pmid: "31654770"
title: "Tributirina Inibe a Repressão Epigenética Induzida por Etanol da CPT-1A e Atenua a Esteatose e Lesão Hepática."
authors: "Donde H, Ghare S, Joshi-Barve S, Zhang J, Vadhanam MV, Gobejishvili L, Lorkiewicz P, Srivastava S, McClain CJ, Barve S"
journal: "Cellular and molecular gastroenterology and hepatology"
pubdate: "2020"
doi: "10.1016/j.jcmgh.2019.10.005"
source: "PMC Full Text"
Tributirina Inibe a Repressão Epigenética Induzida por Etanol da CPT-1A e Atenua a Esteatose e Lesão Hepática.
Autores
Donde H, Ghare S, Joshi-Barve S, Zhang J, Vadhanam MV, Gobejishvili L, Lorkiewicz P, Srivastava S, McClain CJ, Barve S
Periodico
Cellular and molecular gastroenterology and hepatology (2020)
Conteudo
Tributirina inibe a repressão epigenética induzida por etanol da CPT-1A e atenua a esteatose hepática e a lesão
A regulação negativa mediada por etanol da expressão do gene da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1A) desempenha um papel importante no desenvolvimento da esteatose hepática; no entanto, os mecanismos subjacentes não são completamente elucidados. A tributirina, um pró-fármaco do butirato que pode inibir a atividade da histona desacetilase (HDAC), atenua a esteatose hepática e a lesão. O presente estudo examinou o efeito benéfico da tributirina/butirato em atenuar os mecanismos epigenéticos patogênicos induzidos por etanol que afetam as modificações de histonas no promotor da CPT-1A e a expressão gênica, bem como a esteatose/lesão hepática.
Métodos
Camundongos foram alimentados com uma dieta líquida Lieber-DeCarli (Research Diet Inc, New Brunswick, NJ) com ou sem etanol por 4 semanas. Em um subgrupo de camundongos, tributirina (2 g/kg) foi administrada por via oral por gavagem. Hepatócitos primários de rato foram tratados com 50 mmol/L de etanol e/ou 2 mmol/L de butirato. A expressão gênica e as modificações epigenéticas no promotor da CPT-1A foram analisadas por imunoprecipitação da cromatina.
Resultados
In vivo, o etanol induziu a desacetilação da histona H3K9 no promotor hepático da CPT-1A, o que é indicativo de um estado de cromatina repressivo, e diminuiu a expressão do gene CPT-1A. Nossos dados identificaram a HDAC1 como a principal HDAC causando a desacetilação da histona H3K9 no promotor da CPT-1A e a regulação negativa epigenética da expressão gênica. Significativamente, a Proteína de Especificidade 1 (SP1) e o Fator Nuclear 4 Alfa do Hepatócito (HNF4α) participaram do recrutamento da HDAC1 para as regiões proximal e distal do promotor da CPT-1A, respectivamente, e mediaram a repressão transcricional. Importante, o butirato, um inibidor dietético de HDAC, atenuou o recrutamento induzido por etanol da HDAC1 e facilitou a ligação da p300-HAT ao permitir a interação SP1/p300 na região proximal e as interações HNF4α/coativador 1α do receptor γ ativado por proliferador peroxissomal/p300 na região distal, levando à acetilação das histonas do promotor e ao aumento da transcrição da CPT-1A.
Conclusões
Este estudo identifica mecanismos epigenéticos repressivos mediados pela HDAC1 que estão subjacentes à diminuição mediada por etanol na expressão da CPT-1A. Importante, a tributirina/butirato inibe a HDAC1, resgata a expressão da CPT-1A e atenua a esteatose hepática e a lesão mediadas por etanol, sugerindo seu uso potencial em estratégias terapêuticas para a doença hepática alcoólica.
Resumo gráfico
Sumário
O consumo de álcool inibe a expressão da carnitina palmitoiltransferase-1 ao interferir nas interações de proteínas reguladoras-chave no DNA através de mecanismos epigenéticos. Essas alterações mediadas pelo álcool foram prevenidas pela administração oral de Tributirina, um pró-fármaco do butirato, reduzindo assim o acúmulo de gordura e a lesão hepática, indicando uma estratégia terapêutica no tratamento da doença hepática alcoólica.
A doença hepática alcoólica (DHA) é uma doença em múltiplos estágios e está associada à morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool. A esteatose hepática é uma manifestação precoce da DHA e tem o potencial de aumentar a suscetibilidade do fígado a insultos ou lesões secundárias. Além disso, o acúmulo de lipídios hepáticos induzido pelo álcool pode iniciar e intensificar a progressão da DHA da esteatose para formas mais graves de doença hepática, como esteato-hepatite e cirrose. Embora várias vias possam contribuir para a esteatose hepática, estudos experimentais e clínicos relataram que o comprometimento da β-oxidação induzido pelo álcool desempenha um papel importante no desenvolvimento da esteatose hepática e da doença hepática. Portanto, é altamente relevante estudar os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos na desregulação da β-oxidação induzida pelo álcool, que leva à esteatose no fígado.
A β-oxidação mitocondrial hepática é regulada principalmente pela carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1A). A CPT-1A atua como uma enzima limitante da taxa e controla o transporte de ácidos graxos para dentro das mitocôndrias para oxidação e, portanto, alterações em sua expressão/atividade podem afetar o acúmulo de gordura hepática. Estudos mostraram que a administração de álcool afeta tanto a função quanto a expressão da CPT-1. Em nível funcional, o consumo de etanol diminui a atividade hepática da CPT-1 e também aumenta a sensibilidade da enzima à inibição pela malonil coenzima A (malonil-CoA). Além disso, essa diminuição na atividade da CPT-1 foi correlacionada com uma diminuição na taxa de oxidação de ácidos graxos em hepatócitos, sugerindo que a CPT-1 pode desempenhar um papel importante na geração do fígado gorduroso induzido pelo etanol. Em nível de expressão gênica, nós e outros mostramos que o consumo de álcool regula negativamente a expressão da CPT-1, o que desempenha um papel importante no desenvolvimento da esteatose hepática.
Há evidências crescentes sobre o papel contributivo dos mecanismos epigenéticos no desenvolvimento da DHA. Os mecanismos epigenéticos, particularmente as modificações de histonas nos promotores, desempenham um papel importante no controle da estrutura da cromatina e regulam a ligação de fatores de transcrição e a ativação transcricional de genes. Embora as modificações de histonas, especialmente a acetilação, desempenhem um papel significativo no desenvolvimento da patologia hepática associada ao álcool, os mecanismos epigenéticos moleculares subjacentes afetados pelo álcool estão apenas começando a ser compreendidos. A acetilação de histonas nos promotores nos resíduos de lisina, regulada pelas atividades opostas das histonas acetiltransferases (HATs) e das histonas desacetilases (HDACs), desempenha um papel importante na manutenção do estado da cromatina transcricionalmente ativo e/ou repressivo. Em relação à expressão de CPT-1A, tanto as regiões proximais quanto distais do promotor de CPT-1A participam da regulação transcricional da expressão do gene CPT-1A. Trabalhos anteriores realizados por nós mostraram que a regulação negativa induzida pelo álcool agudo da expressão do gene hepático CPT-1A envolve a desacetilação repressiva transcricional de histonas no promotor, mediada pelo complexo correpressor do receptor nuclear 1 (N-CoR)-HDAC3, ligando-se à região distal do promotor do gene CPT-1A. No entanto, no contexto do consumo crônico de etanol, os mecanismos epigenéticos envolvendo HDACs, bem como HATs, que afetam ambas as regiões reguladoras do promotor proximal e distal, levando a uma diminuição na expressão do gene CPT-1A, não foram determinados.
Há evidências crescentes que mostram um papel patogênico significativo do eixo intestino-fígado no desenvolvimento da DHA. Foi documentado que, no intestino, o álcool diminui os ácidos graxos de cadeia curta (particularmente o butirato), que são produzidos principalmente pela fermentação microbiana de fibras alimentares indigestíveis. A diminuição dos ácidos graxos de cadeia curta provavelmente ocorre devido à disbiose microbiana intestinal induzida pelo álcool. Estudos mostraram que o butirato tem um papel protetor ao atuar como um inibidor de HDAC e afetar a regulação epigenética da expressão gênica. A tributirina é um pró-fármaco do butirato que, após administração oral, é hidrolisada em butirato e é capaz de aumentar os níveis plasmáticos de butirato, fornecendo capacidades inibitórias de HDAC. Além disso, possui melhores propriedades farmacocinéticas com baixa toxicidade do que o butirato. Em relação aos efeitos benéficos, a administração de tributirina (Tb) atenua as reações inflamatórias induzidas por lipopolissacarídeo e consumo crônico de álcool em binge e a lesão hepática mediada pelo intestino. No entanto, os mecanismos epigenéticos subjacentes aos efeitos hepatoprotetores da Tb na DHA permanecem indeterminados. Portanto, o presente estudo examinou o efeito da administração oral de Tb nas interações do promotor de HDAC e HAT, na expressão do gene CPT-1A e no desenvolvimento de esteatose hepática e lesão em um modelo animal de alimentação crônica com etanol.
Os dados identificam que o Tb/butirato, por meio de sua capacidade de inibir a função da HDAC, previne mecanismos epigenéticos repressivos induzidos pelo etanol que afetam a acetilação de histonas do promotor da CPT-1A, que regula negativamente sua expressão e atenua a esteatose hepática e a lesão. Importante, os dados implicam que a administração oral de Tb poderia ser um componente potencial da estratégia terapêutica no tratamento da ALD.
Resultados
A Administração de Tb Atenua a Esteatose Hepática e a Lesão Induzidas por Etanol em Camundongos
A administração de Tb atenua a esteatose hepática e a lesão induzidas por etanol em camundongos. (A e B) Análise farmacocinética da concentração de butirato no (A) plasma e (B) fígado aos 0, 1,5, 3 e 6 horas por cromatografia gasosa com detecção espectrométrica de massa em camundongos recebendo gavagem oral de Tb (2 g/kg). (C e D) Camundongos foram alimentados com dieta controle (maltodextrina isocalórica [PF]) ou dieta contendo etanol (5% vol/vol) (EF) com ou sem administração de Tb por gavagem oral (2 g/kg; Tb ou EF + Tb) por 4 semanas. As micrografias representativas mostram coloração (C) H&E e (D) Oil Red O de cortes hepáticos (ampliação original, 20×), evidenciando acúmulo de gordura no fígado de camundongos EF. Imagens representativas são mostradas. Os triglicerídeos hepáticos (E) e os ácidos graxos não esterificados (NEFA) (F) foram avaliados por análise bioquímica. Os níveis séricos de (G) alanina aminotransferase (ALT) e (H) aspartato aminotransferase (AST) foram avaliados para lesão hepática. Os dados foram analisados por análise de variância e são representados como médias ± DP, n = 4–6 animais/grupo. Valor de P < 0,05 para (a) quando comparado com PF, (b) quando comparado com EF e (c) quando comparado com EF + Tb.
Para investigar a eficácia do Tb administrado por via oral como um pró-fármaco do butirato, inicialmente medimos os níveis de butirato no sangue portal e no tecido hepático de camundongos por cromatografia gasosa-espectrometria de massas. Utilizamos 2 g/kg de Tb, uma concentração que protege contra a esteatose hepática induzida por dieta. A análise farmacocinética mostrou um aumento nos níveis de butirato que atingiu o pico na circulação portal (539,52 ± 204,05 nmol/L) e no tecido hepático (21,93 ± 9,8 nmol/g) 1,5 horas após a administração oral. Em 3 horas, os níveis séricos de butirato diminuíram rapidamente para os valores basais, enquanto os níveis hepáticos apresentaram tendência a permanecer ligeiramente elevados (Figura 1A e B). Além disso, examinamos o efeito da administração de Tb na esteatose hepática induzida por etanol. Conforme mostrado na Figura 1C e D, a coloração H&E e Oil Red O das secções hepáticas demonstrou que o consumo de etanol resultou em esteatose hepática considerável, que foi atenuada de forma marcante nos camundongos alimentados com Tb. Consistente com a diminuição observada no acúmulo de lipídios, níveis reduzidos de triglicerídeos hepáticos (Figura 1E) e ácidos graxos livres (Figura 1F) também foram detectados nos camundongos alimentados com Tb. Além disso, o Tb reduziu significativamente o aumento mediado pelo etanol nos níveis séricos de alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase (Figura 1G e H). Esses dados indicam que a administração oral de Tb atenua significativamente a esteatose hepática e a lesão induzidas por etanol.
O Tb Previne a Diminuição Induzida por Etanol na Expressão Hepática de CPT-1A em Camundongos
A administração de Tb regula negativamente a expressão hepática de CPT-1A em camundongos. Camundongos foram alimentados de forma pareada (maltodextrina isocalórica [PF]) com uma dieta controle ou EF (5% peso/volume) juntamente com Tb (2 g/kg, EF + Tb) administrado por via oral. (A) Os níveis de mRNA de CPT-1A foram analisados por PCR quantitativa em tempo real e normalizados para o mRNA de β-actina. (B) Imunocoloração com anticorpo anti-CPT-1A (ampliação original, 20×). Imagens representativas são mostradas. O gráfico de barras mostra a quantificação da proteína CPT-1A usando o software MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA) calculando a porcentagem de campos microscópicos positivos (com base na intensidade média do campo de visão). Detecção dos níveis de proteína CPT-1A por análise de Western blot em tecidos hepáticos de camundongos. Os blots foram descarregados e reincubados com anticorpo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como controle de carga. A razão de densidade para cada banda em comparação com seu GAPDH é mostrada como um gráfico de barras. Os dados são expressos como médias ± EPM, n = 5 animais/grupo. Valor P <0,05 (a) quando comparado com PF, (b) quando comparado com EF. (C) A análise de ChIP foi realizada no tecido hepático de camundongos. Fragmentos de cromatina foram imunoprecipitados com anticorpo anti-H3K9Ac e o ChIP-qPCR foi realizado usando pares de primers específicos para a região TRE no promotor de CPT-1A. A cromatina não imunoprecipitada foi usada como entrada. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como médias ± DP, n = 4–6 camundongos por grupo (n = 3 para Western blot). Valor P < 0,05 (a) quando comparado com PF, (b) quando comparado com EF.
Trabalhos realizados por nós e outros mostraram que a regulação negativa de CPT-1A mediada pelo etanol desempenha um papel importante no desenvolvimento da esteatose hepática. Portanto, o efeito de Tb na expressão hepática de CPT-1A foi avaliado em camundongos alimentados com etanol. Em concordância com relatos anteriores, a expressão do gene CPT-1A (RNA mensageiro [mRNA] e proteína) diminuiu significativamente em camundongos alimentados com etanol. Importante, uma redução na expressão de CPT-1A em resposta ao etanol foi significativamente prevenida pela administração de Tb (Figura 2A e 2B).
Nosso trabalho anterior mostrou que a exposição aguda ao etanol induziu a hipoacetilação da histona H3 do promotor de CPT-1A, levando a uma diminuição na expressão de mRNA de CPT-1A. Portanto, examinamos os efeitos do etanol e do butirato no estado da acetilação da lisina 9 da histona H3 (H3K9Ac), que desempenha um papel chave na ativação transcricional da expressão gênica. O exame da região promotora proximal de CPT-1A de camundongo (-169 a -81 pb) por análise de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) mostrou uma diminuição significativa na H3K9Ac em camundongos alimentados com etanol (EF). Significativamente, a administração de Tb bloqueou essa desacetilação de H3K9 induzida pelo etanol (EF + Tb) (Figura 2C). Esses dados sugerem que Tb bloqueia mecanismos epigenéticos repressivos transcricionais e previne a diminuição na expressão de mRNA de CPT-1A.
Butirato Inibe o Recrutamento de HDAC1 Medido por Etanol e Previne a Diminuição na Desacetilação de Histonas do Promotor CPT-1A
O butirato previne a diminuição mediada por etanol na expressão do gene CPT-1A e na H3K9Ac associada ao promotor CPT-1A. Hepatócitos primários foram deixados não tratados (UT) ou tratados com 50 mmol/L de etanol por 12 horas (Etanol). As células foram pré-tratadas com butirato de sódio (NaB 2 mmol/L) por 30 minutos antes do etanol (Etanol + NaB). (A) Os níveis de mRNA CPT-1A foram analisados por PCR quantitativo em tempo real e normalizados para o mRNA β-actina. (B) Níveis representativos da proteína CPT-1A normalizados para a proteína de controle correspondente (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase [GAPDH]). Os números representam a razão densitométrica normalizada para GAPDH (n = 3). (C) A representação esquemática da localização das principais regiões transcricionalmente ativas (região I: promotor proximal-sítio de início da transcrição [TSS], região II: sítio promotor distal [DR-1]) para análise de modificações epigenéticas é mostrada. As localizações coordenadas das regiões foram mostradas em relação ao sítio de início +1 das Sequências de Referência do NCBI (REFSEQ) NM_031559. (D) Fragmentos de cromatina foram imunoprecipitados com anticorpo específico para anti-H3K9Ac acetilada, e o PCR quantitativo em tempo real ChIP foi realizado usando pares de primers específicos para as regiões I e II no promotor CPT-1A. A cromatina não imunoprecipitada foi usada como input. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como médias ± DP, n = 4–6 experimentos. Valor de P < 0,05 (a) quando comparado com UT, (b) quando comparado com etanol. (E) O ensaio ChIP e a análise do mRNA CPT-1A foram realizados conforme detalhado anteriormente apenas em hepatócitos primários tratados com butirato de sódio.
Para investigar os mecanismos epigenéticos detalhados que regulam a acetilação da histona H3K9 do promotor hepático e a expressão do gene CPT-1A, examinamos as alterações da cromatina induzíveis por etanol e butirato no promotor CPT-1A em hepatócitos primários. Inicialmente, a expressão do gene CPT-1A foi examinada em hepatócitos deixados não tratados ou tratados com 50 mmol/L de etanol na presença ou ausência de butirato de sódio (2 mmol/L, 30 minutos antes do etanol). Análogo aos efeitos in vivo, o butirato preveniu uma diminuição mediada por etanol na expressão do gene CPT-1A tanto no nível de mRNA quanto no de proteína (Figura 3A e B). A análise ChIP foi estudada nas regiões promotoras proximal e distal (região I: sítio de início da transcrição proximal, -262 a +52; região II: sítio distal DR-1, -3011 a -2792) do gene CPT-1A (Figura 3C). Correspondente à expressão gênica, a análise ChIP mostrou que houve uma redução modesta, porém significativa, na H3K9Ac transcricionalmente permissiva pelo tratamento com etanol na região I (Figura 3D). O pré-tratamento com butirato não apenas aboliu essa diminuição, mas aumentou substancialmente a H3K9Ac em aproximadamente 2,5 vezes nas regiões I e II (Figura 3D). Além disso, o tratamento apenas com butirato aumentou a H3K9Ac basal e a expressão de mRNA CPT-1A em hepatócitos primários (Figura 3E).
Butirato previne o recrutamento mediado por etanol de HDAC1 para o promotor de CPT-1A. Hepatócitos primários foram deixados não tratados (UT) ou tratados com 50 mmol/L de etanol por 12 horas (Etanol). As células foram pré-tratadas com butirato de sódio (NaB 2 mmol/L) por 30 minutos antes do etanol (Etanol + NaB). (A) A atividade da HDAC foi avaliada com o kit colorimétrico de ensaio de atividade da HDAC. A análise de ChIP foi realizada utilizando fragmentos de cromatina imunoprecipitados com (B) anti-HDAC1 e (E) anti-HDAC3. A PCR quantitativa em tempo real de ChIP foi realizada usando pares de primers específicos para as regiões I e II no promotor de CPT-1A. A cromatina não imunoprecipitada foi usada como input. (C) Detecção dos níveis da proteína HDAC-1 por análise de Western blot em tecidos hepáticos de camundongos. Os blots foram lavados e reprovados com anticorpo de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como controle de carga. A razão de densidade para cada banda em comparação com sua GAPDH é mostrada em um gráfico de barras. (D) Células H4IIE foram mantidas UT ou tratadas com 50 mmol/L de etanol por 24 horas. As células foram pré-tratadas com inibidor de HDAC1 (HDAC1i) (1 μmol/L) 30 minutos antes do etanol. Os níveis de mRNA de CPT-1A foram analisados por PCR quantitativa por transcrição reversa e normalizados para o mRNA de β-actina. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como média ± DP, n = 4 experimentos. Valor de P < 0,05 (a) quando comparado com UT, (b) quando comparado com etanol e (c) quando comparado com Etanol + HDAC1i.
Para abordar os mecanismos subjacentes à desacetilação de H3K9 mediada por etanol, os efeitos do etanol e do butirato na atividade da HDAC foram examinados em hepatócitos primários (Figura 4A). Em consonância com seu efeito na H3K9Ac, o tratamento com etanol aumentou a atividade total da HDAC em hepatócitos primários. Importante, o butirato, de acordo com sua função inibidora de HDAC, preveniu o aumento induzido por etanol na atividade da HDAC. Após uma avaliação da atividade da HDAC em hepatócitos, examinamos os efeitos do etanol e do butirato no recrutamento de HDAC para o promotor de CPT-1A.
Os fatores de transcrição Specificity Protein 1 (SP1) e Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha (HNF4α) são conhecidos por recrutar HDAC1 para regiões promotoras e funcionar como repressores transcricionais de maneira dependente do contexto. Como SP1 e HNF4α são fatores de transcrição estabelecidos que se ligam ao promotor do CPT-1A nas regiões I e II, respectivamente, examinamos o efeito do etanol no recrutamento de HDAC1, SP1 e HNF4α nessas regiões. Consistente com a diminuição da acetilação de H3K9 e da expressão do mRNA de CPT-1A, o tratamento com etanol aumentou significativamente a ligação de HDAC1 nas regiões I e II do promotor de CPT-1A (Figura 4B). Importante, o butirato aboliu o aumento induzido por etanol na ligação de HDAC1 a essas regiões (Figura 4B) e resgatou a acetilação de H3K9 e a expressão do mRNA de CPT-1A. Essas alterações na ligação de HDAC1 às regiões do promotor de CPT-1A não foram acompanhadas por aumento ou diminuição nos níveis de expressão da proteína HDAC1 em nenhuma das condições de tratamento (Figura 4C). Além disso, o tratamento de hepatócitos com um inibidor específico de HDAC1 preveniu a regulação negativa mediada por etanol da expressão do mRNA de CPT-1A, apoiando ainda mais o papel supressor de HDAC1 (Figura 4D). Como HDAC3, demonstrado por nós e outros, é recrutado para a região distal do promotor II de CPT-1A via ligação de N-CoR, também examinamos os efeitos do etanol no recrutamento de HDAC3 na região II. Os dados mostraram que, em comparação com HDAC1, não houve alteração significativa na ligação de HDAC3 em hepatócitos tratados com etanol (Figura 4E).
O etanol não afeta o recrutamento de fatores de transcrição, mas aumenta sua interação com HDAC1 no promotor de CPT-1A. Hepatócitos primários foram deixados não tratados (UT) ou tratados com 50 mmol/L de etanol por 12 horas (Etanol). As células foram pré-tratadas com butirato de sódio (NaB, 2 mmol/L) por 30 minutos antes do etanol (Etanol + NaB). A análise de ChIP foi realizada utilizando fragmentos de cromatina imunoprecipitados com (A) anticorpos anti-SP1 e (B) anti-HNF4α, e a PCR quantitativa em tempo real de ChIP foi realizada utilizando pares de primers específicos para a região I e região II, respectivamente, no promotor de CPT-1A. A cromatina não imunoprecipitada foi utilizada como input. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como médias ± DP, n = 4. Valor de P < 0,05 (a) quando comparado com UT e (b) quando comparado com etanol. (C) A análise de Re-ChIP mostra a co-ocupação de fatores de transcrição e HDAC-1 no promotor de CPT-1A. A cromatina foi coletada de hepatócitos primários e o re-ChIP foi realizado. Os anticorpos anti-SP1 ou anti-HNF4α ou Imunoglobulina G de Coelho (RIgG) foram usados para a primeira reação de ChIP, seguida por re-ChIP com anticorpo anti-HDAC1. A análise quantitativa de ChIP-PCR foi realizada de maneira semelhante à descrita anteriormente para a análise de ChIP para ambas as regiões I e II do promotor de CPT-1A. O enriquecimento relativo foi normalizado com o input. As imagens representativas do gel são mostradas para cada reação de re-ChIP. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como médias ± DP, n = 4 experimentos. Valor de P < 0,05 (a) quando comparado com UT e (b) quando comparado com etanol.
Após as alterações na ligação de HDAC1 às regiões promotoras I e II, também examinamos os efeitos do etanol e do butirato nos fatores de transcrição críticos SP1 e HNF4α, que são conhecidos por se ligarem às mesmas regiões promotoras. Curiosamente, o tratamento com etanol não teve efeito sobre a ligação de SP1 ou HNF4α na região I ou região II, respectivamente (Figura 5A e B), indicando uma alteração em sua capacidade de interagir com HDAC1. Portanto, examinamos ainda o efeito do etanol na ligação de HDAC1 a SP1 e HNF4α por análise sequencial de ChIP/re-ChIP. Especificamente, a cromatina coletada de hepatócitos primários tratados foi analisada usando SP1 ou HNF4α como primeiro anticorpo de ChIP, seguido por HDAC1 como segundo anticorpo (re-ChIP). Os dados mostraram que o etanol aumenta significativamente a co-ocupação de HDAC1 com SP1 na região I e HNF4α na região II (Figura 5C). Importantemente, o pré-tratamento com butirato inibiu significativamente a interação de HDAC1 com esses fatores de transcrição (Figura 5C). Esses dados indicam que a exposição ao etanol facilitou a interação de SP1 e HNF4α com HDAC1, levando ao seu aumento de ligação e remodelação da cromatina transcricionalmente repressiva do promotor de CPT-1A.
O butirato impede as alterações mediadas pelo etanol no recrutamento do coativador 1α do receptor ativado por proliferador peroxissomal gama e p300 para o gene CPT-1A.
O butirato previne a diminuição mediada pelo etanol no recrutamento de PGC-1α e p300 para o promotor de CPT-1A. Hepatócitos primários foram deixados não tratados (UT) ou tratados com 50 mmol/L de etanol por 12 horas (Etanol). As células foram pré-tratadas com butirato de sódio (NaB 2 mmol/L) por 30 minutos antes do etanol (Etanol + NaB). A análise de ChIP foi realizada utilizando fragmentos de cromatina imunoprecipitados com anticorpos (A) anti-PGC-1α e (D) anti-p300. A PCR quantitativa em tempo real de ChIP foi realizada usando pares de iniciadores específicos para as regiões I e II no promotor de CPT-1A. A cromatina não imunoprecipitada foi usada como entrada (input). (C e E) Detecção dos níveis proteicos de PGC-1α e p300 por análise de Western blot em tecidos hepáticos de camundongos. Os blots foram removidos e reprovados com anticorpo de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como controle de carregamento. A razão de densidade para cada banda em comparação com sua GAPDH é mostrada em um gráfico de barras adjacente. (B) Os níveis de mRNA de PGC-1α foram analisados por PCR em tempo real quantitativo (qPCR) e normalizados para o mRNA de β-actina. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como médias ± DP, n = 4 experimentos. Valor de P < 0,05 (a) quando comparado com UT e (b) quando comparado com etanol.
O coativador-1α do receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo (PGC-1α) é um coativador transcricional chave da expressão do gene CPT-1A que é afetado pelo etanol. O PGC-1α é recrutado para a região II da repetição direta distal 1 (DR-1) do promotor de CPT-1A por meio de sua interação com HNF4α e é conhecido por aumentar a transcrição de CPT-1A. A análise de ChIP mostrou que o etanol diminuiu significativamente a ligação de PGC-1α, o que foi prevenido e ainda mais aumentado pelo tratamento com butirato (Figura 6A). Para abordar o aumento mediado pelo butirato no recrutamento de PGC-1α, examinamos seu efeito na expressão de PGC-1α. O butirato levou a um aumento marcante na expressão do gene PGC-1α em hepatócitos primários tratados com etanol (Figura 6B e C). Além disso, conforme mostrado anteriormente (Figura 5), o tratamento com butirato também aumentou o recrutamento de HNF4α no sítio distal da região II da DR-1, potencialmente contribuindo para o aumento da ligação de PGC-1α (Figura 6A). Em conjunto, esses dados indicam que a diminuição mediada pelo etanol na expressão de PGC-1α e na ligação ao DNA levou a um aumento coordenado no recrutamento de HDAC1 para o promotor de CPT-1A. Significativamente, esses efeitos do etanol são revertidos pelo butirato, por meio da inibição de HDAC1 e do aumento da expressão e ligação de PGC-1α.
PGC-1α como coativador pode recrutar HATs, particularmente p300, o que aumenta a acetilação das histonas do promotor e a ativação transcricional. Além disso, p300 também pode ser potencialmente recrutado para a região I do promotor CPT-1A via interação com SP1. Portanto, examinamos o recrutamento de p300 para o promotor CPT-1A na região II. Em correlação com a diminuição da ligação de PGC-1α, o tratamento com etanol também levou a uma diminuição na ligação de p300 na região II (Figura 6D). De forma análoga à região II, o tratamento com etanol também diminuiu significativamente a ligação de p300, acompanhado por um aumento concomitante na ligação de HDAC1 na região I (Figura 6B). Esses dados sugerem que a diminuição mediada pelo etanol na p300-HAT e o aumento correspondente na ligação de HDAC1 culminam na hipoacetilação do promotor CPT-1A. Significativamente, o tratamento com butirato neutraliza esses efeitos do etanol mediados por HDAC1, aumentando a ligação de p300 tanto nas regiões distal quanto proximal do promotor CPT-1A.
Butirato Aumenta a Ligação da RNA Polimerase II
Butirato aumenta o recrutamento de RNA Pol II para o promotor CPT-1A. Hepatócitos primários foram deixados sem tratamento (UT) ou tratados com 50 mmol/L de etanol por 12 horas (Etanol). As células foram pré-tratadas com butirato de sódio (NaB, 2 mmol/L) por 30 minutos antes do etanol (Etanol + NaB). A análise de ChIP foi realizada usando fragmentos de cromatina imunoprecipitados com anticorpo anti-RNA Pol II e a PCR quantitativa em tempo real de ChIP foi realizada usando pares de primers específicos para a região I do promotor CPT-1A. Cromatina não imunoprecipitada foi usada como input. Os dados foram analisados por análise de variância e representados como média ± DP, n = 4. Valor de P < 0,05 (a) quando comparado com UT e (b) quando comparado com etanol.
Em correlação com a diminuição da ligação de PGC-1α e p300 e um aumento simultâneo na ligação de HDAC1 e hipoacetilação das histonas do promotor, o etanol interrompeu o complexo transcricional, conforme indicado pela diminuição no recrutamento da RNA polimerase II (Pol II) no promotor CPT-1A (Figura 7). Importante, o butirato preveniu esses efeitos epigenéticos repressivos induzidos pelo etanol e levou a um aumento no recrutamento de RNA Pol II e na transcrição do gene CPT-1A (Figura 7).
A CPT-1A hepática promove a manutenção do metabolismo lipídico. A regulação positiva da expressão da CPT-1A hepática ocorre em resposta a hormônios e nutrientes, enquanto a regulação negativa da expressão da CPT-1A hepática é observada sob condições de álcool ou dieta rica em gordura, bem como em ritmos circadianos alterados que afetam o metabolismo celular. No entanto, os mecanismos moleculares, especificamente as modificações epigenéticas da cromatina que contribuem para as alterações induzidas pelo etanol na transcrição da CPT-1A, não foram completamente elucidados. No presente estudo, identificamos mecanismos epigenéticos associados ao promotor da CPT-1A que fundamentam tanto a desregulação fisiológica quanto a patológica mediada pelo etanol da expressão do gene CPT-1A. Além disso, a proteção do Tb contra danos intestinais e hepáticos mediados pelo etanol foi relatada, mas seu papel como inibidor dietético de HDAC na regulação epigenética precisa de investigação detalhada. Assim, determinamos os efeitos terapêuticos do butirato que visam a desregulação epigenética da expressão da CPT-1A impulsionada pelo etanol e atenuam a esteatose hepática.
Examinamos inicialmente o estado da acetilação de histonas do promotor da CPT-1A, que indica o estado transcricionalmente permissivo da cromatina (Figura 3). De acordo com a expressão basal da CPT-1A, hepatócitos primários controle não tratados apresentavam acetilação H3K9Ac da histona do promotor tanto nas regiões proximais quanto distais I e II. Significativamente, sob condições patológicas de exposição ao etanol, o etanol diminuiu os níveis de H3K9Ac do promotor e, correspondentemente, diminuiu os níveis de mRNA da CPT-1A (Figura 3). Esses dados sugerem que o etanol induz a desacetilação da histona do promotor, indicando uma configuração repressiva da cromatina que afeta a expressão do mRNA da CPT-1A. O estado da acetilação da histona do promotor é regulado pela interação entre HATs e HDACs. Nossos dados obtidos identificaram que a HDAC1 é a HDAC predominante recrutada para o promotor da CPT-1A, levando à desacetilação de histonas e à regulação negativa da expressão gênica. Os efeitos protetores do butirato, um inibidor dietético de HDAC, apoiam ainda mais o papel regulador da HDAC1. O butirato inibiu o recrutamento da HDAC1 induzido pelo etanol e a consequente desacetilação e supressão transcricional da CPT-1A. Além disso, os efeitos do inibidor específico da HDAC1, que inibiu a regulação negativa da expressão do mRNA da CPT-1A induzida pelo etanol, também apoiaram o papel mecanístico da HDAC1 (Figura 4).
Significativamente, como as HDACs não se ligam diretamente ao DNA, os dados obtidos de nossa análise de ChIP/re-ChIP sequencial mostraram que SP1 e HNF4α estavam envolvidos no recrutamento de HDAC1 para o promotor de CPT-1A nas regiões I e II em hepatócitos tratados com etanol (Figura 5). É digno de nota que, em condições fisiológicas normais, tanto HNF4α quanto SP1 funcionam como fatores transcricionais necessários para a expressão hepática do mRNA de CPT-1A. Diante disso, nossos dados mostram que, em hepatócitos, o etanol altera a função transcricional de SP1 e HNF4α, levando ao recrutamento de HDAC1 para as regiões I e II do promotor de CPT-1A, e medeia a repressão transcricional. De fato, tanto HNF4α quanto SP1, além da ativação transcricional, também demonstraram funcionar como repressores transcricionais de maneira específica ao tipo celular, estímulo e gene. Em conjunto, os dados indicam que, em hepatócitos, o tratamento com etanol pode influenciar a função de HNF4α e SP1, levando a uma transição de ativadores transcricionais para repressores que fundamentam a regulação negativa induzida por etanol da expressão do gene CPT-1A.
Em relação aos efeitos protetores, além de inibir a ligação de HDAC1, o butirato aumentou coordenadamente a ligação de HNF4α juntamente com o coativador PGC-1α na região distal DR-1 II (Figura 6). O efeito do butirato no aumento da ligação de HNF4α é significativo porque HNF4α é um fator de transcrição importante que regula a transcrição de CPT-1A. Importante, o butirato também aumentou a ligação de PGC-1α, um coativador transcricional de CPT-1A que foi diminuído pelo etanol. A interação de HNF4α e PGC-1α na região distal DR-1 II, que pode ocorrer de maneira independente de ligante, é importante para a ativação transcricional do gene CPT-1A. Vale notar, a função transcricional de HNF4α é substancialmente aumentada quando coativada por PGC-1α. O butirato, juntamente com a ligação de PGC-1α, também ativou robustamente a expressão do mRNA de PGC-1α em hepatócitos tratados com etanol. Essas descobertas indicam que os efeitos negativos do etanol na transcrição e função de PGC-1α também podem ser prevenidos pelo butirato. Além disso, o butirato, semelhante a outros ácidos graxos de cadeia curta, pode atuar como ligante para PPARα, ativando sua expressão. Sabe-se também que PPAR pode se ligar às regiões intrônicas e regular a transcrição e expressão indutível do gene CPT-1A. Como foi observado que o etanol diminui a expressão e função indutível de PPARα, o Tb/butirato potencialmente também poderia neutralizar esse efeito, contribuindo assim para sua função protetora. A regulação epigenética mediada por etanol e butirato da expressão e função do gene PGC-1α, bem como do PPARα, está atualmente sob investigação.
Embora o PGC-1α interaja e coative o fator de transcrição do receptor nuclear HNF4α, ele não possui atividade de acetiltransferase de histonas necessária para a acetilação de histonas e função de cromatina transcricionalmente permissiva. Consequentemente, no contexto da expressão do gene CPT-1A, foi sugerido que o PGC-1α interage ainda com outros coativadores. Em particular, foi demonstrado que o PGC-1α interage com coativadores HAT, incluindo p300, e funciona cooperativamente para mediar a acetilação de histonas do promotor e a ativação transcricional de certos genes. Nesse sentido, os dados obtidos mostraram que uma diminuição induzida por etanol na ligação do PGC-1α também levou a uma diminuição concomitante no recrutamento de p300-HAT e a uma consequente diminuição na acetilação basal de H3K9 e na transcrição de CPT-1A. Além da região distal DR-1 II, o p300-HAT também poderia ser potencialmente recrutado para a região promotora proximal I por meio de sua interação com o fator de transcrição SP1. O p300-HAT pode atuar como coativador para a transcrição mediada por SP1, efetuando a acetilação de histonas do promotor. Com relação à transcrição de CPT-1A, o SP1 liga-se à região proximal (aproximadamente -200 nucleotídeos) do gene CPT-1A sem TATA e desempenha um papel essencial em sua expressão basal. Os resultados obtidos mostram que o p300-HAT interage com o SP1 na região I e participa da acetilação de histonas do promotor e da transcrição basal de CPT-1A.
Semelhante ao efeito inibitório no recrutamento de p300-HAT na região II, o etanol também diminuiu sua ligação à região I, o que se correlacionou com uma diminuição na acetilação de H3K9 do promotor e na transcrição de CPT-1A. Significativamente, o butirato bloqueou claramente os efeitos negativos do etanol, possibilitando as interações HNF4α/PGC-1α/p300 na região distal DR-1 II e a interação SP1/p300 na região proximal I, levando à acetilação de histonas do promotor e à transcrição de CPT-1A.
Em conclusão, os presentes estudos fornecem evidências para os mecanismos epigenéticos repressivos transcricionais induzidos por etanol e mediados por HDAC1 que regulam negativamente a expressão do gene CPT-1A, contribuindo para a esteatose hepática. Nossos resultados também mostram que Tb/butirato pode inibir efetivamente o recrutamento de HDAC1 induzido por etanol para as regiões promotoras de CPT-1A e a supressão da expressão gênica, atenuando a esteatose hepática e a lesão. Além disso, o exame do estado da cromatina da região promotora de CPT-1A em hepatócitos primários sob condições basais, bem como sob tratamento com etanol e butirato, também identificou a interação dos principais componentes moleculares, nomeadamente HNF4α, PGC-1α, SP1 e p300-HAT na regulação da transcrição de CPT-1A. Em conjunto, esses dados identificam o papel patogênico da HDAC1 na esteatose hepática e lesão induzidas por etanol que pode servir como um potencial alvo terapêutico na estratégia de tratamento para a ALD.
Materiais e Métodos
Oito camundongos machos C57BL/6N com oito semanas de idade foram obtidos da Harlan (Indianápolis, IN). Todos os camundongos foram mantidos em uma instalação animal livre de patógenos, com temperatura controlada e credenciada pela Associação para Avaliação e Acreditação do Cuidado com Animais de Laboratório, com ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os experimentos foram realizados de acordo com os critérios descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Louisville. Os camundongos foram alimentados com uma dieta líquida modificada Lieber-DeCarli enriquecida com gordura insaturada (óleo de milho), a qual forneceu 40% da energia proveniente de gordura, 43% de carboidratos e 17% de proteína (Research Diet, New Brunswick, NJ).
Os camundongos foram alimentados de forma pareada com uma dieta líquida Lieber-DeCarli contendo etanol ou maltose dextrina isocalórica por 4 semanas. O etanol foi aumentado gradualmente ao longo de um período de 1 semana e, em seguida, os camundongos foram alimentados com a dieta de etanol (5% vol/vol) ad libitum por 4 semanas. Os camundongos controle alimentados de forma pareada receberam a dieta líquida contendo maltose-dextrina isocalórica. Para os grupos de tratamento com Tb, tanto os camundongos alimentados de forma pareada (Tb) quanto os alimentados com etanol (EF + Tb) receberam Tb (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) por gavagem oral (2 g/kg, 5 dias/semana) por 4 semanas.
Análise de Butirato por Cromatografia Gasosa–Espectrometria de Massas
Amostras de plasma foram derivatizadas com brometo de pentafluorobenzila e extraídas com hexano. O extrato de hexano foi analisado por cromatografia gasosa–espectrometria de massas usando uma coluna Agilent DB-225 J&W GC (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA) com um gradiente de temperatura de 50°C a 220°C a 30°C/min, a uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min com hélio como gás de arraste. A detecção foi por ionização por elétrons e monitoramento de íons seletivos de m/z 256 para a amostra e m/z 257 para o padrão de butirato marcado com 13C. Usando a área do pico para os derivados marcados e não marcados correspondentes, uma curva padrão foi gerada plotando as razões 12C/13C contra a concentração das soluções. A inclinação e o intercepto foram usados para determinar a concentração de butirato nas amostras.
Exame Histopatológico do Fígado
Para análise histológica, secções de fígado foram fixadas em formalina tamponada a 10% por 24 horas e embebidas em parafina. Secções de tecido foram coradas com H&E e examinadas sob microscopia de luz.
Coloração com Oil Red O
Para examinar a quantidade de acúmulo de gordura, as secções de fígado foram coradas com Oil Red O. Secções de fígado congeladas foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato duas vezes por 5 minutos. Oil Red O e propilenoglicol a 85% foram adicionados com agitação por 15 minutos, seguido por lavagem em água corrente.
Os triglicerídeos totais do fígado foram extraídos do tecido hepático de camundongos e quantificados usando reagentes para triglicerídeos (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) conforme descrito anteriormente. Resumidamente, o tecido hepático (100 mg) foi homogeneizado em NaCl 50 mmol/L. O homogenato (500 μL) foi misturado com clorofórmio/metanol (2:1, 4 mL) e incubado durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave. Os homogenatos foram vortexados e centrifugados por 5 minutos a 3000 × g. A fase lipídica inferior foi coletada e concentrada a vácuo. Os pellets lipídicos foram dissolvidos em Triton X-100 a 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em solução salina tamponada com fosfato, e o conteúdo de triglicerídeos hepáticos foi determinado por métodos colorimétricos enzimáticos.
Coloração Imuno-histoquímica
Secções de fígado de camundongos foram coradas com um anticorpo comercialmente disponível contra CPT-1A (Proteintech Group, Inc, Chicago, IL) de acordo com os protocolos do fabricante.
Cultura de Células e Tratamentos
Todas as células foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 U/mL de penicilina e 10 g/mL de estreptomicina. As células foram mantidas em incubadora a 37°C com 5% de CO2. As células foram plaqueadas e incubadas durante a noite antes do tratamento, em todos os experimentos. As células não foram tratadas e/ou tratadas com etanol (50 mmol/L) pelos tempos indicados. O tratamento com butirato de sódio (2 mmol/L) foi realizado 30 minutos antes da exposição ao etanol (etanol + butirato de sódio). O inibidor de HDAC entinostat foi adquirido da Selleckchem (Houston, TX).
Isolamento de RNA e Análise de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
O RNA total foi isolado usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o DNA complementar foi sintetizado usando Quanta qScript (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD). A reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foi realizada com Quanta Perfecta SYBR green fast mix e o sistema de detecção de sequência ABI prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão gênica relativa foi analisada usando o método delta delta Ct (2-ΔΔCt), normalizando com a expressão do gene β-actina em todos os experimentos e apresentada como variação (fold change) em relação ao grupo de tratamento não tratado/pareado por alimentação (pair-fed), que foi definido como 1.
Os primers de mRNA de CPT-1A de rato foram os seguintes: forward: CTGCATGGAAGATGCTTTGA, reverse: GCCATGACATACTCCCACAA; os primers de mRNA de CPT-1A de camundongo foram os seguintes: forward: GCTGCACTCCTGGAAGAAGA, reverse: GGAGGGGTCCACTTTGGTAT; e os primers de mRNA de β-actina de camundongo/rato foram os seguintes: forward: CAGCTGAGAGGGAAATCGTG, reverse: CTCCAGGGAGGAAGAGGATG.
Atividade Total de HDAC
A atividade total de HDAC nos hepatócitos primários foi estimada usando um kit de ensaio de atividade/inibição de HDAC comercialmente disponível (colorimétrico) de acordo com o protocolo do fabricante (Epigentek, Farmingdale, NY).
O ensaio de ChIP foi realizado utilizando o protocolo de ensaio de ChIP estabelecido no laboratório. Os anticorpos de ChIP direcionados contra anti-acetil H3K9 (17-615), anti-HDAC1(17-608), anti-HDAC3 (17-10238), anti-p300 (05-257), anti-SP1 (17-601) e anti-RNA polimerase II (17-672) foram adquiridos da EMD Millipore (Burlington, MA), anti–PGC-1α (Sc-13067) (Santa Cruz, Dallas, TX) e anti-HNF4α (ab41898) (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Primers de ChIP-PCR desenhados para as regiões do CPT-1A foram utilizados e suas sequências são detalhadas posteriormente. Os dados foram analisados como a mudança de ocupação diferencial (fold change). Os resultados de ChIP-PCR quantitativo em tempo real foram calculados pelo método ΔΔCt, no qual o valor de Ct de cada fração de DNA do ChIP foi normalizado em relação à fração de DNA de entrada. O ChIP-PCR semiquantitativo foi realizado e analisado por eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio utilizando primers específicos para o promotor do CPT-1A (Figura 3C).
Três primers de ChIP-PCR foram desenhados para cada região do promotor do CPT-1 de rato e 1 primer para o promotor do CPT-1 de camundongo. As sequências dos primers foram as seguintes: região I do promotor do CPT-1 de camundongo: TRE forward: GGTGACGTTGGCTGAGCAA e TRE reverse: TGAGCCCCTGTACACGTTTTG; região I do promotor do CPT-1 de rato: Chp2_forward: ATGGGCATGGCTTTAATGAG e Chp2_reverse: GGCTAGGACCCGAGCTTGT; GCTSspn_forward: AGCCTCGCCCGCCCCTGCTC e GCTSspn_reverse: CAGCGCTGCCCTCCCGGTGTC; e GCTSspn_forward: TCCAGGCCCCGCCCCGTCCT e GCTSspn_reverse: GCGCCGCGGGTGATTGGCTGA. Região II do promotor do CPT-1 de rato: TRE forward: GGTGACGTTGGCTGAGCAA e TRE reverse: TGAGCCCCTGTACACGTTTTG; TrChp_forward: GCCTCATGGACTCCAAGTTC e TrChp_reverse: TATTTGTTCAGCCAGCGTCA; e TrChp_forward: CAAAACGTGTACAGGAGCTCAA e CPT-1 TrChp_reverse: TAATCCCAGAAGGCAGTGCT.
O método de re-ChIP foi realizado conforme descrito anteriormente para detectar a ligação de HDAC-1 com fatores de transcrição. Brevemente, a cromatina foi preparada e a primeira reação de ChIP foi montada para anti–SP-1, anti–HNF4α e controle anti–IgG conforme mencionado no método de ensaio de ChIP anteriormente. Após a incubação overnight, as esferas foram sedimentadas e lavadas uma vez cada com tampão 1 (0,1% de dodecil sulfato de sódio, 1% de Triton X-100, 2 mmol/L de EDTA, 20 mmol/L de Tris–HCl [pH 8,0], 150 mmol/L de NaCl), tampão 2 (0,1% de dodecil sulfato de sódio, 1% de Triton X-100, 2 mmol/L de EDTA, 20 mmol/L de Tris–HCl [pH 8,0], 500 mmol/L de NaCl), tampão 3 (1% de NP40, 1% de ácido desoxicólico, 1 mmol/L de EDTA, 10 mmol/L de Tris–HCl [pH 8,0], 250 mmol/L de LiCl) e tampão 4 (2 mmol/L de EDTA, 10 mmol/L de Tris–HCl [pH 8,0]). Após a lavagem final, os complexos DNA–proteína foram eluídos com 50 μL de 10 mmol/L de ditiotreitol a 37°C por 30 minutos com agitação suave. As esferas foram sedimentadas, o sobrenadante foi diluído pelo menos 20 vezes com tampão de diluição de ChIP, e a reação de ChIP secundária foi realizada usando anticorpo anti–HDAC-1. Após incubação overnight com o segundo anticorpo, as etapas de lavagem com os tampões 1–4 foram repetidas. O DNA foi eluído das esferas e purificado de forma semelhante ao ensaio de ChIP. Os iniciadores de ChIP-PCR desenhados para as regiões I e II do promotor de CPT-1A foram usados para determinar a co-ocupação do fator de transcrição e HDAC-1. O enriquecimento de proteína co-ocupada foi detectado usando o método ΔΔCt, no qual o valor de Ct de cada fração de DNA de ChIP foi normalizado para a fração de DNA de entrada conforme descrito no método de análise de ChIP e ChIP-PCR quantitativo.
Análise Estatística
Os dados são apresentados como médias ± EPM para o número indicado de experimentos realizados de forma independente ou 4–6 camundongos por grupo. O teste t de Student e a análise de variância de uma via com testes de comparação múltipla de Bonferroni foram usados para a determinação da significância estatística. P < .05 foi considerado significativo.
Todos os autores tiveram acesso a todos os dados e revisaram e aprovaram o manuscrito final.
Referências
Diagnóstico e manejo da doença hepática alcoólica
Tendências no manejo e na carga da doença hepática alcoólica
Diretriz clínica do ACG: doença hepática alcoólica
Esteatose hepática: espectador inocente ou parte culpada?
Esteatose induzida por álcool em células hepáticas
Regulação diferencial das isoformas do gene da carnitina palmitoiltransferase-I (CPT-I alfa e CPT-I beta) no coração de rato
O sistema mitocondrial da carnitina palmitoiltransferase. Do conceito à análise molecular
Importação de ácidos graxos para as mitocôndrias
Receptores ativados por proliferadores de peroxissomos: controle nuclear do metabolismo
Enzimas de beta-oxidação peroxissomal
Efeitos da alimentação com etanol na atividade e regulação da carnitina palmitoiltransferase I hepática
HDAC3 induzida por etanol em binge regula negativamente a expressão de Cpt1alpha levando à esteatose e lesão hepática
A inativação gênica específica do fígado do fator de transcrição ATF4 alivia a esteatose hepática alcoólica em camundongos
Patogênese da doença hepática alcoólica
Modificações de histonas e doença hepática induzida por álcool: nutrientes alterados são o elo perdido?
Acecilação seletiva de genes da histona H3 na ausência de aumento na acetilação global de histonas no fígado de ratos alimentados cronicamente com álcool
Acetato, o modulador chave das respostas inflamatórias na hepatite alcoólica aguda
Interação física e funcional HAT/HDAC regula o equilíbrio da acetilação de proteínas
Acecilação de histonas: um interruptor entre cromatina repressiva e permissiva. Segundo artigo da série de revisão sobre dinâmica da cromatina
A expressão do gene da carnitina palmitoiltransferase I (CPT-Ialfa) do fígado de rato é regulada por Sp1 e fator nuclear Y: localização cromossômica e caracterização do promotor
O coativador PGC-1 está envolvido na regulação da expressão do gene da carnitina palmitoiltransferase I do fígado por cAMP em combinação com HNF4 alfa e proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP (CREB)
Ingredientes flavonoides do extrato de folha de Ginkgo biloba regulam o metabolismo lipídico através da regulação positiva da carnitina palmitoiltransferase 1A mediada por Sp1
Correpressor do receptor nuclear e histona desacetilase 3 governam a fisiologia metabólica circadiana
Eixo intestino-fígado na doença hepática alcoólica
O consumo crônico de etanol altera os metabólitos do conteúdo gastrointestinal de mamíferos
Análises metagenômicas de alterações patogênicas induzidas por álcool no microbioma intestinal e o efeito do tratamento com Lactobacillus rhamnosus GG
Inibição da atividade da histona desacetilase pelo butirato
A administração oral de tribuirina aumenta a concentração de butirato na veia porta e previne lesão hepática induzida por lipopolissacarídeo em ratos
A atividade quimiopreventiva do inibidor da histona desacetilase tribuirina na carcinogênese do cólon envolve a indução de apoptose e redução do dano ao DNA
Butirato como agente diferenciador: farmacocinética, análogos e status atual
O tratamento profilático com tribuirina mitiga a lesão da barreira intestinal e hepática induzida por consumo crônico-intermitente de álcool
O resveratrol alivia a esteatose hepática alcoólica em camundongos
A ativação parácrina dos receptores CB1 hepáticos por endocanabinoides derivados de células estreladas medeia a esteatose hepática alcoólica
A esteatose hepática microvesicular e a lesão induzidas por consumo excessivo de álcool estão associadas à regulação negativa de Hdac 1, 7, 9, 10, 11 hepáticos e regulação positiva de Hdac 3
A histona desacetilase 1 pode reprimir a transcrição ao se ligar a Sp1
A deficiência hepática de HNF4alfa induz a expressão periportal da glutamina sintetase e de outras enzimas pericentrais
Efeito do consumo crônico de álcool sobre SIRT1 e PGC-1alfa hepáticos em ratos
Coordenação da remodelação da cromatina mediada por p300 e da função TRAP/mediador através do coativador PGC-1alfa
A desacetilação de Sp1 induzida por éster de forbol recruta p300 para ativar a transcrição do gene da 12(S)-lipoxigenase
O coativador-1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama (PGC-1 alfa) potencializa a indução pela tireoide do hormônio da carnitina palmitoiltransferase I (CPT-I alfa)
Regulação circadiana e dopaminérgica dos genes da via de oxidação de ácidos graxos na retina e em células fotorreceptoras
Efeitos de longo prazo de dietas ricas em gordura ou ricas em carboidratos na tolerância à glicose em camundongos com deficiência heterozigótica de carnitina palmitoiltransferase-1a (CPT-1a): influência da dieta em camundongos deficientes em CPT1a
O tratamento profilático com tributirina mitiga a lesão da barreira intestinal e hepática induzida por etanol crônico-intermitente
A suplementação com tributirina protege camundongos da lesão intestinal aguda induzida por etanol
Regulação de histona acetiltransferases e desacetilases
O fator nuclear 4alfa do hepatócito coordena uma rede de fatores de transcrição que regula o metabolismo hepático de ácidos graxos
Inibidores de histona desacetilase modulam a regulação transcricional do gene do receptor do peptídeo natriurético tipo A/guanyilil ciclase: papéis interativos de histonas modificadas, histona acetiltransferase, p300 e Sp1
Regulação da resposta hepática ao jejum pelo coativador 1alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama (PGC-1): necessidade do fator nuclear 4alfa do hepatócito na gliconeogênese
O propionato promove a oxidação de ácidos graxos através da regulação positiva do receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo em células epiteliais intestinais
Indução de peroxissomos por probióticos produtores de butirato
O butirato de sódio e seu derivado amida sintético modulam comportamentos nociceptivos em camundongos
Ácidos graxos de cadeia curta estimulam a síntese de angiopoietina-like 4 em células de adenocarcinoma de cólon humano ativando o receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo
O receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo (PPARalfa) e o coativador gama de PPAR (PGC-1alfa) induzem a carnitina palmitoiltransferase IA (CPT-1A) através de elementos gênicos independentes
A expressão do gene do receptor ativado por proliferador de peroxissomo está diminuída na doença hepática alcoólica experimental
O CMZ reverteu a perturbação do PPAR-alfa induzida por etanol crônico, possivelmente suprimindo o estresse oxidativo e a acetilação do PGC-1alfa, e ativando as vias MAPK e GSK3beta
Regulação das vias mediadas pelo receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo em camundongos deficientes em citocromo P450 2E1 alimentados com álcool
Ativação do coativador 1 do receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo através da ancoragem do fator de transcrição
Sp1, histona-3 acetilada e p300 regulam a transcrição de TRAIL: mecanismos de proliferação e migração de VSMC mediadas por PDGF-BB
A metilação e acetilação coordenadas da histona H3 regulam a expressão gênica fisiológica e patológica do ligante Fas em células T CD4+ humanas
Protocolo de imunoprecipitação sequencial da cromatina: ChIP-reChIP
Contribuições dos autores Shirish Barve foi responsável pelo delineamento do estudo e pelo conceito; Hridgandh Donde e Smita Ghare realizaram os experimentos; JingWen Zhang realizou a análise histológica animal; Manicka V. Vadhanam, Pawel Lorkiewicz e Sanjay Srivastava realizaram a análise por cromatografia gasosa–espectrometria de massas; Smita Ghare, Hridgandh Donde, Leila Gobejishvili, Craig J. McClain e Shirish Barve analisaram e interpretaram os dados; Smita Ghare, Hridgandh Donde, Swati Joshi-Barve, Craig J. McClain e Shirish Barve prepararam o manuscrito; e todos os autores discutiram os resultados e comentaram criticamente o manuscrito.
Conflitos de interesse Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Financiamento A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelos prêmios P20GM113226 (C.J.M. e S.B.) e P20GM103492 (S.S.) do ; pelos prêmios P50AA024337 (C.J.M. e S.B.), RO1AA024405 (S.B.) e UO1AA022618 (S.B.) do ; e pelo prêmio P42ES023716 (S.S.) do . O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos National Institutes of Health.