pmid: "29675169"
title: "Pró-metabólitos bioortogonais para perfilamento da acilação de ácidos graxos de cadeia curta."
authors: "Sinclair WR, Shrimp JH, Zengeya TT, Kulkarni RA, Garlick JM, Luecke H, Worth AJ, Blair IA, Snyder NW, Meier JL"
journal: "Chemical science"
pubdate: "2018 Feb 07"
doi: "10.1039/c7sc00247e"
source: "PMC Full Text"

Pró-metabólitos bioortogonais para perfilamento da acilação de ácidos graxos de cadeia curta.

Autores

Sinclair WR, Shrimp JH, Zengeya TT, Kulkarni RA, Garlick JM, Luecke H, Worth AJ, Blair IA, Snyder NW, Meier JL

Periodico

Chemical science (2018 Feb 07)

Conteudo

Bioorthogonal pro-metabolites for profiling short chain fatty acylation†
Um painel sistematicamente desenhado de pró-metabólitos bioortogonais foi sintetizado e avaliado como agentes para rastrear a acilação celular de cadeia curta.
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) desempenham um papel central na saúde e na doença. Uma função dessas moléculas sinalizadoras é servir como precursores para a acilação de cadeia curta, uma classe de modificações pós-traducionais (MPTs) derivadas metabolicamente que são estabelecidas por lisina acetiltransferases (LATs) e lisina desacetilases (LDACs). Por meio desse mecanismo, a acilação de cadeia curta funciona como um repórter integrado do metabolismo, bem como da atividade das LATs e LDACs, e tem o potencial de elucidar o papel desses processos na doença. No entanto, existem poucos métodos para estudar a acilação de cadeia curta. Aqui, relatamos uma estratégia de pró-metabólito bioortogonal para perfilamento da acilação de cadeia curta em células vivas. Inspirados pelo componente dietético tributirina, sintetizamos um painel de ácidos graxos de cadeia curta bioortogonais mascarados por éster. A avaliação celular desses agentes levou à descoberta de um azido-éster que é metabolizado em sua acil-coenzima A (CoA) cognata e proporciona perfis robustos de marcação de proteínas. Caracterizamos de forma abrangente a dependência metabólica, toxicidade e sensibilidade ao inibidor de histona desacetilase (HDAC) desses pró-metabólitos bioortogonais, e aplicamos uma sonda otimizada para identificar novos candidatos a alvos proteicos de ácidos graxos de cadeia curta em células. Nossos estudos demonstram a utilidade dos pró-metabólitos bioortogonais para o perfilamento imparcial da acilação proteica celular e sugerem novas abordagens para estudar as funções sinalizadoras dos AGCCs na diferenciação e na doença.
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) desempenham um papel crítico como mediadores da saúde e da doença. Por exemplo, o butirato estimula a diferenciação em muitos modelos celulares de câncer e exibe efeitos dependentes do contexto na tumorigênese e na função das células imunes em organismos inteiros. Além de seu papel na biossíntese de acetil-coenzima A (CoA) via via da β-oxidação e atividade como inibidores de histona desacetilase (HDAC), os AGCCs também constituem o precursor necessário para a acilação de cadeia curta de proteínas. Essa família de modificações pós-traducionais (MPTs) deriva do metabolismo de AGCCs em acil-CoAs, que podem então ser utilizados como cofatores pelas enzimas lisina acetiltransferase (KAT) (Fig. 1). Devido à sua dependência única tanto do metabolismo quanto da atividade da KAT, os estudos dessa MPT têm um potencial significativo para fornecer insights sobre o papel dessas vias na doença. De fato, estudos recentes de acilação de cadeia curta em histonas descobriram que essas MPTs são dinâmicas, podem nucleiar ou impedir interações proteína-proteína únicas e estão associadas a efeitos distintos na transcrição em relação à acetilação. No entanto, uma limitação para a nossa compreensão desse processo é o fato de que relativamente poucos métodos para estudar a acilação de cadeia curta existem. As análises baseadas em anticorpos dessas modificações são limitadas pela baixa afinidade e seletividade dos anticorpos gerados contra marcas como butiril- e propionil-lisina. Isso pode explicar por que essas abordagens, até o momento, identificaram apenas um punhado de alvos acilados de cadeia curta fora das histonas. Para abordar as limitações dos métodos baseados em anticorpos, o rastreamento metabólico bioortogonal surgiu como uma estratégia complementar para perfilhar MPTs em células vivas. A aplicação dessa abordagem para estudar a acilação derivada de AGCC foi pioneiramente desenvolvida por Hang e colaboradores, que demonstraram que alquinil-AGCCs poderiam ser usados para introduzir uma alça de afinidade latente em proteínas modificadas por AGCC, permitindo sua fácil visualização e enriquecimento. Uma variante dessa abordagem também foi aplicada utilmente para estudar a malonilação de lisina. No entanto, um desafio dessa estratégia é que os traçadores bioortogonais de AGCC devem competir com os AGCCs endógenos pelo metabolismo e utilização da KAT, limitando potencialmente sua eficácia. Assim, o desenvolvimento de repórteres bioortogonais altamente sensíveis para perfilhar a acilação de cadeia curta continua sendo um objetivo importante.

Estratégia de pró-metabólito bioortogonal para perfilhar a acilação de cadeia curta.
Uma estratégia validada para aumentar a entrega celular de moléculas pequenas e traçadores metabólicos é através do mascaramento reversível de grupos funcionais polares. Especificamente em relação aos SCFAs, vários grupos descobriram que os efeitos biológicos do butirato são aumentados ao mascarar seu grupo carboxilato polar com um éster. Em analogia com pró-fármacos, nos referimos a essas moléculas como “pró-metabólitos”. Um pró-metabólito prototípico de SCFA é a tributirina, um éster de butirato natural que exibe potente atividade antineoplásica e quimiopreventiva. Inspirados pela tributirina e outros pró-metabólitos, levantamos a hipótese de que mascarar o carboxilato polar de SCFAs bioortogonais pode aumentar similarmente sua potência. Tais agentes otimizados têm o potencial de fornecer um repórter robusto de acilação de cadeia curta, e por extensão, do metabolismo e da atividade celular de KAT/KDAC. Com o objetivo de definir a sinalização dependente de acilação no câncer, aqui relatamos uma estratégia de pró-metabólito bioortogonal para perfilagem de acilação de cadeia curta (Fig. 1). Primeiro, definimos sistematicamente a influência da ligação éster-SCFA e do quimiotipo bioortogonal na marcação de proteínas celulares. Em seguida, demonstramos a capacidade de agentes otimizados de formar acil-CoAs bioortogonais em células e estabelecemos suas propriedades de marcação específicas do tipo celular e do metabolismo. Finalmente, demonstramos a utilidade de pró-metabólitos bioortogonais para identificar novos alvos de SCFAs em células. Esses estudos destacam o poder das abordagens de pró-metabólitos para expandir o escopo dos métodos de rastreamento metabólico bioortogonal e sugerem novas estratégias para estudar o papel sinalizador dos ácidos graxos de cadeia curta na saúde e na doença.
Resultados e discussão
Desenho de uma biblioteca de pró-metabólitos bioortogonais
Para identificar agentes sensíveis para a perfilagem da acilação de ácidos graxos de cadeia curta, focamos na exploração de três elementos estruturais de SCFAs bioortogonais (Fig. 2). Primeiro, variamos o repórter bioortogonal, raciocinando que azidas (1–8) e alcinos (9–16) poderiam demonstrar processamento metabólico e sensibilidades de detecção diferenciais. Segundo, variamos o comprimento da cadeia alquílica entre o carboxilato do SCFA e o repórter bioortogonal. Estudos anteriores descobriram que o comprimento da cadeia do SCFA é um fator crucial na formação de SCFA-CoAs pelas acil-CoA sintetases e na utilização desses SCFA-CoAs pelas KATs. Terceiro, variamos a porção éster carboxilato. Aqui nos concentramos em ésteres etílicos simples (2, 6, 10, 14), bem como ésteres de carnitina e triacilglicerol (Fig. 2). Ésteres de carnitina (3, 7, 11, 15) foram projetados para facilitar a entrega de SCFAs às mitocôndrias, uma organela que apresenta metabolismo robusto de acil-CoA. Em contraste, ésteres de triacilglicerol inspirados na tributirina (4, 8, 12, 16) foram projetados para aproveitar a conhecida captação celular aumentada de moléculas altamente lipofílicas, bem como a capacidade desses ésteres serem clivados especificamente por lipases de triacilglicerol endógenas. Uma vantagem adicional dessas moléculas em relação a outros ésteres é sua capacidade de permitir a entrega supraestequiométrica (três equivalentes) de seus SCFAs bioortogonais cognatos. Este painel de pró-metabólitos foi prontamente sintetizado usando formação de ligação éster direta a partir dos carboxilatos bioortogonais parentais (Esquema S1†). Embora a maioria dos derivados de SCFAs bioortogonais tenha sido obtida com bom rendimento, descobrimos que os ésteres de carnitina foram os alvos mais difíceis devido à sua purificação desafiadora. Otimização semelhante foi necessária para obter SCFAs de triacilglicerol, pois as condições da literatura produziram uma mistura complexa de mono-, di- e triacilglicerídeos. Estes estudos estabelecem um painel sistemático de SCFAs bioortogonais para definir a relação estrutura-atividade de pró-metabólitos em células vivas.
Painel de pró-metabólitos de SCFA sintetizados e avaliados neste estudo.
Avaliação de pró-metabólitos bioortogonais para marcação proteica in vitro.
Com esses compostos em mãos, avaliamos em seguida nossa biblioteca para marcação de proteínas em células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 (Fig. 3). Nossa escolha do câncer de fígado como modelo para avaliação de nossos pró-metabólitos decorre do fato de que o fígado é um local importante do metabolismo de AGCC in vivo, onde utiliza atividades abundantes de acil-CoA sintetase para transformar AGCC em acil-CoAs que suportam a acilação de cadeia curta. Assim, tratamos células HepG2 com cada um de nossos pró-metabólitos em uma única concentração por 24 horas. Os lisados celulares foram coletados, submetidos à química click com uma azida ou alcino fluorescente, e analisados por SDS-PAGE (Fig. 3a). Consistente com relatos anteriores, a detecção de proteínas marcadas com azida usando um alcino fluoróforo manifestou marcação de fundo uniformemente mais alta. Os pró-metabólitos que demonstraram os perfis de marcação de proteínas mais intensos foram os triacilglicerídeos bioortogonais (4, 8, 12, 16), bem como o azidopropionato de etila (6) (Fig. 3b e c). A marcação pelos triacilglicerídeos 8 e 12 foi acompanhada por toxicidade perceptível em 24 horas (Fig. S1a†). Curiosamente, a análise da série de alcinos bioortogonais revelou que os ésteres pentinoato são consistentemente mais tóxicos do que seus equivalentes hexinoato (Fig. S1b†). Isso não se correlacionou com a marcação de proteínas ou com a atividade inibitória de HDAC (Fig. 3 e S2†), sugerindo que o pentinoato pode manifestar seus efeitos tóxicos por mecanismos alternativos. Notavelmente, o ácido 5-pentinoico se assemelha estruturalmente ao ácido 5-pentenoico, um agente citotóxico conhecido por formar espécies eletrofílicas e inibir a oxidação de ácidos graxos nas células. Essa toxicidade (assim como a variabilidade específica do protocolo, por exemplo, dose, escolha da linhagem celular) pode explicar a marcação modesta por 9, que foi validado como um reagente de marcação de proteínas bioortogonal por vários grupos. A análise dos pró-metabólitos azida ativos (4, 6, 8) nos levou a focar em 6 como um pró-metabólito líder. A principal justificativa para essa escolha incluiu o fato de que 6 fornece a marcação mais intensa de qualquer precursor bioortogonal de AGCC examinado (Fig. 2b) e marca robustamente proteínas em concentrações que não impedem o crescimento celular (Fig. S1c e d†). A extração ácida e a análise metabolômica por LC-MS de células tratadas com 6 confirmaram a formação de azidopropionil-CoA, consistente com a capacidade de 6 de formar cofatores para reações de acilação de cadeia curta de proteínas (Fig. S3†). Até onde sabemos, isso representa a primeira evidência direta da formação de acil-CoA bioortogonal em células vivas. Esses dados, combinados com sua síntese fácil, nos levaram a avaliar ainda mais 6 como um repórter otimizado da acilação de cadeia curta celular.
Avaliação celular de pró-metabólitos bioortogonais de SCFA. (a) Esquema para análise celular e ensaio de incorporação de pró-metabólitos via ensaio fluorescente em gel. (b) Marcação de proteínas por pró-metabólitos e carboxilatos parentais em células HepG2 (2,5 mM, 24 h). O asterisco indica um pró-metabólito avaliado a 1 mM devido à toxicidade. A faixa 1 de cada gel foi recortada de sua posição original. Imagens completas dos géis e controles de carregamento de Coomassie são fornecidos no ESI.† (c) Estruturas de pró-metabólitos bioortogonais de SCFA mais ativos.

Análise mecanística de um pró-metabólito principal para perfilamento de acilação de ácidos graxos de cadeia curta
Para definir melhor a atividade do pró-metabólito 6, nós o avaliamos em uma série de experimentos usando nosso ensaio fluorescente em gel. A marcação celular de proteínas pelo 6 foi dose-dependente, com marcação significativa observada em concentrações tão baixas quanto 0,5 mM (Fig. 4a). Analisando a atividade dependente do tempo do 6, observou-se que a marcação atingiu o pico entre 6 e 9 horas (Fig. S1d†). Vale notar que a marcação reduzida observada em 24 horas sugere que a acilação de cadeia curta implementada pelo 6 pode ser reversível, consistente com a capacidade conhecida de muitas enzimas HDAC de desacetilar derivados de ácidos graxos acil-lisina. Para avaliar a generalidade do pró-metabólito 6, comparamos a marcação celular em HepG2 com a marcação em linhagens celulares derivadas de uma variedade de tecidos de origem, incluindo pulmão (A549) e rim (HEK293). Interessantemente, cada linhagem celular demonstrou padrões intensos, mas únicos, de marcação de proteínas pelo 6 (Fig. 4b). Isso sugere a capacidade do 6 de funcionar como um repórter útil da acilação de ácidos graxos de cadeia curta em vários tecidos e tipos celulares.

Avaliação celular do pró-metabólito principal 6. (a) Marcação dose-dependente de células HepG2. As células foram tratadas com 6 por 6 h. (b) Marcação proteica específica de linhagens celulares pelo pró-metabólito 6. Imagens completas dos géis e controles de carregamento de Coomassie são fornecidos no ESI.†
Em seguida, buscamos compreender melhor os determinantes metabólicos da acilação de cadeia curta por 6 (Fig. 5). Primeiro, exploramos se a marcação de proteínas por 6 era sensível à competição por ácidos graxos de cadeia curta endógenos, como o acetato. Nossa hipótese era que o acetato poderia competir com 6 pelos sítios ativos da acil-CoA sintetase, reduzindo assim a biossíntese bioortogonal de acil-CoA e competindo pelos sítios de marcação de proteínas (Fig. 5a). Consistente com essa hipótese, observamos diminuição da marcação de proteínas celulares por 6 após a coadministração de acetato (Fig. 5b). O tratamento de células com inibidores da ácido graxo sintase (FASN) não reduziu substancialmente a marcação por 6 (Fig. S4†), indicando que o metabolismo de azidopropionato a acil-CoAs de cadeia longa (como aqueles usados como palmitoiltransferases) não é um mecanismo principal de marcação. Em seguida, testamos o efeito da glicose do meio na marcação da acilação de cadeia curta por 6. O acetil-CoA derivado da glicose pode competir com SCFA-CoAs pela acetilação de proteínas. Além disso, estudos anteriores descobriram que a limitação de glicose causa aumento da utilização de SCFAs para produção de energia via oxidação de ácidos graxos. Importante, essa mudança bioenergética requer aumento da biossíntese de SCFA-CoAs e, portanto, deve aumentar a marcação por 6 (Fig. 5a) de fato, observamos aumento da marcação de proteínas celulares por 6 quando as células foram cultivadas em glicose baixa em comparação com meio rico em nutrientes (Fig. 5c). Finalmente, exploramos o impacto da dinâmica de acetilação na marcação metabólica. Para investigar o papel das KATs na acilação de cadeia curta, aplicamos um arcabouço de inibidor espirocíclico de EP300 recentemente relatado na literatura (p300i; Fig. S5a†). A inibição de EP300 reduziu a acilação de algumas, mas não todas, proteínas marcadas por 6 (Fig. 5d). Isso sugere que EP300 pode colaborar com outros mecanismos enzimáticos e não enzimáticos para estabelecer a acilação de cadeia curta. Devido à falta de sondas químicas bem validadas para outras enzimas KAT, avaliamos em seguida como a marcação de proteínas por 6 era afetada por inibidores de HDAC. O tratamento de células com o inibidor de HDAC SAHA aumentou a acetilação global, enquanto diminuiu coordenadamente a marcação de proteínas celulares por 6 (Fig. 5e). Isso indica que a desacetilação ativa pode ser necessária para liberar lisinas para a acilação de cadeia curta por acil-CoAs bioortogonais. Esses estudos definem o pró-metabólito 6 como um repórter geral do metabolismo de SCFA e acilação.
Pró-metabólitos são agentes de marcação dependentes do metabolismo e de HDAC. (a) Esquema representando as origens biossintéticas do acetil-CoA e dos SCFA-CoAs usados nas reações de acilação da lisina. Agentes em vermelho são manipulados nestes estudos. ACS = enzimas acil-CoA sintetase. (b) A marcação de proteínas pelo repórter bioortogonal 6 é competida por SCFAs exógenos. (c) A marcação de proteínas pelo repórter bioortogonal 6 é aumentada na ausência de glicose, o que favorece a atividade da ACS. (d)A marcação de proteínas pelo repórter bioortogonal 6 é diminuída pelo pré-tratamento das células com um inibidor espirocíclico de p300. (e) A marcação de proteínas pelo repórter bioortogonal 6 é diminuída pelo pré-tratamento das células com o inibidor de HDAC SAHA. Todos os experimentos foram realizados em células HepG2, exceto o tratamento com KATi que foi realizado em HEK293. Imagens completas dos géis e controles de carregamento com Coomassie são fornecidos no ESI.†

Perfilando os alvos celulares de SCFAs bioortogonais
Finalmente, buscamos demonstrar a capacidade do 6 de identificar alvos específicos da acilação de ácidos graxos de cadeia curta em células vivas. Como prova de conceito, expusemos células embrionárias de rim humano a um pulso de 6 ou veículo DMSO por seis horas. Após o isolamento dos lisados celulares, as proteínas marcadas pelo 6 foram ligadas quimiosseletivamente a uma biotina alquina via cicloadição [3 + 2] catalisada por Cu, e enriquecidas sobre estreptavidina-agarose. As proteínas enriquecidas foram submetidas a uma digestão tríptica em esferas e identificadas por LC-MS/MS. Alvos candidatos da acilação de ácidos graxos de cadeia curta foram definidos como proteínas enriquecidas mais de 2 vezes a partir de células tratadas com 6, em relação ao controle veículo (Tabela S1†). Analisando a abundância desses alvos por contagem espectral, identificaram-se 447 proteínas de baixa abundância (1–5 contagens espectrais), 121 proteínas de média abundância (5–10 contagens espectrais) e 91 proteínas de alta abundância (>10 contagens espectrais). Vale notar que muitas dessas proteínas, incluindo 41% das proteínas enriquecidas de alta abundância, foram previamente identificadas como alvos da acilação de ácidos graxos de cadeia curta por Hang e colaboradores (Tabela S1†). A análise de ontologia gênica também apoiou a utilidade do 6 como repórter bioortogonal, sendo a acetilação o termo mais fortemente enriquecido (P = 1,5 × 10–153) (Tabela S2†). Esta análise também revelou que os alvos do 6 estavam enriquecidos em proteínas nucleares, consistente com a localização nuclear de muitas KATs (Tabela S3†). Vale notar que, entre as proteínas identificadas em conjuntos de dados triplicados, estava EP300, que anteriormente foi observada como catalisadora da acilação de ácidos graxos de cadeia curta. A EP300 pode ser um alvo dessa modificação via autoacetilação, e estudos de acompanhamento validaram a capacidade do 6 de marcar EP300 expressa ectopicamente (Fig. S5b e c†). Embora adiemos uma validação e discussão mais detalhadas desses alvos candidatos de SCFA para estudos futuros, no geral esses achados apoiam a capacidade do 6 de ser aplicado em estudos proteômicos globais de acilação de ácidos graxos de cadeia curta.
Aqui descrevemos uma estratégia de pró-metabólito bioortogonal para perfilagem de acilação de cadeia curta celular. Especificamente, descobrimos que vários alcinos e azidas-SCFAs funcionam como reagentes eficazes de marcação de proteínas quando administrados como análogos de triglicerídeos (4, 8, 12, 16), ou como ésteres etílicos (6). A caracterização detalhada do pró-metabólito principal 6 revelou que ele pode formar acil-CoAs bioortogonais em células, é ativo em vários modelos celulares e marca proteínas de uma maneira que reflete o metabolismo celular e a dinâmica de acetilação. Nossos estudos sugerem que estratégias de pró-metabólitos, previamente utilizadas para otimizar a incorporação de glicanos contendo azida e alcino, podem ter ampla utilidade na administração de traçadores metabólicos bioortogonais. É importante destacar que nosso trabalho não está isolado, mas está conectado ao de outros grupos que usaram ésteres acetoximetílicos, bem como hexoasaminas O- e N-ligadas para administrar SCFAs às células. A capacidade desses arcabouços de administrar SCFAs bioortogonais ainda não foi determinada sistematicamente, e no futuro pode ser informativo compará-los aos ésteres etílicos e triacilgliceróis investigados aqui. Olhando adiante, antecipamos várias aplicações para os pró-metabólitos potentes de SCFA identificados neste estudo. Primeiro, a forte marcação proporcionada por 6 sugere que ele pode ser um traçador in vivo útil para identificar proteínas aciladas endogenamente de cadeia curta associadas a fenótipos impulsionados por SCFA, como diferenciação, anti-inflamação ou supressão tumoral. Para serem mais impactantes, tais estudos exigirão que os pró-metabólitos recapitulem os efeitos fenotípicos dos SCFAs endógenos. Como muitos desses efeitos foram associados à atividade de HDAC dos SCFAs, é promissor que nossos estudos celulares indiquem que os SCFAs com azida e alcinil investigados aqui também estimulam a acetilação de histonas (Fig. S2†). Segundo, os pró-metabólitos bioortogonais podem fornecer uma leitura fácil da atividade global de KAT/KDAC em sistemas celulares ou in vivo, complementando as abordagens proteômicas químicas atuais, que são aplicáveis apenas em lisados celulares. Finalmente, os pró-metabólitos bioortogonais de SCFA podem facilitar abordagens genéticas químicas para identificar substratos específicos de KAT em células. Notavelmente, foram relatadas mutações que conferem à KAT2A (GCN5L2) e KAT8 (MOZ) a capacidade de usar azido- e alcinil-CoAs alongados. No geral, estes estudos representam um avanço metodológico chave no desenvolvimento de novos métodos para entender a sinalização dependente de acetilação em sistemas vivos.
Conflitos de interesse
Os autores declaram que não há conflito de interesse em relação à publicação deste artigo.
Material Suplementar