente da resistência microbiana. Nesse cenário, os OEs surgem como potenciais alternativas aos antibióticos ou como terapia complementar a eles.
Uma questão de saúde frequentemente negligenciada diz respeito às infecções perioculares, que afetam a área ao redor dos olhos, incluindo as pálpebras e a região circundante. Essas infecções podem ser causadas por bactérias, vírus ou fungos. Quando não tratadas ou manejadas inadequadamente, podem progredir e impactar diretamente os olhos, levando a condições como conjuntivite, celulite orbitária, blefarite crônica, coriorretinite e endoftalmite.
Tanto as infecções perioculares quanto as oculares são comumente tratadas com medicamentos antimicrobianos de amplo espectro, muitas vezes sem a identificação adequada do patógeno por meio de cultura e teste de suscetibilidade. Esse uso inadequado pode potencialmente promover resistência antimicrobiana em bactérias oculares. Em particular, os biofilmes bacterianos são contribuintes-chave para os mecanismos de resistência, protegendo a comunidade bacteriana.
Estudos limitados foram conduzidos sobre o uso de óleos essenciais (OEs) contra bactérias de infecções oculares, e ainda menos estudos sobre sistemas de encapsulamento que incluam OEs para esse tipo de patologia são relatados. No entanto, o uso de OEs em aplicações farmacêuticas apresenta desafios devido às suas propriedades físico-químicas. Suas propriedades físico-químicas desfavoráveis, incluindo hidrofobicidade, baixa solubilidade em meios aquosos, alta volatilidade, decomposição mediada por oxigênio e um perfil biológico indesejado, como ação irritante significativa, restringem sua aplicabilidade como agentes terapêuticos. Formulações cosméticas e farmacêuticas incorporando OEs foram desenvolvidas para abordar essas questões, no entanto, problemas de estabilidade persistem, devido à exposição a fatores ambientais como ar, calor, luz e umidade, que alteram substancialmente sua composição durante o armazenamento. Tecnologias de encapsulamento, particularmente a microencapsulação por secagem por atomização, oferecem uma solução promissora.
A microencapsulação é uma técnica cada vez mais favorecida na indústria farmacêutica devido à sua flexibilidade, custo-benefício e adequação para compostos sensíveis ao calor. Ela permite a produção de estruturas sólidas ultrafinas com alta estabilidade e eficiência de encapsulamento.
Incorporar OE antibacterianos em formulações farmacêuticas para infecções perioculares tem o potencial de melhorar a eficácia do tratamento, reduzir o risco de desenvolvimento de resistência antimicrobiana, prevenir sua disseminação para estruturas oculares e minimizar o risco de complicações graves que possam comprometer a visão. Além disso, as propriedades farmacológicas complementares dos OEs, como seus efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios, têm o potencial de melhorar a saúde ocular geral. Essas propriedades fortalecem o sistema imunológico e protegem os tecidos oculares dos danos oxidativos causados por processos inflamatórios.
O Óleo da Árvore do Chá (TTO) apresenta um perfil promissor para terapia antimicrobiana. Este óleo é obtido principalmente por destilação a vapor das folhas de Melaleuca alternifolia (Cheel) Myrtaceae, uma árvore nativa da Austrália. A norma ISO 4730:2017 estabelece que o principal componente do TTO é o terpinen-4-ol, em uma proporção não inferior a 40%. Diferentes estudos sobre o assunto demonstraram a atividade antimicrobiana de amplo espectro do TTO, incluindo atividade antibacteriana, antiprotozoária, antifúngica e antiviral.
Com o passar do tempo, a oxidação gradual dos componentes do TTO durante o período de armazenamento pode levar a uma diminuição em sua eficácia antimicrobiana e potencialmente iniciar reações químicas indesejadas. Consequentemente, há uma demanda crescente por formulações que não apenas preservem a integridade do TTO, mas também melhorem suas propriedades biológicas inerentes.
Tendo em vista essas considerações, este estudo buscou um objetivo duplo. Primeiramente, avaliou a atividade antibacteriana de um extrato natural, o TTO, contra cepas bacterianas isoladas de infecções oculares. Em segundo lugar, desenvolveu uma metodologia de encapsulamento utilizando a técnica de secagem por atomização para microencapsular o OE selecionado. As microcápsulas resultantes foram submetidas a várias análises, abrangendo a avaliação de suas características físicas e morfológicas, perfis de liberação de fármaco in vitro e investigações por microscopia eletrônica de varredura.
Portanto, é essencial realizar mais pesquisas e exploração do TTO como uma opção terapêutica promissora para infecções oculares.
2. Materiais e Métodos
2.1. Materiais
O TTO foi adquirido da Thursday Plantation® (Ballina, Austrália). A concentração do TTO é de 1 mL por mililitro (1 mL/mL). Terpinen-4-ol e ciclohexanol foram obtidos da Sigma Aldrich (Buenos Aires, Argentina). Goma Arábica (GA), maltodextrina (MDX) e dióxido de silício (DS) foram adquiridos da Pura Química (Córdoba, Argentina) e foram utilizados como materiais de parede para formular as micropartículas.
2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio) (MTT) foram obtidos da Sigma-Aldrich, Merck (Buenos Aires, Argentina). Solventes de grau reagente analítico (tween80, glicerol, etanol e dimetilsulfóxido (DMSO) ~95,0%) e reagentes sólidos para tampões foram adquiridos da Anedra (Buenos Aires, Argentina). Violeta cristal (CV), ágar sal manitol (MSA), ágar Muller Hinton (MHA), caldo Muller Hinton (MHB) e caldo tripticaseína de soja (TSB) foram adquiridos da Britania (Buenos Aires, Argentina). Isolados bacterianos clínicos e cepas de referência (American Type Culture Collection, ATCC) foram fornecidos pelo laboratório de microbiologia do Hospital Regional Pasteur, Villa María, Córdoba, Argentina. Villa Maria pertence à Rede Latino-Americana de Vigilância da Resistência Antimicrobiana (Whonet-Argentina).

2.2. Análise do TTO

2.2.1. Análise por Cromatografia Gasosa—Espectrometria de Massas
O TTO verificou as especificações fornecidas pelas normas ISO referentes aos seus componentes por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Análises qualitativa e quantitativa do TTO foram realizadas utilizando equipamento Clarus SQ8 (Perkin Elmer, Walthman, MA, EUA) com coluna Agilent DB-5, 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro e 0,25 µm de espessura do filme. Um programa de temperatura foi adaptado do método relatado por Tranchida et al.. A temperatura inicial foi ajustada para 50 °C, aumentando 3 °C/min até 150 °C, e permaneceu até completar um tempo total de 35 min. A temperatura do injetor e a temperatura do detector foram de 280 °C. O atraso do solvente foi de 4 min, hélio foi empregado como gás de arraste a 1 mL/min, e o modo de injeção split foi selecionado. Os espectros foram adquiridos em um espectrômetro de massas quadrupolo simples, sob vácuo, com energia de ionização de −70 eV. A faixa de massa foi ajustada para 51–400 Da. O software TurboMass 6.1.0. foi utilizado para adquirir e processar os dados. Os padrões de fragmentação dos sinais obtidos foram comparados com aqueles incluídos na biblioteca de espectros de massa NIST e, portanto, identificados como componentes regulares do TTO. A porcentagem de terpinen-4-ol foi estabelecida calculando a razão entre a área individual e a área total.

2.2.2. Caracterização e Validação do Método UV/Vis
O TTO foi analisado por espectroscopia UV/Vis utilizando um espectrofotômetro (Analytik Jena, Specord S600, Jena, Alemanha) com uma amostra para determinar seu espectro de absorção completo em etanol absoluto. A espectroscopia de absorbância variável varre toda a faixa de comprimentos de onda UV e visível para obter informações detalhadas sobre a absorção da amostra. A maior absorbância foi obtida a 265 nm, coincidindo com o valor relatado na literatura. Portanto, o teor total dos componentes do TTO foi estabelecido por UV/Vis. Uma curva de calibração foi construída usando seis diluições de TTO em etanol absoluto (três réplicas cada) em uma faixa de 3,58 µg/mL a 89,5 µg/mL. O procedimento analítico foi validado de acordo com os seguintes critérios: a linearidade foi estabelecida a partir de uma curva de calibração aplicando análise de regressão linear de mínimos quadrados e coeficiente de correlação (r); a exatidão e a precisão foram avaliadas processando réplicas das amostras (n = 6), expressando os resultados como desvio padrão relativo (RSD). A absorbância das soluções de TTO em λmáx = 265 nm foi medida. Além disso, uma equação padrão y = 0,0106x − 0,0008 (R² = 0,9995) foi obtida (onde "y" representa a absorbância e "x" representa a concentração do óleo (µg/mL)).
2.3. Atividade Biológica do TTO Livre
2.3.1. Triagem Antimicrobiana
Cepas Bacterianas
O presente estudo foi conduzido utilizando três isolados clínicos obtidos de infecções oculares, além da cepa de referência ATCC: Staphylococcus aureus (ATCC 25923). As cepas clínicas foram isoladas da conjuntiva (Corynebacterium spp. e Staphylococcus spp., negativas para coagulase) e da córnea (Staphylococcus aureus).
As culturas foram armazenadas em glicerol a 10% (v/v) a −80 °C. As cepas bacterianas foram cultivadas aerobicamente em MHA a 37 °C por 18 h; subsequentemente, a cultura bacteriana foi preparada inoculando uma única colônia isolada de uma cultura pura em MHA.
Ensaio de Difusão em Ágar
O método de difusão em ágar foi empregado para avaliar a eficácia antimicrobiana do TTO. Uma suspensão microbiana de 0,5 McFarland foi preparada para cada microrganismo e então introduzida em placas de MHA usando um swab de algodão estéril. No total, 25 µL de TTO livre em diferentes concentrações (895 mg/mL a 56 mg/mL) foram testados em triplicata. A zona de inibição produzida por cada microrganismo foi observada após 24 h e medida usando um paquímetro Vernier.
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)
A atividade antimicrobiana do TTO foi inicialmente avaliada usando o protocolo do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para suscetibilidade antimicrobiana por difusão em ágar.
A CIM foi definida como a menor concentração de TTO sem crescimento visível, e a CBM foi definida como a menor concentração que reduz o inóculo inicial em ≥99,9%.
Na fase subsequente, a CIM e a CBM foram determinadas pelo método de microdiluição. Os microrganismos isolados foram cultivados em MHA a 37 °C até atingirem a fase de crescimento exponencial. Diluições seriadas de TTO foram preparadas em uma placa de 96 poços, enquanto microplacas de 96 poços de fundo chato foram preenchidas com 100 µL de MHB por poço, exceto na primeira fileira, que continha 200 µL de TTO.
Para superar a insolubilidade do TTO no meio, este foi suplementado com detergente Tween 80 na concentração final de 0,05%. Uma suspensão bacteriana diluída foi adicionada a cada poço para atingir uma concentração de ~106 unidades formadoras de colônias (UFC/mL). Controles foram realizados em paralelo.
Curvas de Morte Bacteriana
As curvas de morte temporal ilustraram a eliminação bacteriana ao longo do tempo em função da concentração de TTO. O protocolo do CLSI foi seguido. A determinação é feita pela contagem do número de células viáveis em diferentes tempos, submetendo o inóculo bacteriano ao TTO. O perfil bactericida foi estabelecido quando houve uma diminuição de 3 unidades logarítmicas em um determinado tempo. As curvas de morte bacteriana foram elaboradas tomando como ponto de partida os resultados obtidos na determinação da CIM.
Culturas bacterianas na fase de crescimento exponencial foram suspensas em MHB até atingirem uma concentração de aproximadamente ~108 UFC/mL. Em seguida, o inóculo foi ajustado para uma concentração de ~106 UFC/mL para ser inoculado contra as diferentes diluições de TTO. As contagens de viabilidade bacteriana foram realizadas nos tempos 0, 1, 2, 3 e 4 h de incubação a 37 °C por 24 h. Diferentes alíquotas de cada amostra foram coletadas e diluições seriadas foram realizadas.
As curvas de letalidade foram representadas graficamente expressando o log10 UFC/mL em função do tempo.
2.3.2. Avaliação da Atividade Antibiofilme
Ensaio de Cristal Violeta
Partindo de culturas frescas, foi realizada uma diluição em TSB, ajustando a concentração do inóculo para ~106 UFC/mL. Para induzir a formação de biofilme, 200 μL dessa suspensão foram adicionados a cada poço de uma placa de poliestireno estéril e incubados por 24 h a 35 °C com agitação contínua (130 rpm). Posteriormente, uma vez formado o biofilme, o sobrenadante foi descartado e os poços foram lavados três vezes com 200 μL de tampão PBS para remover as células planctônicas. Soluções foram preparadas em TSB em diferentes concentrações % v/v (0,8; 1,5; 12,5 e 25). Após a lavagem final, 200 μL dessas soluções foram adicionados e a placa foi incubada por 24 h a 35 °C em um agitador com agitação contínua a 130 rpm. Finalmente, a biomassa do biofilme foi analisada em triplicata utilizando o método de espectrofotometria de absorbância em um leitor de microplacas (Thermo Scientific—Multiskan FC, Munique, Alemanha). Para quantificar a biomassa do biofilme, foi empregado o ensaio de coloração com violeta de cristal (CV) por meio de um leitor de microplacas (Thermo Scientific—Multiskan FC). A porcentagem de redução da biomassa do biofilme foi calculada em relação à média da OD570 obtida nos poços que não foram incubados com TTO.23 A redução da biomassa do biofilme (%) foi calculada com base no controle relevante aplicando a seguinte equação: redução % = [(Abs0 − Absx)/Abs0] × 100, onde Abs0 ~570 é a absorbância dos controles aos quais não foi adicionado tratamento com TTO, e Absx ~570 corresponde à absorbância da amostra após a aplicação do tratamento com TTO.
MTT em Biofilmes Montados
A viabilidade bacteriana foi avaliada utilizando sais de tetrazólio, onde estes são reduzidos a formazano na presença de células vivas, e sua absorbância pode ser medida a 570 nm. A exposição dos biofilmes ao tratamento com TTO e aos controles foi realizada conforme descrito acima. Em seguida, as amostras foram lavadas com 200 μL de reagente MTT (200 μg/mL em PBS) adicionado a cada poço e incubadas em condições de escuridão por 3 h a 35 °C. Depois, o sobrenadante foi descartado, 150 μL de DMSO foram adicionados para solubilizar a formação de cristais, e a absorbância foi registrada em um leitor de microplacas (Thermo Scientific—Multiskan FC). A viabilidade (%) foi calculada conforme descrito acima.
2.4. Atividade Antioxidante do TTO
O potencial antioxidante tanto do TTO livre quanto microencapsulado foi medido utilizando o método DPPH. O potencial de sequestro de radicais livres DPPH foi determinado de acordo com o método de Brand-Williams et al., com quantidades iguais de TTO e microcápsulas. A atividade antioxidante foi determinada preparando 5 diluições (1, 10, 100, 500 e 1000 μg/mL). Como controle, várias soluções de ácido ascórbico foram empregadas devido à sua conhecida capacidade antioxidante. A análise foi realizada em uma microplaca adicionando 2 mL da solução e 2 mL de solução metanólica de DPPH. Após 30 min de incubação à temperatura ambiente no escuro, a absorbância foi medida a 517 nm usando um espectrofotômetro (Analytik Jena, Specord S600, Jena, Alemanha) com um leitor de microplacas.
2.5. Preparação de Microcápsulas por Spray-Drying
2.5.1. Preparação das Emulsões
As emulsões (1 e 2) foram preparadas usando MDX e AG como carreador (material de parede). MDX e AG foram previamente dissolvidos em água destilada a 50 °C por 1 h e deixados em repouso por 24 h à temperatura ambiente. No dia seguinte, SD foi adicionado como lubrificante. SD, MDX e AG foram usados em uma proporção de 2:1:1, respectivamente. Para as preparações das emulsões, o TTO foi incorporado na emulsão de material de parede usando um homogeneizador de alta potência (Proscientific PRO 250, Oxford, Reino Unido) a 24.000 rpm por 5 min. Imediatamente após o processo de emulsificação, a emulsão de TTO foi seca por spray drying. A representação esquemática do processo de formação da microencapsulação está representada na Figura 1.
2.5.2. Spray Drying
O spray drying foi realizado usando um Mini Spray Dryer de escala laboratorial (Büchi B-290, Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suíça). As amostras foram atomizadas com uma corrente de ar quente na câmara de secagem. Foi utilizado um bico de dois fluidos com diâmetro de abertura da tampa de 0,5 mm. Este tipo de bico opera no princípio básico de utilizar ar de alta velocidade para triturar o líquido, resultando em partículas líquidas menores e maiores taxas de fluxo. Os seguintes parâmetros foram fixados. Para a emulsão 1: bomba 10, aspirador 100; Q-flow, 600 L/h; temperatura de entrada, 130 °C; e temperatura de saída, 100 °C. Os mesmos parâmetros foram usados para a emulsão 2, exceto pela temperatura de entrada, que foi de 120 °C, e pela bomba, que foi 7, respectivamente.
2.5.3. Determinação do Rendimento de Microencapsulação (EY), Eficiência de Microencapsulação (ME) e Taxa de Incorporação de Óleo (ER)
O EY (%) foi calculado como a razão entre os sólidos recuperados (g) após o processo de spray drying e os sólidos iniciais da formulação (g) usando a Equação (1).
O teor de óleo teórico foi determinado usando a Equação (2), onde Moil, MMX, MAG e MSD são as massas (g) de TTO, MX, AG e SD adicionados no sistema, respectivamente.
A ME (%) foi calculada como a razão entre o teor total de óleo obtido no interior das microcápsulas e o teor de óleo na superfície (Equação (3)). Para medir o teor total de óleo, uma amostra de microcápsulas (100 mg) foi colocada em 15 mL de etanol anidro. Após sonicação por 1 h, as microcápsulas foram filtradas e lavadas com 10 mL e depois mais 5 mL de etanol. Todo o filtrado foi reunido. Além disso, para medir o teor de óleo na superfície, 100 mg de microcápsulas foram colocados em um funil e lavados com 5 mL de etanol 3 vezes. Ambos os filtrados foram reunidos para medir o teor de óleo. A absorbância foi medida com um espectrofotômetro UV/Vis, e o teor total de óleo na amostra foi calculado de acordo com a equação padrão.

A taxa de incorporação de óleo ER foi definida de acordo com a Equação (4). M2 foi a massa total de óleo obtida em 100 mg de microcápsulas, e M1 foi a massa de óleo obtida na superfície de 100 mg de microcápsulas.

2.5.4. Análises de Tamanho de Partícula

A distribuição do tamanho de partícula foi medida usando um analisador de distribuição de tamanho de partícula por dispersão a laser (Horiba Partica LA-960, Kyoto, Japão).
O cálculo do span é o formato mais comum para expressar a largura da distribuição.
O valor do span foi calculado aplicando a seguinte equação (Equação (5)): onde d10, d50 e d90 correspondem aos diâmetros em 10, 50 e 90% da distribuição cumulativa do tamanho de partícula.

2.5.5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A morfologia e as características da superfície das microcápsulas secas por atomização foram avaliadas usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) (ZEISS, Ʃigma, Oberkochen, Alemanha) operada a 5 kV com ampliações de 5000× nos Laboratórios Lamarx (Universidad Nacional de Córdoba, Argentina). Anteriormente, as amostras foram fixadas em fita adesiva dupla face montada em suportes de MEV e metalizadas com ouro/paládio sob vácuo.

2.5.6. Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)

A análise de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) do TTO em sua forma pura, bem como da mistura de material de parede e estruturas após a secagem por atomização, foi realizada em uma gota de cada amostra. O equipamento utilizado foi um CARY 630 FTIR (Agilent Technology, Santa Clara, CA, EUA), cobrindo uma faixa de 500 a 4000 cm−1 com resolução de 3 cm−1. Foram realizadas dezesseis varreduras para cada amostra analisada.

2.5.7. Triagem Antimicrobiana do TTO Microencapsulado
O efeito antibacteriano das micropartículas foi avaliado pela liberação completa do TTO encapsulado contra as cepas previamente mencionadas S. aureus e S. aureus ATCC. Para o ensaio, a Formulação 1 foi selecionada, e tubos foram preparados com amostras correspondentes a 50, 100, 200 e 300 mg de microcápsulas com 0,5 mL de DMSO e 0,5 mL de MHB. Em seguida, a amostra foi sonicada por 1 h e depois centrifugada a 10.000 RPM a 5 °C por 10 min (ThermoST16R). Essas amostras foram inoculadas com 1 mL de suspensão bacteriana para atingir uma concentração de aproximadamente ~10⁶ UFC/mL com o objetivo de avaliar a CIM e a CBM. Controles paralelos foram realizados em MSA.

3. Resultados e Discussão

3.1. Análise por CG-EM do TTO e do TTO Encapsulado

A composição da amostra comercial de TTO utilizada foi comparada com a relatada na literatura. A porcentagem do marcador químico estabelecido pela ISO 4730:2017, terpinen-4-ol, foi determinada como 44,8%, assim como outros componentes destacados (Figura 2A). É importante ressaltar que o o-cimeno, um indicador de decomposição, foi detectado em baixa porcentagem nesta análise.

Por outro lado, após a microencapsulação, a composição do TTO no interior da cápsula (Formulação 1) também foi analisada, e uma impressão digital semelhante foi observada, onde o terpinen-4-ol foi o principal componente (52,1%) (Figura 2B).

3.2. Atividade Biológica e Antioxidante do TTO Livre

3.2.1. Atividade Antimicrobiana do TTO

A atividade antimicrobiana do TTO foi avaliada em diferentes concentrações. A zona de inibição produzida por cada microrganismo (Tabela 1) foi medida usando um paquímetro Vernier.

O método de difusão em ágar foi aplicado para testar as propriedades antimicrobianas do TTO, e este mostrou atividade contra os microrganismos estudados. Observou-se que o TTO inibiu o crescimento celular. À medida que a concentração de TTO aumenta, a zona de inibição (halo) do crescimento microbiano também aumenta. O método de difusão em ágar é comumente usado como um teste rápido para determinar a suscetibilidade ou resistência potencial a um antibiótico. Os resultados podem ser comparados com os de Mumu (2018), onde zonas de inibição foram observadas pelo TTO contra isolados bacterianos clínicos após 24 h de incubação. Embora o estudo mostre que o TTO é eficaz contra cepas Gram-positivas e Gram-negativas, nosso estudo encontrou valores de inibição superiores aos encontrados naquele estudo para isolados de S. aureus. No entanto, para novas moléculas, não existem medidas de referência padrão para comparações, portanto, o método de difusão em ágar torna-se uma ferramenta qualitativa para verificar a inibição produzida por essas moléculas ativas, devendo ser usado apenas como um teste de triagem.

3.2.2. CIM/CBM

Após usar o método de difusão em ágar como triagem, a atividade antimicrobiana foi avaliada de forma mais precisa por meio de determinações de CIM e CBM utilizando a técnica de diluição em caldo. Os valores são mostrados na Tabela 2.
A menor diluição para CIM nos microrganismos testados foi de 0,2% v/v (1,8 mg/mL) de TTO, enquanto que para CBM foi de 0,4% v/v (3,5 mg/mL).

Tanto as cepas clínicas quanto de coleção de S. aureus apresentaram os mesmos valores de CIM e CBM, enquanto concentrações mais elevadas foram necessárias para Staphylococcus spp. coagulase negativa atingir efeitos inibitórios e bactericidas. No entanto, esses valores estão alinhados com relatos de outros autores. Além disso, foi descrito que S. aureus requer concentrações entre 0,5–1,25% v/v (4,5–11,2 mg/mL) para CIM e 1–2% v/v (9,0–18,0 mg/mL) para CBM, enquanto, neste estudo, o mesmo efeito foi encontrado com concentrações de 0,2% v/v (1,8 mg/mL) e 0,4% v/v (3,5 mg/mL), respectivamente. Quanto ao isolado de Corynebacterium spp., não foi encontrado CBM, enquanto a CIM foi encontrada na concentração de 0,4% (3,5 mg/mL).

De acordo com a literatura, foi relatado que as bactérias são suscetíveis ao TTO em concentrações de 1,0% (9,0 mg/mL) ou menos. No entanto, valores de CIM mais elevados foram divulgados para outros isolados Gram-positivos, como Staphylococcus e Micrococcus, e isolados Gram-negativos, como Pseudomonas aeruginosa.

O TTO é predominantemente de natureza bactericida, embora possa ser bacteriostático em concentrações mais baixas.

Os estudos sobre óleos essenciais como agentes antimicrobianos têm se concentrado em suas capacidades de matar diferentes tipos de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e vírus. Os resultados mostram que muitos óleos essenciais possuem potentes atividades antimicrobianas e podem ser eficazes contra uma variedade de patógenos, incluindo algumas cepas bacterianas resistentes a antibióticos convencionais. Além disso, para que um OE seja considerado um composto ativo, o extrato deve ter uma CIM aproximada de menos de 1 mg/mL.

3.3. Curvas de Morte Bacteriana do TTO Livre

As curvas de morte bacteriana são um método empregado para determinar as atividades in vitro de diferentes concentrações de um composto contra um microrganismo ao longo de um período específico. A Sociedade Americana de Microbiologia estabeleceu que qualquer nova abordagem que alegue ser antimicrobiana ou antibacteriana deve alcançar uma redução de pelo menos 3 logaritmos na UFC. Essa redução indica que o agente antimicrobiano foi eficaz em eliminar aproximadamente 99,9% ou mais da cultura bacteriana, demonstrando sua atividade bactericida.

Diversas concentrações de TTO foram utilizadas para avaliar sua eficácia ao longo do tempo como agente antimicrobiano. As cepas selecionadas foram isoladas de infecções oculares, conforme mencionado anteriormente (Seção 2.3.1), e uma cepa de referência também foi incluída. A Figura 3 apresenta os resultados desses experimentos juntamente com seus respectivos controles. No caso de Staphylococcus coagulase-negativa, a morte bacteriana foi observada com 0,2% de TTO após 1 h. Por outro lado, para S. aureus ATCC e S. aureus, o mesmo efeito foi observado com a mesma concentração de TTO após 2 h. No entanto, nenhuma morte bacteriana foi observada para Corynebacterium spp.
Li et al. 2016 observaram uma tendência na qual, com o aumento das concentrações de TTO, a taxa de morte celular e a duração da fase de lag de crescimento aumentaram correspondentemente. Esses achados indicaram que o TTO exibiu efeitos antibacterianos dependentes do tempo e da concentração.

O mecanismo de ação do TTO é atribuído principalmente aos seus componentes monoterpenoides, que são os principais constituintes bioativos responsáveis por suas propriedades antimicrobianas. Os monoterpenoides são uma classe de compostos orgânicos naturais com uma estrutura molecular característica. Eles demonstraram potentes atividades antimicrobianas contra uma ampla gama de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e vírus.

3.4. Atividade Antibiofilme do TTO Livre

O biofilme é considerado um fator de virulência que promove a sobrevivência, resistência e capacidade patogênica dos microrganismos, complicando os tratamentos para infecções e aumentando significativamente a gravidade das doenças. Com o objetivo de explorar a eficácia do TTO, decidimos testar o efeito antibiofilme. A formação de biofilme foi induzida em todas as cepas bacterianas oculares. A geração de biofilme após 24 h foi quantificada pelo ensaio de CV, indicando que todas as cepas apresentaram formação positiva de biofilme, ~OD570 > 0,24. O desempenho do TTO contra biofilmes maduros foi avaliado usando ensaios de CV e MTT, sendo que o primeiro fornece informações sobre a quantificação geral da biomassa, enquanto o último avalia a viabilidade bacteriana, proliferação e citotoxicidade celular. A Figura 4 exibe os resultados desses experimentos.

Em todas as cepas, foi observada uma redução na biomassa do biofilme entre 30 e 70% quando tratadas com TTO. Não foram observadas diferenças na redução da biomassa entre as diferentes concentrações quando os ensaios de CV foram realizados. No entanto, quando a viabilidade celular foi avaliada usando MTT, observou-se maior eficácia quando os tratamentos aplicados estavam em concentrações mais baixas de TTO. Uma redução de mais de 80% foi alcançada em tratamentos com 1,6% v/v de TTO em 3 (A, B e D) das quatro cepas utilizadas. Por outro lado, a C exigiu uma concentração mais diluída (0,8% v/v) para alcançar maior eficácia em comparação com os demais tratamentos. Existem alguns precedentes, considerando que a concentração mínima de erradicação de biofilmes maduros formados por bactérias S. aureus foi duas vezes maior que a CIM, mas nunca superior a 1% de TTO. Além disso, o uso de óleos essenciais em baixas concentrações tem sido frequentemente eficaz na inibição da formação de biofilmes em cepas patogênicas.

3.5. Atividade Antioxidante

Antes da encapsulação, o TTO apresentou atividade antiradicalar acima de 80%. Após o processo de encapsulação, a porcentagem foi de 60%.
As propriedades antioxidantes de compostos naturais podem ajudar a proteger as células dos danos causados pelos radicais livres, que são moléculas instáveis que podem prejudicar as células e contribuir para o envelhecimento e o desenvolvimento de doenças. Neste estudo, diferentes concentrações de TTO foram testadas, e o ácido ascórbico foi utilizado como controle, conhecido por sua propriedade antioxidante. Uma atividade de 40% foi observada na concentração de 1 µg/mL de TTO, enquanto uma atividade de 90% foi alcançada na concentração de 1 mg/mL em um estudo similar conduzido por Kim et al., 2004, em solução metanólica, obtendo resultados comparáveis, com o metanol apresentando aproximadamente 80% de atividade de sequestro de radicais livres.
Em relação à capacidade antioxidante do TTO microencapsulado, a atividade testada foi mantida na mesma proporção.
3.6. Microencapsulação do TTO
3.6.1. Rendimento de Microencapsulação (RM), Eficiência de Microencapsulação (EM) e Taxa de Incorporação de Óleo (TIO)
A porcentagem de recuperação de micropartículas (% rendimento de microencapsulação) é a quantidade de pó obtida no coletor do secador por atomização em relação à quantidade total de sólidos antes do processo. O RM após o procedimento de secagem por atomização foi estimado em 80–85%.
O aumento na quantidade inicial de sólidos também poderia levar a um aumento no rendimento de pó. No entanto, um estudo envolvendo a microencapsulação de óleo essencial de lavanda mostrou que uma alta concentração de sólidos pode diminuir o teor de água da emulsão, reduzindo o tempo necessário para formar uma membrana na superfície da partícula durante a secagem por atomização. Isso resultou em uma recuperação eficiente de pó.
A EM foi de cerca de 90–95% para ambas as preparações de microcápsulas. A EM do TTO é a razão entre o TTO total dentro das microcápsulas e o TTO superficial. A TIO, calculada como a razão entre o TTO total e o TTO teórico, foi de cerca de 40%. Esse valor indicou a capacidade de carga e o grau de sucesso do revestimento em prevenir os efeitos negativos dos óleos essenciais, como a volatilização. Para aplicações medicinais, não é prático usar uma formulação com baixas quantidades de ingredientes farmacêuticos ativos, mesmo que forneçam altas eficiências de encapsulamento, pois uma quantidade significativa de polímero seria necessária para atingir a dose terapêutica necessária.
3.6.2. Tamanho de Partícula e Caracterização Morfológica das Microcápsulas de TTO
As amostras foram atomizadas com uma corrente de ar quente em uma câmara de secagem, tornando possível obter micropartículas sólidas quando o OE foi aprisionado dentro de um filme de material encapsulante.
O tamanho de partícula é importante, pois pode afetar a eficiência da microencapsulação, bem como a interação com outros fluidos. O tamanho de partícula de uma microcápsula varia de 1 a 1000 µm, dependendo do método de fabricação e de sua finalidade específica. O tamanho de partícula é considerado um aspecto crítico para encapsular substâncias e é um fator importante na liberação controlada de agentes bioativos.
Todos os parâmetros descritos nos métodos foram analisados (Tabela 3), resultando em um diâmetro médio (d50) de 6 µm para ambas as formulações. O valor mais relevante foi o de d90, que caracteriza a maior parte da população de partículas. Os valores de D90 obtidos foram 12,90 ± 0,30 µm e 12,20 ± 0,30 µm para as Formulações 1 e 2, respectivamente, refletindo um tamanho de partícula uniforme, conforme esperado para que sejam consideradas micropartículas. Além disso, o valor de span calculado demonstra uma distribuição estreita do tamanho de partículas para ambas as formulações em todas as réplicas.
Uma distribuição de partículas ligeiramente mais ampla foi registrada, variando entre 8 e 15 μm, ao microencapsular o OE de Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) e a microencapsulação do óleo essencial de Origanum vulgare L. (7–18 μm) utilizando uma combinação de MX, AG e amido modificado.
Em nosso estudo, o menor tamanho de partícula foi registrado com a Formulação 2 (12,20 μm). No entanto, não foram encontradas diferenças significativas no tamanho de partícula em comparação com a Formulação 1 quando foram feitas variações nos parâmetros do equipamento antes da secagem por atomização. Por essas razões, ambas as formulações poderiam ser utilizadas como estratégias potenciais para microencapsular o TTO.
Com o objetivo de garantir a administração adequada de um ingrediente ativo microencapsulado, é aconselhável que o tamanho da micropartícula seja suficientemente pequeno.
As imagens de MEV obtidas desempenham um papel crucial, não apenas na verificação dos dados de tamanho de partícula adquiridos, mas também na avaliação das características morfológicas que elucidam os atributos funcionais das partículas, como sua capacidade de reter e proteger o ingrediente bioativo.
As imagens capturadas revelaram estruturas esféricas individuais distintas com superfícies lisas, desprovidas de quaisquer rachaduras ou fissuras que pudessem permitir a liberação do TTO. Isso garante a preservação sustentada de sua funcionalidade ao longo do tempo.
As imagens de MEV são consistentes com o valor de span obtido. Embora seja evidente uma faixa de tamanhos, que é uma característica das partículas produzidas por secagem por atomização devido a fatores como o material utilizado, a formulação e o processo de atomização, a faixa de tamanho observada permanece relativamente estreita. Em um estudo envolvendo a microencapsulação do óleo essencial de lavanda, observou-se que partículas menores se fundiam com as maiores, como evidente nas imagens B e D.
Os tamanhos das partículas extraídos das imagens de MEV foram medidos manualmente, identificando a maior dimensão correspondente. Os resultados indicaram um diâmetro de partícula variando de 3 a 19 µm (Figura 5C–F), com a maioria situando-se na faixa intermediária. Isso reafirma a presença de uma distribuição estreita de tamanhos de partículas. Considerando que o diâmetro hidrodinâmico, determinado por DLS, é derivado da análise da amostra em estado líquido (sem afetar o estado de agregação da amostra), enquanto o diâmetro medido para as partículas por MEV exige a preparação da amostra em um suporte, como um filme fino, seguido de secagem com deposição adicional de carbono, a consistência entre os resultados é altamente louvável. Isso ressalta ainda mais que as partículas são representadas com precisão pelo modelo de esfera sólida.

Os espectros de FTIR do TTO e das microcápsulas com e sem TTO são apresentados na Figura 6.

O espectro do TTO revelou um pico de vibração de estiramento correspondente à ligação C-H em 2960 cm−1. Além disso, exibiu numerosos picos na faixa de comprimento de onda de 1550 cm−1 a 600 cm−1. O pico em 1126 cm−1 foi atribuído ao pico de absorção de vibração de estiramento da ligação C-O no álcool terciário de terpenos e terpineol, respectivamente. O pico em 924 cm−1 correspondeu ao pico de absorção de vibração de deformação de uma ligação dupla insaturada.

Para as microcápsulas sem TTO, picos característicos de hidroxila (estiramento O-H) foram observados em torno de 3332 cm−1. Picos correspondentes ao estiramento C-H do grupo carboxílico apareceram em torno de 2929 cm−1. Picos correspondentes a grupos amina ou carbonila apareceram em 1608 cm−1. Para as microcápsulas com TTO, picos característicos de hidroxila (estiramento O-H) foram observados em torno de 3298 cm−1. Picos correspondentes ao estiramento C-H do grupo carboxílico apareceram em torno de 2930 cm−1. Picos correspondentes a grupos amina ou carbonila apareceram em 1603 cm−1. Todos esses picos foram característicos do material de parede utilizado no projeto da formulação. Essas bandas representando os materiais de revestimento foram evidentes nos espectros das microcápsulas. Isso implica que esses carboidratos mantiveram suas estruturas durante o processo de secagem.

Os espectros das microcápsulas com e sem TTO confirmaram a microencapsulação bem-sucedida por secagem por pulverização, sem TTO presente nas superfícies das microcápsulas.

3.7. Triagem Antimicrobiana do TTO Microencapsulado

Uma cepa clínica e uma cepa de referência de S. aureus foram empregadas para avaliar a eficácia antimicrobiana das microcápsulas de TTO. Amostras bacterianas foram expostas a diferentes concentrações de microcápsulas (50, 100, 200, 300 e 400 mg) por 24 h.
Em seguida, as suspensões celulares foram diluídas 10 vezes e plaqueadas em MHA e, em paralelo como controle, as bactérias foram coletadas em um meio seletivo e diferencial, como MSA, para estimular o crescimento adequado de S. aureus. Em relação aos meios de cultura, foi observada inibição do crescimento, a partir de 100 mg de microcápsulas para S. aureus ATCC e 200 mg para S. aureus. Várias concentrações da Formulação 1 foram meticulosamente empregadas para avaliar sua eficácia antimicrobiana ao longo de um período de 24 h. As cepas de teste escolhidas para esta avaliação incluíram uma cepa de referência de S. aureus ATCC e um isolado clínico de S. aureus. A representação gráfica na Figura 7 ilustra eloquentemente o impacto profundo da Formulação 1 na viabilidade celular, exibido ao longo do período de incubação. Os dados apresentam um perfil bactericida notoriamente evidente para ambas as cepas bacterianas mencionadas, destacando uma redução significativa na viabilidade bacteriana, superando uma impressionante redução de 99,99% em relação ao grupo controle. Esses resultados servem como evidência convincente da liberação bem-sucedida e eficaz do composto ativo, TTO, dentro da Formulação 1, solidificando seu potencial como um potente agente antimicrobiano.
4. Conclusões
O TTO demonstrou eficácia contra cepas bacterianas isoladas de infecções oculares, incluindo Corynebacterium spp., Staphylococcus spp. negativos para coagulase e Staphylococcus aureus, bem como uma cepa de referência de Staphylococcus aureus (ATCC 25923). O TTO exibiu uma redução substancial na biomassa do biofilme, variando de 30% a 70%.
A técnica de microencapsulação utilizada no estudo preparou com sucesso formulações contendo TTO com altos rendimentos de encapsulação, eficiência de microencapsulação e taxas de incorporação, além de preservar as atividades antioxidante e antimicrobiana. A análise de FTIR e os resultados de quantificação demonstram a não aparição de TTO nas superfícies das microcápsulas em nenhuma das formulações, reafirmando que a microencapsulação por spray drying usando biopolímeros naturais é uma abordagem promissora para superar as limitações do TTO, como alta volatilidade e suscetibilidade à oxidação, e para melhorar a estabilidade e o prazo de validade.
Nossas formulações apresentaram tamanhos de partícula uniformes. As imagens de MEV forneceram confirmação visual dos nossos dados de tamanho de partícula, revelando estruturas esféricas bem definidas com superfícies lisas, garantindo a preservação sustentada da funcionalidade do OE. A distribuição do tamanho de partícula observada permaneceu relativamente estreita, apesar de alguma variação, o que é característico de partículas secas por spray.
Os resultados do estudo destacam o potencial terapêutico significativo do TTO e de suas micropartículas para o tratamento de infecções oculares.
Nota de Isenção de Responsabilidade/Nota do Editor: As declarações, opiniões e dados contidos em todas as publicações são de responsabilidade exclusiva do(s) autor(es) e colaborador(es) individual(is) e não do MDPI e/ou do(s) editor(es). O MDPI e/ou o(s) editor(es) se isentam de responsabilidade por qualquer dano a pessoas ou propriedades resultante de quaisquer ideias, métodos, instruções ou produtos mencionados no conteúdo.
Contribuições dos Autores
F.A.M. executou os experimentos, analisou os dados e revisou o manuscrito; S.R. auxiliou na realização dos experimentos, analisou os dados, escreveu e revisou o manuscrito; S.G.B. analisou os dados de microencapsulação e revisou o manuscrito; A.G.G. co-escreveu e revisou o manuscrito; M.G.V. auxiliou nos dados analíticos, forneceu suporte técnico e teórico, e co-escreveu e revisou o manuscrito; S.R.M. auxiliou nos experimentos microbiológicos e forneceu suporte técnico e teórico e revisou o manuscrito; e S.D.P. delineou a pesquisa e escreveu e revisou o manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Não aplicável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Revisão sobre extração de óleos essenciais de plantas aromáticas e medicinais: Técnicas, desempenho e análise econômica
O progresso dos óleos essenciais como potenciais agentes terapêuticos: Uma revisão
Caracterização química de óleos essenciais e investigação de algumas atividades biológicas: Uma revisão crítica
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Uma estratégia geral para a fabricação em uma etapa de microcápsulas biocompatíveis com liberação ativa controlada
Representação esquemática da preparação da emulsão e microencapsulação do Óleo da Árvore do Chá (TTO).
Perfil de GC-MS do óleo da árvore do chá (TTO). (A) TTO antes da microencapsulação. (B) TTO encapsulado. 1 = terpinen-4-ol, 2 = terpinoleno, 3 = γ-terpineno e 4 = α-terpineol.
Curvas de morte bacteriana de (A) S. aureus; (B) S. aureus ATCC; (C) Staphylococcus spp. coagulase negativa; e (D) Corynebacterium spp. As suspensões bacterianas foram incubadas por 1, 2, 3, 4 e 24 h com TTO ou sem TTO (concentração final 0,2% v/v). Linhas tracejadas indicam controles, enquanto linhas sólidas indicam tratamentos em cada painel. As amostras foram realizadas em triplicata. As barras de erro representam o desvio padrão de três experimentos independentes. TTO 0,2% v/v.
Atividade do TTO livre sobre biofilme formado por (A) S. aureus; (B) S. aureus ATCC; (C) Staphylococcus spp. coagulase negativa; e (D) Corynebacterium spp. Cada barra representa a porcentagem de redução de biomassa avaliada com CV e a viabilidade celular avaliada com MTT. Os dados representam a média ± DP de seis réplicas de três experimentos independentes.
Fotografias de MEV: (A) Formulação 1 com aumento de 300×. (B) Formulação 1 com aumento de 2,40 k×. (C) Formulação 1 com aumento de 1,00 k×. (D) Formulação 2 com aumento de 300×. (E) Formulação 2 com aumento de 2,40 k×. (F) Formulação 2 com aumento de 1,00 k×.
Espectros de FTIR de amostras de Óleo da Árvore do Chá (TTO) e microcápsulas com TTO e sem TTO.
Ensaio de viabilidade representando a inibição do crescimento de S. aureus (vermelho) e S. aureus ATCC (verde) quando expostos a diferentes concentrações da Formulação 1 a 37° por 24 h. Os dados representam a média ± desvio padrão (DP) de três experimentos independentes (n = 3).
Halo de difusão (mm) da inibição do óleo da árvore do chá (% v/v) contra cepas bacterianas.
Método de Difusão em Ágar (mm) 1 Micro-organismo TTO 2 % v/v 100 50 25 12,5 6,25 S. aureus 31 ± 2 25 ± 2 18 ± 2 14 ± 1 NH 3 S. aureus ATCC 29 ± 2 23 ± 1 15 ± 3 12 ± 2 10 ± 1 Staphylococcus spp. coagulase negativa 31 ± 1 18 ± 3 11 ± 2 NH NH Corynebacterium spp. 21 ± 1 16 ± 1 14 ± 1 11 ± 2 8 ± 2
1 Milímetros de inibição. 2 Óleo da árvore do chá. 3 Sem presença de halo.
Valores de CIM e CBM (% v/v) do óleo da árvore do chá contra cepas bacterianas.
CIM CBM Micro-organismo S. aureus 0,2% v/v (1,8 mg/mL) 0,4% v/v (3,5 mg/mL) S. aureus ATCC 0,2% v/v (1,8 mg/mL) 0,4% v/v (3,5 mg/mL) Staphylococcus spp. coagulase negativa 0,4% v/v (3,5 mg/mL) 0,8% v/v (7,0 mg/mL) Corynebacterium spp. 0,4% v/v (3,5 mg/mL) - *

• Não pôde ser medido.
  Distribuição do tamanho de partículas das Formulações 1 e 2.
  Tamanho de Partícula (μm) Média D10 Média D50 Média D90 Média Span Formulação 1 6,17 ± 0,10 9,00 ± 0,20 12,90 ± 0,30 0,740 ± 0,002 Formulação 2 5,96 ± 0,09 8,56 ± 0,10 12,20 ± 0,30 0,720 ± 0,003