pmid: "34046319"
title: "Atividade antiglicação e antitumoral de"
authors: "Figueiredo CCM, Gomes AC, Granero FO, Bronzel Junior JL, Silva LP, Ruiz ALTG, da Silva RMG"
journal: "Avicenna journal of phytomedicine"
pubdate: "2021"
doi: ""
source: "PMC Full Text"

Atividade antiglicação e antitumoral de

Autores

Figueiredo CCM, Gomes AC, Granero FO, Bronzel Junior JL, Silva LP, Ruiz ALTG, da Silva RMG

Periodico

Avicenna journal of phytomedicine (2021)

Conteudo

Atividade antiglicação e antitumoral do extrato seco de Tribulus terrestris
Objetivo:
Investigação do potencial antiglicação e antitumoral de extratos padronizados e enriquecidos com saponinas do fitoterápico Tribulus terrestris.
Materiais e Métodos:
Os procedimentos para a avaliação da atividade antiglicação dos extratos padronizado (TtSE) e enriquecido com saponinas (TtEE) de T. terrestris foram: determinação da mobilidade relativa em eletroforese (MRE), grupos amino livres usando o método OPA e fluorescência de produtos finais de glicação avançada (AGEs). A atividade antioxidante foi determinada pelo teste de eliminação do radical DPPH. A atividade antitumoral in vitro de TtSE e TtEE foi avaliada em linhagens de células tumorais humanas.
Resultados:
Os resultados foram obtidos por testes de antiglicação (MRE, método OPA e determinação da fluorescência de AGEs), utilizando BSA como proteína e ribose como agente de glicação, e ensaio antioxidante (teste DPPH); verificou-se que ambos os extratos de T. terrestris apresentam atividade antiglicação e antioxidante. Além disso, os extratos foram capazes de induzir a morte de mais de 50% das linhagens de células tumorais humanas.
Conclusão:
O presente estudo mostrou que os extratos padronizado e enriquecido com saponinas do fitoterápico T. terrestris apresentam ação antiglicação, antioxidante e antiproliferativa em linhagens de células tumorais humanas. O extrato enriquecido com saponinas demonstrou maior atividade antiglicação e antioxidante em comparação ao tipo padronizado.
Introdução
A glicação é um processo que envolve a adição não enzimática de açúcares redutores e/ou seus produtos de degradação reativos em grupos amino livres de proteínas, lipídios ou ácidos nucleicos, que pode ocorrer em condições fisiológicas e patológicas (Gugliucci et al., 2009). Esse processo resulta em alterações na estrutura e função dessas biomoléculas em células e tecidos corporais devido ao aumento de produtos finais de glicação avançada (AGEs). Os AGEs são uma classe heterogênea de moléculas que interagem com o receptor para AGEs e induzem o aumento do estresse oxidativo e de mediadores inflamatórios (Kouidrat et al., 2015). O acúmulo fisiológico de AGEs tem sido implicado no desenvolvimento e progressão de diferentes doenças crônicas, incluindo doenças cardiovasculares, insuficiência renal crônica, doenças neurodegenerativas, diabetes e câncer (Chhipa et al., 2019; Zeng et al., 2019).
Estudos indicaram que metabólitos secundários, como polifenóis, terpenos e compostos esteroidais presentes em medicamentos fitoterápicos, são capazes de reduzir a glicação não enzimática (Tian et al., 2019). Além disso, esses compostos têm sido associados à prevenção e ao tratamento de diferentes tipos de câncer (Majidinia et al., 2019; Sajadimaj et al., 2020). O estudo do uso de fitoterápicos pode beneficiar o tratamento de pacientes diabéticos tanto no controle da glicação quanto no desenvolvimento e progressão do câncer (Chhipa et al., 2019; Krishna et al., 2020). Tribulus terrestris tem sido estudado por sua ação preventiva e terapêutica em diferentes doenças devido a uma variedade de fitoquímicos como fenóis, terpenos e esteroides (saponinas) presentes em seus extratos (Majidinia et al., 2019; Sanagoo et al., 2019).
Tribulus terrestris Linn é uma erva dicotiledônea que pertence à família Zygophyllaceae e é amplamente cultivada na África, Austrália, Ásia e Europa (Qureshi et al., 2014). A medicina tradicional chinesa usa T. terrestris para melhorar a acuidade visual e como anticonvulsivante, enquanto a medicina herbal indiana aproveita suas propriedades diuréticas, tônicas e afrodisíacas (Chhatreet al., 2014). T. terrestris é comumente ingerido na forma de extrato, obtido das partes da folha e do caule ou de frutos que contêm principalmente glicosídeos esteroidais (saponinas) do tipo furostanol (Combarieu et al., 2003). Estudos demonstraram que a saponina protodioscina isolada de T. terrestris é um dos compostos mais ativos capazes de induzir um aumento na produção de testosterona (Su et al., 2009; Sivapalan, 2016).
Vários estudos farmacológicos revelaram que os extratos de T. terrestris têm diferentes efeitos, como cardioprotetor, hepatoprotetor, antitumoral (Angelova et al., 2013; El-Shaibany et al., 2015; Pokrywka et al., 2017; Sisto e Lisi, 2019), antiaterosclerótico (Li et al., 2013), antiartrítico (Mishra et al., 2013), antioxidante (Mohd et al., 2012), antimicrobiano (Akbal et al., 2018), propriedades analgésicas e anti-inflamatórias (Oh et al., 2012), e pode ser usado no tratamento de infecções orais e controle de cáries dentárias e doenças periodontais (Soleimanpour et al., 2015). Estudos mostraram que o extrato de T. terrestris é eficaz no tratamento da hiperglicemia in vivo e na inibição da α‐glicosidase e da aldose redutase in vitro (Lamba et al., 2011), e no tratamento da pancreatite em camundongos (Borran et al., 2017). Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar o potencial antiglicação e antitumoral de extratos padronizados e enriquecidos com saponinas de T. terrestris. Até onde sabemos, não existem dados sobre a correlação entre as atividades antiglicação e antitumoral. Estudos anteriores discutiram principalmente os compostos esteroidais (saponinas) presentes neste medicamento fitoterápico.
Materiais e Métodos
Preparação do extrato padronizado de Tribulus terrestris (TtSE)
O extrato seco do fitoterápico T. terrestris foi obtido diretamente de fornecedores de matéria-prima farmacêutica (FLORIEN, São Paulo, Brasil). O extrato seco padronizado contendo 43,21% de saponinas totais foi adquirido, acompanhado da certificação de qualidade física e microbiológica.
Preparação do extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris (TtEE)
O extrato de T. terrestris enriquecido em saponinas foi obtido de acordo com Dinchev et al. (2008) e Ren et al. (2015), onde10 g do TtSE foi adicionado a 250 ml de clorofórmio por 1 h sob agitação à temperatura ambiente. O extrato clorofórmico obtido foi filtrado e novamente extraído em Soxhlet utilizando250 mlde 70% de etanol por 1 h. O solvente foi removido do extrato e o extrato foi então liofilizado. O rendimento total do extrato enriquecido em saponinas foi determinado em gramas.
Determinação de saponinas totais
O conteúdo total de saponinas das diferentes amostras foi determinado pelo método gravimétrico de dupla extração descrito por Ezeabara et al. (2014) e Koomson et al. (2018). Aqui, 5 g da amostra em pó foram pesados e misturados com 50 ml de solução de etanol a 20% em um frasco. A mistura foi aquecida com agitação periódica em banho-maria por 90 min a 55ºC; em seguida, foi filtrada através de papel de filtro. O resíduo foi extraído utilizando 50 ml de etanol a 20%, e osextratos foram combinados, em seguida, reduzidos para cerca de 40 mla 90ºC, transferidos para um funil de separação e, finalmente, 40 ml de éter dietílico foram adicionados e agitados vigorosamente. A reextração particionada foi feita repetidamente até que a solução aquosa apresentasse uma camada de cor clara. As saponinas foram extraídas utilizando60 mlbutanol. Os extratos combinados foram lavados com solução de cloreto de sódio (NaCl) a 5% e esta solução foi evaporada em um prato de evaporação previamente pesado, seca a 60ºC em estufa de laboratório e repesada após resfriamento em um dessecador. O processo foi repetido duas vezes para obter uma porcentagem média. O conteúdo de saponinas foi calculado como porcentagem da amostra original. Porcentagem (%) de saponinas = (W2 - W1 / Peso da amostra) x 100; onde: W1 = peso do prato de evaporação e W2 = peso do prato de evaporação + amostra.
Determinação de saponinas por HPLC
A análise de saponinas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) foi realizada em uma coluna Kinetex C18 (150 x 2,1 mm, 5 μm) (Phenomenex Inc., Torrance, CA, EUA). A fase móvel foi composta por 0,1% v/v de ácido fórmico em acetonitrila (B) e 0,1% v/v de ácido fórmico em água ultrapura (A). O modo de eluição por gradiente foi realizado de 5-100% de B em A durante 40 min com uma vazão de 1 ml/min. A temperatura do forno da coluna foi ajustada para 40°C. As amostras foram monitoradas por um detector de Detecção Amperométrica Pulsada (PAD) na faixa de 200-800 nm. O volume de injeção foi de 2,0 μl.
Atividade antioxidante avaliada pelo teste de sequestro do radical DPPH
A atividade antioxidante foi medida pelo método DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) descrito por Rufino et al. (2010). Os experimentos foram realizados em triplicata para fins estatísticos. Soluções contendo 1 ml de tampão acetato (pH 5,5 e 100 mM), 1,25 ml de etanol Padrão Analítico (AS), 250 μl de solução de DPPH (500 μM) e 50 μl das amostras foram preparadas. TtSE e TtEE reagiram com DPPH por 30 min no escuro e a absorbância foi medida em espectrofotômetro (espectrofotômetro UV-Vis – Bel Photonics Brasil) a 517 nm. A atividade antioxidante foi calculada de acordo com a fórmula: Atividade antioxidante (%) = [(Controle-Amostras)/Controle] x 100. O ácido gálico foi utilizado como controle positivo na concentração de 100 μg/ml. TtSE e TtEE foram avaliados nas concentrações de 250, 500 e 1000 μg/ml.
Avaliação da atividade antiglicação
Avaliada a mobilidade relativa em eletroforese (RME)
A RME foi avaliada de acordo com a metodologia descrita por Miura et al. (1994). Albumina Sérica Bovina (BSA) (0,3 mg/ml de proteína) (Sigma-Aldrich, Brasil) foi diluída em tampão fosfato-salino (PBS) 10 mM, contendo ribose (400 mM) (Sigma-Aldrich, Brasil) e aminoguanidina (1 mM) (Sigma-Aldrich, Brasil) a 37°C por 72 h na presença ou ausência dos extratos (0,1 mg/ml). A SDS-PAGE foi realizada utilizando gel de empilhamento a 5% e gel de separação a 8%. Uma alíquota da solução de BSA glicada foi misturada com igual volume de tampão de amostra contendo dodecilbenzeno sulfonato de sódio (SDS – Labsynth, Brasil) (20 mg/ml de SDS, 30% de glicina (Sigma-Aldrich, Brasil), tampão Tris-HCl 0,25 M, pH 6,8) e fervida por 3 min. Da solução misturada, 15 μl foram aplicados no gel de empilhamento, e o gel de separação foi submetido a uma corrente constante de 30 mA, por aproximadamente 3 h. Após o processo de eletroforese, o gel foi fixado com ácido acético e então corado com Azul de Coomassie (R-250) (Sigma-Aldrich, Brasil). Os resultados foram observados na RME utilizando BSA. Concentrações finais de aminoguanidina (AMG) (1 mM) e BSA (0,3 mg/ml de proteína, sem adição do extrato) foram utilizadas como controles positivo e negativo, respectivamente.
Determinação de grupos amino livres
Os grupos amino livres das amostras glicadas foram determinados pelo método do orto-ftalaldeído (OPA) (Sigma-Aldrich, Brasil) (Fayle et al., 2001). O reagente OPA foi preparado imediatamente antes do uso, misturando-se 25 ml de borato de sódio 0,1 M, 2,5 ml de SDS 20%, 100 µl de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, Brasil) e 40 mg de OPA (dissolvidos em 1 ml de metanol) e ajustando o volume final para 50 ml com água destilada. Uma alíquota das amostras contendo 50 µg de BSA foi ajustada para 1 ml com reagente OPA, incubada por 2 min à temperatura ambiente e a absorbância foi obtida a 340 nm contra um branco contendo o reagente OPA. A BSA não tratada (controle) foi considerada como tendo 100% de grupos amino livres.
Determinação da fluorescência dos produtos finais de glicação avançada (AGEs)
A mesma mistura de reação utilizada para a determinação de grupos amino livres foi incubada a 37°C por 7 dias. A formação de AGEs foi determinada medindo-se suas características fluorescentes utilizando excitação e emissão máximas de 360 e 460 nm, respectivamente. O processo foi realizado em duplicata e os resultados são expressos pela porcentagem de inibição da formação de AGEs.
Avaliação da atividade antitumoral
A atividade antitumoral de TtSE e TtEE foi avaliada contra nove linhagens de células tumorais humanas [glioblastoma (U251), melanoma (UACC-62), câncer de mama (MCF7), adenocarcinoma seroso de ovário de alto grau resistente à doxorrubicina (NCI-ADR/RES), carcinoma de células renais (786-0), carcinoma de pulmão de células grandes (NCI-H460), adenocarcinoma seroso de ovário de alto grau (OVCAR-03), adenocarcinoma de retossigmoide (HT-29) e leucemia mieloide crônica (K562)] e uma linhagem de queratinócitos humanos não tumorigênicos (HaCaT). As linhagens tumorais foram fornecidas pelo Frederick Cancer Research & Development Center, National Cancer Institute, Frederick, MA, EUA, enquanto a linhagem celular não tumoral HaCaT (queratinócito humano) foi fornecida pelo Dr. Ricardo Della Coletta (Universidade de Campinas-UNICAMP, Brasil). As culturas de estoque foram cultivadas em 5 ml de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco®, EUA) suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco®, EUA) a 37°C em 5% de CO2 com uma mistura de 1% de penicilina (1000 U/ml) - estreptomicina (1000 mg/ml) (Vitrocell®, Brasil) (meio completo). Soluções estoque de TtSE e TtEE foram preparadas em dimetilsulfóxido (100 mg/ml) seguidas de diluição seriada em meio completo resultando nas concentrações finais de 0,25, 2,5, 25 e 250 μg/ ml. Doxorrubicina (DOX) (concentrações finais de 0,025, 0,25, 2,5 e 25 μg/ ml em meio completo) foi utilizada como controle positivo. Células em placas de 96 poços (100 μl/poço, densidade de inoculação: 3,5 a 6 x 104 células/ml) foram expostas às quatro concentrações de AuTCEP, TCEP e doxorrubicina (100 μl/poço) em triplicata, por 48 h a 37°C e 5% de CO2. Antes (placa T0) e após a adição das amostras (placas T1), as células foram fixadas utilizando 50% de ácido tricloroacético (50 μl/poço), e a proliferação celular foi determinada por quantificação espectrofotométrica (540 nm) do conteúdo de proteína celular utilizando o ensaio com sulforrodamina B. Os valores de GI50 (concentração que inibe 50% do crescimento celular) foram determinados por regressão sigmoidal utilizando o software Origin versão 8.0 (OriginLab Corporation, EUA) (Monks et al., 1991; Nunes et al., 2017).
Análise estatística
Os dados obtidos nos ensaios antiglicação e antioxidante foram avaliados pelo software BioEstat versão 5.0 por meio de Análise de Variância (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey (p≤0,05).
Resultados
Saponinas totais antes e após o enriquecimento
Na determinação das saponinas totais do TtSE, foi observado um teor de 40% de saponinas totais, e este valor estava de acordo com o relatório técnico do medicamento fitoterápico vendido em farmácias, que apresenta uma média de 43%. A extração do TtSE foi direcionada para obter o extrato enriquecido em saponinas (TtEE). Este extrato apresentou 72,8% de teor de saponinas totais, mostrando assim um aumento de 32,8% em comparação ao TtSE.
Teor de saponinas determinado por HPLC
O método desenvolvido para HPLC proporcionou uma análise rápida do extrato do medicamento fitoterápico de T. terrestris enriquecido em saponinas. As condições utilizadas levaram a uma boa separação dos picos na solução padrão, os quais puderam ser identificados no cromatograma (Figura 1), gitogenina (Rt = 4,9 min.), protodioscina (Rt 37,1 min.) e diosgenina (Rt 37,7 min.), as saponinas foram identificadas por comparação com os cromatogramas conforme observado na literatura para estas espécies.
Cromatograma HPLC do extrato enriquecido em saponinas do medicamento fitoterápico de T. terrestris. Identificação dos picos: GITO=gitogenina; PROT=protodioscina e DIOS=diosgenina
Atividade antioxidante determinada pelo teste de eliminação do radical DPPH
A atividade antioxidante avaliada pelo teste DPPH, apresentada na Tabela 1, mostrou que o TtSE apresenta o maior potencial antioxidante na concentração de 1000 μg/ml (54,45%), enquanto as concentrações de 250 e 500 μg/ml não foram significativamente diferentes. O TtEE apresentou a menor atividade na concentração de 250 μg/ml (45,97%). No entanto, as maiores atividades antioxidantes foram apresentadas nas concentrações de 500 (66,48%) e 1000 μg/ml (70,45%), as quais não diferiram significativamente entre si e do controle positivo.
Atividade antioxidante do extrato padrão de T. terrestris (TtSE), extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris (TtEE) e controle positivo (PC) ácido gálico (100 µg/ml), conforme avaliado pelo teste DPPH
Extrato Concentração (µg ml-1) Atividade antioxidante (%) 250 27,22±2,91a TtSE 500 36,14±1,04a 1000 54,45±3,90b TtEE 250 45,97±4,31b 500 66,48±3,14c 1000 70,45±3,17c PC 100 74,56±0,00c
Média e desvio padrão seguidos por letras iguais na mesma coluna não diferiram estatisticamente conforme examinado pelo teste de Tukey (p≤0,05).
Atividade antiglicação do TtSE e do TtEE
Na avaliação da atividade antiglicação realizada por análise de RME, o TtSE e o TtEE foram avaliados na concentração de 1000 μg/ml. É possível observar na Figura 2 os perfis eletroforéticos de BSA (A), tratamentos com AMG (2), TtSE (3), TtEE (4) e saponina diosgenina (5). Pode-se observar que os extratos apresentaram atividade antiglicação contra a glicação promovida pela ribose em BSA. A BSA tratada com TtSE, TtEE e saponina diosgenina exibiu perfis eletroforéticos semelhantes à BSA tratada com AMG. A BSA glicada com ribose (1) apresentou um perfil eletroforético de degradação proteica.
Mobilidade relativa no teste de eletroforese para avaliação da capacidade antiglicação pelo sistema A=BSA; 1=BSA+Ribose; 2=BSA+Ribose+AMG; 3=BSA+Ribose+TtSE; 4=BSA+Ribose+TtEE e 5=BSA+Ribose+Diosgenina. Onde BSA=albumina sérica bovina, AMG=Aminoguanidina, TtSE=extrato padrão de T. terrestris e TtEE=extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris
A Figura 3 mostra as porcentagens de grupos amino livres determinados pelo método OPA com o TtSE e TtEE em associação com BSA como proteína e ribose como agente de glicação. Observou-se que 45,85% dos grupos amino livres são submetidos à glicação na presença de ribose, refletindo o valor real de grupos amino livres nas amostras tratadas com os extratos. Assim, a porcentagem de grupos amino livres nas amostras tratadas foi de 26,33% para TtSE, 85,32% para TtEE e 30,89% para diosgenina.
Além disso, foi possível observar que a BSA tratada com TtSE e diosgenina não apresentou diferença significativa nas porcentagens de grupos amino livres. A maior porcentagem de grupos amino livres foi observada na BSA tratada com TtEE (85,32%), diferindo significativamente dos outros tratamentos e apresentando a maior atividade antiglicação contra a ribose.
Porcentagem de grupos amino livres determinada pelo método OPA com o TtSE (extrato padrão de T. terrestris), TtEE (extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris) e DIOS (saponina diosgenina) em associação com BSA (Albumina Sérica Bovina) como proteína e RIB (Ribose) como agente de glicação. Letras sobrescritas diferentes indicaram diferença média entre os tratamentos significativa a p<0,05
A Figura 4 mostra os resultados da determinação de grupos amino livres expressos como a porcentagem de inibição da glicação; pode-se observar que TtSE e TtEE inibiram a glicação em aproximadamente 15% e não foi encontrada diferença significativa entre eles; no entanto, diferiram do controle tratado com AMG(22,57%). Esses resultados estão de acordo com a fluorescência determinada para a reação das amostras avaliadas.
A Figura 5 mostra os valores de inibição da formação de AGEs determinados pela fluorescência de excitação dos AGEs e emissão máxima em 360 e 460 nm, respectivamente. Foi determinado que os dois tratamentos diferiram significativamente entre si e do AMG. No entanto, os tratamentos com TtSE e TtEE inibiram mais de 50% da formação de AGEs, caracterizando os extratos como uma fonte de compostos antiglicação.
Porcentagem de inibição da glicação: TtSE (extrato padrão de T. terrestris); TrEE (extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris); AMG (Aminoguanidina), BSA (Albumina Sérica Bovina) e RIB (Ribose).Letras sobrescritas diferentes indicaram diferença média entre os tratamentos significativa a p<0,05
AGEs (Produtos Finais de Glicação Avançada) valores de inibição da formação determinados por fluorescência de AGEs: TtSE (extrato padronizado de T. terrestris); TrEE (extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris); AMG (Aminoguanidina), BSA (Albumina Sérica Bovina) e RIB (Ribose). Letras sobrescritas diferentes indicam diferença média entre os tratamentos significativa a p<0,05
Atividade antitumoral
Atividade antiproliferativa in vitro de TtSE e TtEE foi examinada em linhagens de células tumorais humanas: U25 (glioma), MCF-7 (mama), NCI-ADR / RES (ovário com fenótipos multirresistentes a drogas), 786-O (rim), NCI-H460 (pulmão), PC-3 (próstata), OVCAR-03 (ovário), HT-29 (cólon) e linhagem não tumoral humana: q = HaCaT (queratinócito). Doxorrubicina foi utilizada como padrão de referência e os resultados estão resumidos na Figura 6.

Atividade antiproliferativa in vitro de A=TtSE (extrato padronizado de T. terrestris); B=TrEE (extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris) em linhagens de células tumorais humanas: U25 (glioma), MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com fenótipos multirresistentes a drogas), 786-O (rim), NCI-H460 (pulmão), PC-3 (próstata), OVCAR-03 (ovário), HT-29 (cólon) e linhagem não tumoral humana: q=HaCaT (queratinócito). Doxorrubicina (C) foi utilizada como padrão de referência
Os resultados revelaram que o TtSE e o TtEE exibiram atividade antiproliferativa promissora para as linhagens de células tumorais quando comparados à doxorrubicina. Em relação ao efeito antiproliferativo, o TtEE apresentou maior seletividade para a linhagem celular de rim (786-O) com GI50 de 2,91 µg/ml e o TtSE apresentou 30,63 µg/ml e mostrou atividade moderada contra as linhagens celulares testadas (Tabela 2).
Efeito antiproliferativo do extrato padronizado de T. terrestris (TtSE) e do extrato enriquecido em saponinas de T. terrestris (TtEE) e da doxorrubicina (DOX) contra linhagens de células cancerígenas humanasa
Linhagens celulares GI50(µg/ml)b DOX TtEE TtSE Glioma (U251) 0.026 24.67 79.05 Mama (MCF7) <0.025 34.24 29.11 Ovário (NCI-ADR-RES) 0.16 26.26 56.01 Rim (786-O) <0.025 2.91 30.63 Pulmão (NCI-H460) <0.025 27.24 77.40 Próstata (PC-3) 0.23 22.53 43.02 Ovário (OVCAR-3) 0.14 29.49 67.89 Cólon (HT-29) 0.26 25.08 243.50 Pele (linhagem de células não tumorais) (HaCat) <0.025 21.02 33.17

a Avaliado pelo ensaio SRB.

b Os valores de GI50 representam a concentração (µg/ml) necessária para a inibição total da proliferação de células cancerígenas. Faixa de dose testada: 0,25–250 µg/ml dos extratos e 0,025–25 µg/ml de doxorrubicina.
Discussão
Estudos conduzidos sobre T. terrestris e suas saponinas mostraram diferentes atividades biológicas contra várias doenças degenerativas promovidas principalmente pelo estresse oxidativo, como câncer e diabetes (Sadowska-Bartosz e Bartosz, 2016; Santos et al., 2019; Jud e Sourij, 2019). Estudos anteriores utilizando extratos obtidos de diferentes partes da planta (folhas, caule, raiz e frutos) demonstraram o efeito antitumoral na proliferação de diferentes células cancerígenas (Divya et al., 2014; Pourali et al., 2017) e sua atividade antiglicação foi demonstrada em estudos de triagem de plantas (Siddiqui et al., 2016). No entanto, estudos avaliando as atividades antiglicação e antitumoral de medicamentos fitoterápicos comerciais de T. terrestris ainda são poucos e raros na literatura científica, principalmente aqueles que correlacionam essas atividades com o conteúdo total de saponinas esteroidais em medicamentos fitoterápicos.
O enriquecimento do extrato fitoterápico de T. terrestris resultou em um aumento de 32,8% na concentração total de saponinas, aumentando os 40% encontrados no extrato padrão para 72,8% no extrato enriquecido em saponinas. Resultados semelhantes também foram demonstrados por Ezeonu e Ejikeme (2016), os autores quantificaram as saponinas totais no extrato enriquecido de diferentes plantas medicinais. Estudos realizados por Singh e Chaudhuri (2018) e Sobolewska et al. (2020) demonstraram que o conteúdo total de saponinas esteroidais presente em extratos vegetais pode estar diretamente correlacionado com a atividade biológica, tanto para a prevenção e tratamento de difusões fisiológicas quanto para a toxicidade promovida pelas saponinas.
Análises químicas de precisão realizadas em diferentes extratos de T. terrestris demonstraram a presença de diferentes classes de saponinas esteroidais (furostanol e espirostanol) (Combarieu et al., 2003; Mulinacci et al., 2003). Para verificar a variedade de saponinas no extrato enriquecido em saponinas (TtEE), foi realizada análise por HPLC/PDA. Esta análise demonstrou a presença das saponinas gitogenina, protodioscina e diosgenina. No entanto, o pico com maior intensidade foi para a gitogenina. Resultados semelhantes foram relatados por Ivanova et al. (2010) e Pavin et al. (2018) utilizando extratos obtidos de diferentes partes de T. terrestris.
Diferentes autores demonstraram que o extrato de T. terrestris possui potencial antioxidante, principalmente como sequestrador de radicais livres; esta atividade foi diretamente correlacionada com o conteúdo de saponinas encontrado nos extratos (Dinchev et al., 2008; Hammoda et al., 2013). Neste estudo, a atividade antioxidante de ambos os extratos TtSE e TtEE foi demonstrada pelo teste DPPH. No entanto, o TtEE apresentou uma atividade antioxidante significativamente maior em comparação ao TtSE. Isso pode estar correlacionado com a presença de maior conteúdo de saponinas, para as quais a atividade antioxidante foi demonstrada por Escribano et al. (2017) e Doost et al. (2019).
Estudos científicos demonstraram que os AGEs gerados nos processos de glicação são capazes de aumentar o estresse oxidativo; concomitantemente, o aumento de radicais livres leva a um aumento da atividade de glicação de açúcares em diferentes moléculas biológicas. Portanto, as atividades antioxidante e antiglicação estão correlacionadas, uma vez que esses compostos atuam no controle do estresse oxidativo e da glicação de proteínas (Dil et al., 2019; Neha et al., 2019). No presente estudo, a atividade antiglicação dos extratos (TtSE e TtEE) foi avaliada por ensaios in vitro. No teste RME, ambos os extratos apresentaram atividade antiglicação contra a glicação promovida pela ribose na amostra proteica (BSA). Estudos semelhantes de Gilabert-Oriol et al. (2015) e Prasad et al. (2019) demonstraram a atividade antiglicação de saponinas e outros compostos naturais sobre agentes glicantes.

No método OPA, a atividade antiglicação foi mais proeminente no extrato enriquecido com saponinas. Estudos realizados por Elekofehinti (2015) utilizando o método OPA para avaliação da atividade antiglicação de saponinas esteroidais associaram a ação antiglicação à redução de complicações causadas por doenças, como diabetes mellitus. Esse benefício provavelmente se correlaciona com a ação antiglicêmica, pois inibe a glicação de proteínas e outras biomoléculas, conforme demonstrado por Younus e Anwar (2016).

Na determinação de grupos amino livres e inibição da formação de AGEs, os resultados mostraram atividade antiglicação de ambos os extratos; no entanto, o TtEE apresentou uma atividade maior em comparação ao TtSE. Esses resultados são relatados pela primeira vez em bases científicas, portanto, não há resultados semelhantes que possam ser comparados ou interpolados às análises realizadas no presente estudo. No entanto, a frequência de citações sobre o potencial antiglicação atribuído aos extratos de T. terrestris e seus compostos isolados também pode estar correlacionada com a atividade antioxidante (Sousa et al., 2015; Naz et al., 2017).
Diante dos resultados antiglicação observados no presente estudo, sabe-se que a diminuição e até mesmo a supressão da produção fisiológica de AGEs pode prevenir/tratar os danos causados pelo diabetes e até reduzir o surgimento de diferentes tipos de câncer relacionados à glicação (García-Jiménez et al., 2016). Os AGEs afetam principalmente proteínas de longa duração, como hemoglobina, colágeno ou elastina (Nadjib et al., 2018; Bansode e Gacche, 2019). Os efeitos da glicação e da geração de AGEs em proteínas de curta duração, incluindo a albumina plasmática, também são de interesse porque causam diversas modificações estruturais e funcionais (Zendjabil, 2020). Por essa razão, o estudo dos impactos da glicação na albumina é uma tendência emergente. Sistemas modelo in vitro de glicação de proteínas utilizando BSA (a BSA tem aproximadamente 76% de homologia de sequência com a albumina sérica humana) incubada com açúcares, têm surgido como uma opção interessante para investigar as consequências deletérias da glicação de proteínas (Rabbani e Ahn, 2019; Wei et al., 2009), bem como os efeitos protetores de compostos naturais (Khan et al., 2020).
Estudos anteriores demonstraram que T. terrestris possui atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais, caracterizando o potencial antitumoral (Divya et al., 2014; Pourali et al., 2017). Além desses dados, sabe-se que a citotoxicidade seletiva é uma característica desejada de um novo composto antitumoral (Abraham e Staffurth, 2020). Um grupo especial de saponinas se destaca entre os compostos antitumorais ativos, pois podem atuar de forma semelhante aos hormônios esteroides, produzindo efeito em órgãos sensíveis a hormônios, interferindo positivamente em sua homeostase, atuando como substâncias quimioprotetoras contra vários tipos de câncer, incluindo pulmão, mama, glioma, cólon, leucemia e próstata. Essas saponinas têm efeitos antiproliferativos, anti-invasivos, antiangiogênicos, antimetastáticos e podem induzir apoptose e/ou necrose (Kim et al., 2011; Zhao et al., 2018).
A atividade antiproliferativa in vitro dos extratos de T. terrestris foi examinada em linhagens de células tumorais humanas usando doxorrubicina como padrão. O extrato enriquecido com saponinas mostrou maior seletividade para as linhagens celulares renais e o extrato padrão apresentou atividade moderada contra as linhagens testadas. Siva et al. (2017) também usaram doxorrubicina como fármaco de referência em linhagens de células tumorais em comparação com o extrato de Cipadessa baccifera e observaram resultados semelhantes. Outros resultados encontrados por Shamah-Levy et al. (2006) demonstraram que T. terrestris apresentou toxicidade, mas poderia ser usado para o tratamento de várias doenças. No entanto, os extratos foram capazes de induzir mais de 50% de morte das linhagens celulares em concentrações de 0,25-250 µg/ml.
As implicações na produção, sinalização e concentração fisiológica de AGEs estão mutuamente envolvidas na gênese do câncer e nas complicações do estresse oxidativo e na promoção e/ou agravamento de doenças degenerativas como câncer e diabetes. Isso sugere que uma abordagem terapêutica multidirecionada é imperativa para controlar essas consequências (Anis e Sreerama, 2020). Como já discutido em diferentes estudos, múltiplas atividades e diferentes vias moleculares são bloqueadas por saponinas esteroidais (Wang et al., 2019). Essa molécula é capaz de bloquear completamente as vias de sinalização do RAGE (Receptor para Produtos Finais de Glicação Avançada) (Chhipa et al., 2019). Assim, intervenções incluindo essa molécula podem ser benéficas no controle e prevenção de doenças promovidas por agentes de glicação e exercer benefícios no controle do crescimento e proliferação de linhagens celulares cancerígenas.
De acordo com os resultados, foi possível concluir que extratos padronizados e enriquecidos com saponinas de T. terrestris apresentam atividade antiglicação e antioxidante, e potencial antiproliferativo em linhagens celulares tumorais humanas. No entanto, o extrato enriquecido com saponinas apresentou maior atividade nas avaliações realizadas, demonstrando que as saponinas esteroidais presentes no extrato vegetal podem estar diretamente associadas às atividades investigadas no presente estudo.
Conflitos de interesse
Os autores declararam que não há conflito de interesse.
Referências
Terapia hormonal para o câncer
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