pmid: "35296712"
title: "Butirato derivado do intestino suprime a inflamação da superfície ocular."
authors: "Schaefer L, Hernandez H, Coats RA, Yu Z, Pflugfelder SC, Britton RA, de Paiva CS"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2022 Mar 16"
doi: "10.1038/s41598-022-08442-3"
source: "PMC Full Text"

Butirato derivado do intestino suprime a inflamação da superfície ocular.

Autores

Schaefer L, Hernandez H, Coats RA, Yu Z, Pflugfelder SC, Britton RA, de Paiva CS

Periodico

Scientific reports (2022 Mar 16)

Conteudo

Butirato derivado do intestino suprime a inflamação da superfície ocular
O olho seco é uma doença inflamatória ocular comum caracterizada por instabilidade do filme lacrimal e redução da produção de lágrimas. Há evidências crescentes de que a homeostase da superfície ocular é impactada pelo microbioma intestinal. Temos interesse em investigar o papel potencial de pequenas moléculas produzidas por microrganismos na mediação da interação entre o microbioma intestinal e a superfície ocular. Uma dessas moléculas é o butirato, um ácido graxo de cadeia curta (AGCC) produzido por certos membros da microbiota intestinal por meio da fermentação de fibras alimentares. Aqui mostramos que o transportador de AGCC SLC5A8 é expresso in vivo no epitélio conjuntival e corneal murino. O pré-tratamento de culturas de epitélio corneal in vitro ou de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) com fenilbutirato (PBA) reduz a expressão pró-inflamatória de Tnf induzida por lipopolissacarídeo. Culturas de epitélio corneal e BMDCs isoladas de camundongos knockout para Slc5a8 são incapazes de responder ao pré-tratamento com PBA, sugerindo que SLC5A8 é necessário para o efeito protetor do PBA. O tratamento de camundongos submetidos ao estresse dessecante (DS) com tributirina oral, uma forma pró-fármaco do butirato, reduz a inflamação na superfície ocular in vivo, e esse efeito requer parcialmente o SLC5A8. Finalmente, a análise de expressão em tecido conjuntival isolado de camundongos submetidos ao DS com e sem tratamento com tributirina revelou que o tratamento reduziu a expressão de genes envolvidos na sinalização de interferon tipo I. Em conjunto, esses dados apoiam nossa hipótese de que os AGCCs produzidos no intestino participam da manutenção da homeostase da superfície ocular.
Introdução
O olho seco é uma condição crônica multifatorial na qual os olhos não produzem lágrimas suficientes ou apresentam uma ruptura na estabilidade do filme lacrimal. Os principais fatores de risco incluem envelhecimento, sexo feminino, uso de lentes de contato, tabagismo e ambientes com baixa umidade. O filme lacrimal instável e hiperosmolar no olho seco desencadeia uma cascata inflamatória autoperpetuadora envolvendo células imunes inatas e adaptativas e causa irritação ocular, hiperemia, fadiga ocular e visão turva. A inflamação na superfície ocular resulta em apoptose de células caliciformes no epitélio conjuntival, ruptura da barreira epitelial da córnea e inflamação e disfunção da glândula lacrimal. Em casos graves, isso pode causar doença epitelial da córnea ameaçadora à visão e ulceração.
As bactérias comensais que habitam o trato gastrointestinal têm efeitos de longo alcance na saúde e homeostase no intestino e em locais distais do corpo, incluindo o cérebro, os ossos e órgãos de barreira como pulmão, rim e olho. Uma função importante mediada pela microbiota intestinal é a manutenção da homeostase imune nos tecidos de barreira mucosa por todo o corpo. A superfície ocular representa um desses tecidos de barreira; semelhante à barreira luminal intestinal, a córnea está constantemente exposta a estímulos estranhos, como estressores ambientais e patógenos microbianos, e sob condições normais saudáveis mantém um equilíbrio entre tolerância imune e imunidade. A microbiota intestinal influencia as respostas inflamatórias modulando a maturação e função das células imunes, incluindo a promoção da produção de células T reguladoras (Tregs) e células dendríticas tolerogênicas. A falta de bactérias comensais em camundongos livres de germes resulta em tecido linfoide subdesenvolvido, produção deficiente do anticorpo secretor IgA (SIgA) e peptídeos antimicrobianos, e produção anormal de citocinas. De fato, a presença de comensais intestinais demonstrou modular os níveis de SIgA nas lágrimas e no tecido linfoide associado ao olho, pois camundongos livres de germes e tratados com antibióticos apresentam uma diminuição significativa no SIgA ocular e camundongos reconstituídos com certos comensais mostram restauração do SIgA.

A microbiota intestinal normal e saudável também é protetora contra o desenvolvimento de patologia inflamatória do olho seco em um modelo de estresse dessecante murino. Isso é apoiado pela observação de que camundongos livres de germes, criados na ausência de bactérias, desenvolvem espontaneamente ceratoconjuntivite lacrimal; o transplante de microbiota fecal reverte o fenótipo de olho seco em camundongos livres de germes. Da mesma forma, a gravidade da doença ocular em camundongos knockout para CD25, que também desenvolvem espontaneamente doença do olho seco, é piorada pela ruptura da microbiota, seja com tratamento antibiótico ou criando os camundongos em um ambiente livre de germes, e é melhorada pelo subsequente transplante de microbiota fecal.
Um mecanismo pelo qual as bactérias comensais podem impactar seu hospedeiro é através da secreção de fatores que podem interagir com as vias de sinalização das células hospedeiras ou modular a expressão gênica do hospedeiro. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), incluindo butirato, propionato e acetato, são metabólitos produzidos no intestino pela microbiota comensal a partir da fermentação de fibras alimentares. Foi demonstrado que os AGCCs exercem efeitos anti-inflamatórios que se estendem além do cólon para outros sistemas, incluindo impactos nas células imunes adaptativas e inatas, homeostase óssea, cérebro e olho. Conexões claras entre AGCCs no intestino e a saúde ocular foram demonstradas em modelos de uveíte. Além de exercer efeitos indiretamente através dos sistemas imunes adaptativo e inato, o butirato também pode agir diretamente no tecido ocular. A aplicação direta de butirato no olho demonstrou melhorar a cicatrização de feridas e a opacificação da córnea em queimaduras alcalinas através da inibição do inflamassoma NLRP3. No entanto, os efeitos do butirato durante o estresse de ressecamento não foram totalmente investigados. Neste estudo, examinamos o papel potencial do butirato na mediação da interação entre a microbiota intestinal e a superfície ocular.
Materiais e métodos
Animais
Camundongos fêmeas de tipo selvagem (cepa C57BL/6 J) foram adquiridos com 6 a 8 semanas de idade do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA). Camundongos knockout para Slc5a8 foram um presente do Dr. Vadivel Ganapathy (Texas Tech University, Lubbock, Texas) e foram originalmente derivados pelo Dr. Thomas Boettger (Instituto Max Planck, Alemanha). Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Baylor College of Medicine e seguiram a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual. Um total de cem camundongos fêmeas de tipo selvagem e cinquenta camundongos fêmeas knockout para Slc5a8 foram utilizados no decorrer do estudo. O número de camundongos por experimento é fornecido nas seções abaixo e também nas legendas das figuras. No momento da eutanásia, os camundongos tinham de 8 a 12 semanas de idade. Todos os estudos são relatados de acordo com as diretrizes ARRIVE.
O epitélio da córnea e o tecido conjuntival murinos foram coletados de camundongos C57BL/6 J selvagens de acordo com métodos publicados anteriormente. Em resumo, o RNA total foi extraído com o kit de isolamento de RNA Qiagen RNeasy Plus Micro (Qiagen, Germantown, MD, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. Uma amostra equivalia ao tecido agrupado de ambos os olhos de cada animal. O cDNA foi sintetizado usando beads Ready-To-Go First-Strand (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, EUA) e hexâmeros aleatórios (Life Technologies, Grand Island, New York, EUA) com 1 µg de RNA total como molde. A concentração de DNA foi medida com um espectrofotômetro Qubit (Life Technologies). A reação em cadeia da polimerase (PCR) digital foi realizada conforme descrito anteriormente com um sistema QuantStudio 3D Digital PCR (Life Technologies) com o conjunto de iniciadores Taqman Slc5a8 Mm00520629_m1 (Applied Biosystems, Inc. [ABI], Foster City, CA) e normalizada pela concentração de cDNA.
Histologia e Imunocoloração
Para avaliação da morfologia, os olhos e anexos oculares foram excisados, embebidos em parafina e cortados em seções de 8 μm. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E). Para análise de expressão, os olhos e anexos oculares foram excisados, embebidos em blocos de meio Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT; Sakura Finetek, Torrance, CA, EUA) e congelados rapidamente em nitrogênio líquido, depois cortados em seções de 6 μm usando um criostato HM 500 (Waldorf, Alemanha). Seções de tecido de pelo menos 3 animais diferentes foram fixadas em paraformaldeído a 4%, e a expressão proteica foi visualizada com coloração cromogênica usando um anticorpo policlonal de coelho contra SLC5A8 (Proteintech #21,433–1-AP, Rosemont, IL, EUA) de acordo com métodos publicados anteriormente. Seções separadas foram incubadas com IgG de coelho (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como controle negativo para especificidade do anticorpo primário. Os anticorpos foram diluídos de acordo com as recomendações do fabricante em soro de cabra a 5% (Sigma-Aldrich) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As seções foram preparadas para imunohistoquímica usando um kit de bloqueio de avidina/biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) após eliminar peroxidases endógenas com peróxido de hidrogênio a 0,3% e lavar com PBS. As seções foram bloqueadas por 1 h com soro de cabra a 20% em PBS e subsequentemente incubadas com anticorpo primário diluído por 1 h. As imagens foram obtidas com ampliação de 60X para seções coradas com H&E e ampliação de 40X para seções imunocoradas com um microscópio E400 equipado com câmera digital (DS-Qi1Mc; Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EUA).
Córneas murinas foram excisadas sob um microscópio cirúrgico usando tesouras curvas de Castroviejo em um meio hormonal epidérmico suplementado (SHEM) no gelo contendo 5 µg/ml de dispase (Sigma-Aldrich). O meio SHEM foi preparado como uma mistura 1:1 de Meio Eagle Modificado por Dulbecco com alta glicose (Sigma-Aldrich) e meio F-12 de Ham (Sigma-Aldrich) contendo 5 ng/ml de EGF (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), 0,5 mg/ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich), 30 ng/ml de toxina colérica A (Sigma-Aldrich), 0,5% de DMSO (Sigma-Aldrich), 50 mg/ml de gentamicina (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, EUA), 1,25 mg/ml de anfotericina B (Gibco BRL Products, Grand Island, NY, EUA), suplemento líquido de meio ITS 1X (Sigma-Aldrich) e 5% de SFB (Hyclone). As córneas foram cortadas em quatro pedaços iguais, incubadas a 37 °C por 15 min e transferidas com pinças estéreis para meio SHEM sem dispase. Após aproximadamente 10 min, os pedaços foram transferidos para poços de uma placa de cultura de 48 poços com o lado do epitélio para cima, deixados aderir por vários minutos, então cobertos com 200 µl de meio SHEM e incubados a 37 °C em 5% de CO2. 200 µl de meio SHEM fresco foram adicionados a cada 3 dias. No dia 13, o meio foi substituído por 300 µl de meio SHEM sem SFB. No dia 14, metade dos poços foi tratada com 5 µl de 5 mg/ml de fenilbutirato (PBA; Sigma-Aldrich) preparado em uma mistura 1:1 de Meio Eagle Modificado por Dulbecco com alta glicose (Sigma-Aldrich) e meio F-12 de Ham (Sigma-Aldrich) para uma concentração final de 0,5 mM. Os outros poços foram tratados com meio 1:1 sem PBA. Após 2 h, um subconjunto de poços foi tratado com 0,3 µg de lipopolissacarídeo (LPS; Sigma-Aldrich) em meio 1:1, e a placa foi incubada por 4 h a 37 °C em 5% de CO2 antes que as células aderentes fossem coletadas para isolamento de RNA.

Três experimentos separados foram realizados utilizando de dois a quatro camundongos tipo selvagem e knockout para Slc5a8 cada. Em um experimento piloto inicial, testamos 0,5 mM, 1 mM e 5 mM de PBA em culturas de córnea para identificar uma dose eficaz. Não foi observada diferença na capacidade dessas três concentrações em reduzir a resposta inflamatória. Com base nisso, optamos por usar a menor concentração (0,5 mM) nos experimentos in vitro subsequentes.
As células da medula óssea foram obtidas lavando as células dos fêmures de camundongos fêmeas C57BL/6 J ou camundongos knockout Slc5a8 com meio RPMI 1640 completo (Gibco BRL) contendo 10% de SBF, 50 μg/ml de gentamicina e 1,25 μg/ml de anfotericina B. As células foram filtradas através de um filtro celular Sysmex CellTrics (Sysmex, Lincolnshire, IL, EUA). As células da medula foram cultivadas por 6 dias a 107 células por poço em placas de 10 cm de diâmetro em meio RPMI 1640 completo suplementado com fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos de camundongo (GM-CSF; 20 ng/ml) e IL-4 (5 ng/ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA). No dia 3, um meio fresco contendo GM-CSF e IL-4 foi adicionado. No dia 6, as células foram coletadas das placas e semeadas em uma placa de 24 poços com 106 células/poço em 1 ml de RPMI completo contendo GM-CSF e IL-4. Neste momento, um subconjunto de poços recebeu 18 µl de PBA 5 mg/ml para uma concentração final de 0,5 mM. No dia 8, os poços apropriados foram tratados com 1 µg/ml de LPS por 4 h. As células foram colhidas, centrifugadas e ressuspendidas em tampão RLT da Qiagen (Qiagen, Germantown, MD, EUA) contendo tampão de beta-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) para isolamento de RNA. Dois poços foram combinados para cada amostra. Cada experimento utilizou dois a três camundongos do tipo selvagem e dois a três camundongos knockout Slc5a8. Três experimentos separados foram realizados.
Isolamento de RNA e PCR Quantitativo em Tempo Real
Células do epitélio da córnea cultivadas e BMDCs foram eluídas em tampão RLT da Qiagen contendo beta-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) usando 350 µl por poço, e o RNA foi extraído usando Qiagen RNeasy Plus (Qiagen, Germantown, MD, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração do RNA isolado foi medida usando um espectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Após o isolamento do RNA, o cDNA foi sintetizado usando beads Ready-To-Go You-Prime First-Strand (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, EUA).
O tecido conjuntival coletado de camundongos fêmeas C57BL/6 J foi colocado em tampão RLT da Qiagen com beta-mercaptoetanol e congelado instantaneamente em nitrogênio líquido. Para o isolamento do RNA, o tecido foi picado com tesouras cirúrgicas e depois sonicado, e o RNA foi extraído usando Qiagen RNeasy Plus.
A PCR em tempo real foi realizada usando ensaios TaqMan específicos (TNF-α: ABI assay ID Mm00443260_g1; HPRT: Assay ID Mm00446968_m1; Slc5a8: Mm07300153_m1) com TaqMan CR Universal PCR Master Mix com AmpErase UNG; (Applied Biosystems), em um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3 (ABI) de acordo com as recomendações do fabricante. Os resultados da PCR quantitativa foram analisados pelo método do ciclo limiar comparativo (CT) e normalizados pelo CT da HPRT. O nível relativo de mRNA no grupo tratado apenas com LPS foi usado como calibrador para cada experimento. Os dados englobam os resultados de três experimentos separados.
Estresse dessecante e tratamento com tributirina
Os camundongos foram expostos a condições de estresse dessecante (DS) em um ambiente com baixa umidade e corrente de ar (< 30% de umidade relativa) de acordo com os métodos padrão de estresse dessecante previamente descritos, que incluíam inibição farmacológica QID da secreção lacrimal por injeção subcutânea de bromidrato de escopolamina (0,5 mg/ 0,2 mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Os camundongos foram eutanasiados após 5 dias contínuos de DS.

Os camundongos receberam gavagem diária de 100 μl de 0,5 mM de tributerina (W222305, Sigma-Aldrich) ou de PBS (Corning, Manassas, VA, EUA) uma vez ao dia enquanto submetidos ao estresse dessecante. Essa dose foi escolhida após um estudo piloto que avaliou os efeitos na barreira corneana após gavagem oral de diferentes concentrações de tributerina (0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM e 5 mM em camundongos não estressados, 0,5 mM e 5 mM em camundongos DS). Em camundongos não estressados, todas as doses não foram significativamente diferentes dos controles não tratados, indicando que não houve toxicidade ou efeito deletério na superfície ocular. Em camundongos DS, como a dose mais baixa foi eficaz, realizamos experimentos subsequentes com tributerina 0,5 mM (dados não mostrados).

Medição da função de barreira corneana
A função de barreira corneana foi avaliada quantificando a permeabilidade do epitélio corneano à Oregon Green Dextran-488 de 70 kDa (OGD; Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com nosso protocolo previamente publicado. Cada imagem foi quantificada por dois observadores mascarados. A intensidade média dos olhos direito e esquerdo foi calculada como média. Experimentos iniciais com camundongos selvagens utilizaram nove a quinze (18–30 olhos) camundongos por grupo experimental. Experimentos subsequentes com camundongos selvagens e camundongos knockout para Slc5a8 usaram oito a dez camundongos (16–20 olhos) por grupo experimental. 

Medição da densidade de células caliciformes
Os olhos e os anexos oculares foram excisados, fixados em formalina a 10%, embebidos em parafina e cortados em seções de 5 μm usando um micrótomo (Microm HM 340E, Thermo Fisher Scientific). As seções foram coradas com reagente de ácido periódico de Schiff (PAS) para visualizar as células caliciformes contendo mucina. A densidade de células caliciformes foi medida nas conjuntivas superior e inferior usando o software NIS-Elements e expressa como o número de células positivas por milímetro. Cinco a nove olhos de cada grupo foram examinados. Cada imagem foi quantificada por dois observadores mascarados.

Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Comparações pareadas foram feitas com testes U de Mann-Whitney não paramétricos, com p-valor ≤ 0,05 considerado significativo. Em experimentos com mais de uma variável experimental, as comparações estatísticas foram feitas com ANOVA de duas vias usando o teste de comparações múltiplas de Tukey. O valor de P maior que 0,05 foi considerado não significativo.

Análise NanoString
A análise NanoString foi realizada utilizando RNA conjuntival de camundongos fêmeas C57BL/6 J submetidos a 5 dias em uma de três condições experimentais: sem estresse com gavagem diária de PBS, DS com gavagem diária de PBS, ou DS com gavagem diária de tributirina (n = 4 camundongos por grupo). Duzentos e cinquenta e quatro transcritos alvo foram quantificados com a plataforma multiplexada NanoString nCounter usando o painel Mouse Inflammation V2 (www.nanostring.com). Os nCounts dos transcritos de mRNA foram normalizados usando as médias geométricas de 6 genes de referência (Cltc, Gapdh, Gusb, Hprt, Pgk1, Tubb5). Os dados foram analisados pelo ROSALIND® (https://rosalind.onramp.bio/), com uma arquitetura HyperScale desenvolvida pela ROSALIND, Inc. (San Diego, CA) conforme descrito anteriormente. Heatmaps foram construídos usando o software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).
Resultados
Camundongos C57BL/6 J expressam o transportador de SCFA SLC5A8 na superfície ocular
Camundongos C57BL/6 J expressam mRNA e proteína para o transportador de SCFA SLC5A8 na superfície ocular. (A) A PCR digital quantitativa foi utilizada para amplificação de cDNA preparado a partir do epitélio corneano e tecido conjuntival de camundongos C57BL/6 selvagens. Cada ponto de dados representa tecido de um animal. O número de transcritos detectados foi normalizado pela concentração de DNA. (B) Secções de córnea e conjuntiva (Conj) de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e knockout para Slc5a8 (KO) foram coradas com H&E para avaliar a morfologia. Imagens representativas são mostradas. (C) Secções de córnea e conjuntiva (Conj) de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e knockout para Slc5a8 foram imuno-coradas com anticorpo anti-SLC5A8 de camundongo usando detecção cromogênica (marrom-avermelhado). Os núcleos foram corados com hematoxilina (roxo). Lâminas coradas com IgG anti-coelho são mostradas como controle negativo. Imagens representativas são mostradas. CO = córnea; CJ = conjuntiva.
Originalmente identificado no tecido renal, o transportador de monocarboxilato SLC5A8 é amplamente expresso em muitos tecidos e tem sido extensivamente estudado no intestino, onde sua proteína está localizada na membrana apical voltada para o lúmen, em contato direto com os AGCCs produzidos pela microbiota intestinal. Examinamos se os AGCCs poderiam agir diretamente no tecido da superfície ocular testando a expressão do mRNA do transportador no epitélio da córnea e no tecido conjuntival em camundongos usando PCR digital quantitativa. Transcritos de Slc5a8 foram detectados tanto no epitélio da córnea quanto na conjuntiva (Fig. 1A). Em seguida, buscamos a expressão da proteína transportadora no epitélio da córnea e da conjuntiva. Secções de tecido envolvendo o olho e os anexos oculares, incluindo tecido conjuntival, foram coradas com H&E para avaliar a morfologia geral da córnea e da conjuntiva em camundongos KO para Slc5a8 em comparação com os selvagens (Fig. 1B). A estrutura e integridade do epitélio da córnea em camundongos KO para Slc5a8 corresponderam às dos camundongos selvagens. Para examinar a expressão proteica de Slc5a8, secções de tecido separadas foram imunocoradas e realizada detecção cromogênica para SLC5A8 (Fig. 1C). A expressão proteica robusta foi detectada para o transportador SLC5A8 em toda a superfície epitelial da córnea e epitélio conjuntival ao redor das células caliciformes, com maior expressão no epitélio da córnea. Como esperado, nenhuma imunorreatividade para SLC5A8 foi observada no mesmo tecido de camundongos knockout sem a proteína SLC5A8. A presença de SLC5A8 sugere que os AGCCs, em particular o butirato, podem interagir diretamente com os tecidos de barreira ocular.
O butirato suprime a inflamação induzida por LPS in vitro no epitélio da córnea e em células dendríticas
O tratamento com fenilbutirato (PBA) de células do epitélio da córnea e células dendríticas derivadas da medula óssea inibe a inflamação induzida por LPS in vitro, e o transportador de butirato SLC5A8 é necessário para esse efeito. (A) Células do epitélio da córnea e (B) células dendríticas da medula óssea (BMDC) foram cultivadas a partir de camundongos selvagens (WT) e knockout para Slc5a8 (KO), pré-tratadas com fenilbutirato (PBA) ou controle de meio por 1 h, depois deixadas sem tratamento (Untrt) ou desafiadas com LPS. Cada ponto de dados é um poço com 1 explante de tecido, e cada condição foi em poços duplicados ou triplicados dentro de cada experimento. Mostrados estão os dados combinados de qPCR dos experimentos após cada conjunto de dados ser normalizado para a condição tratada apenas com LPS. Média ± desvio padrão de três experimentos independentes; cada experimento usou 2–3 poços por condição. Comparações estatísticas foram feitas com ANOVA de duas vias usando o teste de comparações múltiplas de Tukey. O valor de P maior que 0,05 foi considerado não significativo (ns). *P ≤ 0,5, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.
O butirato demonstrou neutralizar estímulos inflamatórios em células epiteliais do cólon. Investigamos o potencial do butirato para atenuar de forma semelhante a inflamação na superfície ocular em epitélio corneano. O lipopolissacarídeo (LPS) já foi demonstrado anteriormente como indutor da expressão de citocinas pró-inflamatórias na superfície ocular in vivo, quando aplicado topicamente em córneas de camundongos, e in vitro, quando adicionado a culturas de epitélio corneano e conjuntival. Cultivamos explantes de córnea de camundongos in vitro e os pré-incubamos com ácido fenilbutírico (PBA) antes da exposição ao LPS. O PBA é um ácido graxo de cadeia curta aromático, um derivado químico do ácido butírico, e, assim como o butirato, também possui atividade de HDAC. O PBA é aprovado pela FDA para uso em humanos e, portanto, é um candidato atraente para possível tratamento da inflamação da superfície ocular. Como esperado, a indução da citocina inflamatória Tnf foi observada nas culturas de epitélio corneano após exposição ao LPS. O pré-tratamento das culturas com PBA reduziu significativamente a indução da expressão do mRNA de Tnf (Fig. 2A). Não foi observada diferença estatística na redução da resposta inflamatória entre células corneanas pré-tratadas com 0,5 mM, 1 mM ou 5 mM de PBA (dados não mostrados). O tratamento das culturas com PBA sem estimulação com LPS não alterou a expressão de Tnf em relação às culturas controle não tratadas.

Células dendríticas ativadas também desempenham um papel importante na resposta inflamatória na superfície ocular. Examinamos os efeitos do tratamento com butirato na resposta inflamatória de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) que foram expostas ao LPS. Semelhante às células epiteliais da córnea, as BMDCs responderam ao pré-tratamento com 0,5 mM de PBA com uma redução de duas vezes na expressão de Tnf após exposição ao LPS (Fig. 2B).

Slc5a8 é necessário para o efeito protetor do butirato na córnea e em células dendríticas in vitro

O transportador de SCFA Slc5a8 é crítico para os efeitos anti-inflamatórios do butirato no cólon e para a tolerância imune da mucosa intestinal mediada por células dendríticas expostas ao butirato. Investigamos se Slc5a8 era necessário para o efeito protetor do PBA no epitélio corneano e em BMDCs. Explantes de córnea e BMDCs de camundongos knockout para Slc5a8 foram cultivados e expostos ao LPS na presença ou ausência de PBA. Em ambos os tipos celulares, o pré-tratamento com PBA não foi capaz de reduzir a expressão do mRNA de Tnf na ausência de Slc5a8 (Fig. 2A e B). Isso sugere que o transportador é necessário para que o butirato exerça seus efeitos protetores contra estímulos inflamatórios.

A administração de tributirina (TB) a camundongos submetidos a estresse de dessecação protege contra a ruptura da barreira corneana e a perda de células caliciformes conjuntivais.
Administração de tributirina (TB) a camundongos submetidos a estresse desidratante protege contra a ruptura da barreira corneana e perda de células caliciformes conjuntivais. (A) Imagens representativas da permeabilidade corneana ao Oregon-green-dextran (OGD) de quatro animais diferentes de cada grupo de tratamento. (B) A permeabilidade do epitélio corneano ao OGD foi quantificada medindo a intensidade média de fluorescência. Cada ponto de dados representa o valor médio de ambos os olhos de um animal, n = 8–15 animais. (C) Imagens representativas de criosseções conjuntivais com células caliciformes coradas com PAS (roxo-magenta) de camundongos tratados com TB e controle veículo (PBS). A área demarcada pelo quadrado é a ampliação da área abaixo. (D) Dados acumulativos para o número de células caliciformes conjuntivais por mm, n = 8–9. (E) Imagens representativas da permeabilidade corneana ao Oregon-green-dextran (OGD) de animais de cada grupo de tratamento. (F) Permeabilidade do epitélio corneano ao OGD para camundongos selvagens (WT) e nocautes para Slc5a8 (KO) tratados por gavagem com veículo controle ou tributirina. As comparações estatísticas foram feitas usando ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Tukey. O valor de P maior que 0,05 foi considerado não significativo (ns).
Investigamos se o butirato poderia exercer efeitos anti-inflamatórios na superfície ocular in vivo através da administração pelo intestino usando tributirina. A tributirina é uma pró-droga estável e rapidamente absorvida do ácido butírico encontrada naturalmente na manteiga; após ingestão oral, a tributirina é hidrolisada por lipases pancreáticas e gástricas em glicerol e três moléculas de butirato. A tributirina possui classificação “geralmente reconhecida como segura” (GRAS) pela Food and Drug Administration (FDA: 21CFR184.1903) e é usada como aditivo alimentar por muitas indústrias; como tal, é um candidato potencial para o tratamento da inflamação da superfície ocular. No modelo de estresse desidratante (DS) para olho seco, camundongos são submetidos a um ambiente de baixa umidade e bloqueio colinérgico, o que resulta em comprometimento da função de barreira corneana, redução do número de células caliciformes na conjuntiva e regulação positiva das vias inflamatórias inatas. Como o olho seco é mais frequente em mulheres, e os camundongos machos são resistentes à ruptura da barreira corneana (uma característica do olho seco), apenas fêmeas foram utilizadas. Camundongos fêmeas C57BL/6 J foram submetidos a estresse desidratante por cinco dias com gavagem diária concomitante de tributirina ou veículo. Após cinco dias de DS, os camundongos foram sacrificados e avaliados quanto à ruptura da barreira corneana e perda de células caliciformes. A permeabilidade corneana foi examinada usando corante Oregon-Green-Dextran (OGD) aplicado na superfície corneana. Córneas de camundongos tratados por gavagem com 0,5 mM de tributirina durante o estresse desidratante exibiram significativamente menos permeabilidade ao OGD em comparação com córneas de camundongos tratados com veículo controle. Isso foi quantificado medindo a intensidade média de fluorescência dentro de um círculo de 2 mm colocado em uma imagem digital da córnea (Fig. 3A e B).
Outra consequência do DS no olho murino é a perda de células caliciformes no epitélio conjuntival, que normalmente secretam mucinas que formam a camada interna do filme lacrimal. Após estresse dessecante por 5 dias, camundongos tratados por via oral com tributerina mantiveram maiores densidades de células caliciformes na conjuntiva em comparação com camundongos tratados com veículo, e o tamanho das células caliciformes pareceu maior e mais regular (Fig. 3C e D). Isso sugere que o butirato metabolizado no intestino pode exercer efeitos protetores na superfície ocular in vivo.

Em seguida, investigamos se o transportador SLC5A8 é necessário para o efeito protetor do butirato in vivo, administrando tributerina a camundongos knockout para Slc5a8 simultaneamente com camundongos selvagens no ambiente de estresse dessecante. Diferentemente da coorte selvagem, os camundongos knockout para Slc5a8 que receberam tributerina não apresentaram melhora estatisticamente significativa na integridade da barreira corneana em comparação com camundongos que receberam veículo controle (Fig. 3E e F), corroborando os resultados in vitro. No entanto, embora não estatisticamente significativa, a intensidade média de OGD para camundongos knockout tratados com tributerina foi menor do que para camundongos tratados com veículo, indicando que o butirato in vivo pode exercer seus efeitos protetores apenas parcialmente através do transportador SLC5A8.

Em células epiteliais intestinais, foi demonstrado que a expressão do gene Slc5a8 é regulada positivamente pelo probiótico Lactobacillus plantarum e regulada negativamente durante inflamação e câncer de cólon. Camundongos livres de germes têm níveis significativamente mais baixos de expressão de Slc5a8 no intestino, que são restaurados pela recolonização com bactérias, sugerindo que as bactérias comensais estimulam a expressão. Para determinar se a expressão de Slc5a8 muda no epitélio corneano durante o DS ou após o tratamento com tributerina, realizamos qPCR no epitélio corneano isolado de camundongos. Nenhuma diferença significativa foi observada em resposta ao DS ou em resposta ao tratamento com tributerina em condições de DS (dados não mostrados).

Tributerina oral reduz genes da via de sinalização do interferon tipo I na conjuntiva

Mapas de calor mostrando que o tratamento oral com tributerina (Tb) reduz a expressão de genes de sinalização do interferon tipo I (IFN) na conjuntiva. A análise de expressão utilizando o painel NanoString Mouse Inflammation v2 foi realizada em tecido conjuntival de camundongos submetidos a DS com veículo (Veh) ou com tratamento com tributerina. Para todos os genes identificados como significativamente alterados, log2 > 1,2 e p ajustado < 0,05.
Para obter informações sobre o mecanismo dos efeitos protetores do butirato na superfície ocular, realizamos uma análise de expressão gênica usando NanoString em tecido conjuntival isolado de camundongos submetidos a SO com ou sem tratamento com tributerina (n = 4 camundongos por grupo). O painel Inflamatório da NanoString permite a investigação de 248 genes envolvidos na resposta inflamatória e vias relacionadas (www.nanostring.com). Oito genes foram significativamente alterados, todos regulados negativamente pelo tratamento com tributerina (Ifi44, Ifit1, Ifit3, Stat2, Oas2, Oas1a, Stat1, Stat2; log2 da mudança de expressão > 1,2, p-adj < 0,05, Fig. 4). Todos esses genes estão envolvidos na sinalização de interferon (IFN) tipo I. Os IFNs tipo I têm várias funções, incluindo a ativação de respostas antimicrobianas intracelulares e a modulação das respostas imunes inata e adaptativa. O butirato demonstrou em outros estudos modular genes envolvidos na sinalização de IFN tipo I.

Discussão
A microbiota intestinal desempenha muitos papéis importantes na saúde do hospedeiro, incluindo na nutrição, fisiologia, metabolismo e resistência a patógenos. Uma função importante das bactérias comensais intestinais é sua capacidade de modular respostas inflamatórias. Vários estudos mostraram que uma microbiota intestinal saudável promove a homeostase ocular e a resistência a doenças. Camundongos livres de germes são mais suscetíveis à infecção ocular por Pseudomonas aeruginosa devido à deficiência de uma resposta imune normal da superfície ocular, que pode ser revertida pela recolonização do intestino com bactérias. Nosso grupo mostrou que a presença de uma microbiota intacta e saudável protege contra a ceratoconjuntivite seca em vários modelos diferentes de doença do olho seco. Por outro lado, foi demonstrado que um antígeno de reação cruzada de um comensal intestinal sensibiliza células T autorreativas específicas da retina e desencadeia a doença em um modelo murino de uveíte autoimune. Nosso estudo contribui para um crescente corpo de conhecimento sobre inflamação ocular e a relação entre o olho e a microbiota intestinal.
Neste estudo, mostramos que o transportador de SCFA Slc5a8 é expresso na superfície ocular no epitélio conjuntival e corneal tanto em nível de mRNA quanto de proteína. Isso sugere que o butirato circulante pode interagir diretamente com a superfície ocular. Os mecanismos precisos por trás da interação entre o intestino e a superfície ocular ainda não estão claros; o butirato, um pequeno metabólito produzido por bactérias, é um potencial mediador, pois demonstrou modular respostas inflamatórias tanto no intestino quanto em outras partes do corpo. Os SCFAs acetato, propionato e butirato são produzidos por bactérias por meio da fermentação de fibras alimentares não digeríveis no intestino grosso, e o epitélio colônico expressa várias proteínas que se ligam a essas moléculas como parte de cascatas de sinalização ou as transportam através da membrana celular. O butirato no intestino demonstrou entrar na corrente sanguínea; níveis elevados de butirato no soro podem ser medidos após administração oral de butirato e tributirina. Nossa hipótese é que o butirato originado no intestino poderia ser transportado para a superfície ocular através do sistema vascular e interagir diretamente com as células na superfície ocular.

Mostramos que o tratamento com tributirina ajuda a restaurar a integridade da barreira corneana e a perda de células caliciformes que ocorre em condições de DS. Observou-se anteriormente que camundongos livres de germes, que são desprovidos de micróbios, incluindo comensais que produzem SCFAs no intestino, apresentam menor densidade de células caliciformes não apenas no intestino, mas também no olho. Sabe-se que no epitélio intestinal o butirato ajuda a manter a barreira intestinal modulando a expressão de mucinas pelas células caliciformes e a diferenciação das células caliciformes. É possível que o butirato produzido no intestino também tenha um efeito direto na diferenciação ou manutenção das células caliciformes conjuntivais.

O butirato também funciona como um ligante para um subconjunto de receptores acoplados à proteína G que se ligam aos SCFAs, incluindo FFAR2 e HCAR2, que são expressos em superfícies de barreira epiteliais, incluindo o intestino. Há uma vasta literatura sobre a função desses receptores no epitélio colônico e nas células imunológicas. No olho, a sinalização do HCAR2 é essencial para a capacidade do ácido hidroxibutírico de inibir a expressão de marcadores pró-inflamatórios no epitélio retiniano. Nossos resultados in vivo com camundongos knockout para Slc5a8 alimentados com tributirina indicam que o SLC5A8 pode ser apenas parcialmente necessário para o efeito protetor da tributirina na função de barreira corneana. Será importante abordar o papel potencial da sinalização do butirato via HCAR2 e FFAR2 em estudos futuros.
Também mostramos que a aplicação direta de ácido fenilbutírico (PBA) pode reduzir a resposta inflamatória em células epiteliais da córnea. Culturas de córnea pré-tratadas com PBA expressaram níveis mais baixos de citocinas inflamatórias quando expostas a LPS, apoiando a hipótese de que o butirato pode reduzir diretamente a inflamação na superfície ocular. Curiosamente, o efeito do PBA é perdido na ausência do transportador de SCFA SLC5A8, sugerindo que o butirato é transportado para o interior da célula. O butirato pode modular diretamente a expressão gênica na célula ao inibir histonas desacetilases (HDACs). É possível que o butirato module a expressão de marcadores inflamatórios em células epiteliais da córnea por meio da inibição de HDAC. Em apoio a isso, estudos in vitro com uma linhagem celular epitelial da córnea mostraram que a ativação do receptor toll-like 3 causa ruptura da barreira ao aumentar a HDAC1, que por sua vez reprime a transcrição de E-caderina; essa ruptura da barreira pode ser bloqueada com butirato. Seria muito interessante testar os SCFAs propionato e acetato em estudos futuros com nosso modelo, particularmente porque o propionato, mas não o acetato, também possui propriedades inibidoras de HDAC e pode ser transportado para o interior da célula pelo SLC5A8. Investigaremos o papel potencial da atividade inibidora de HDAC do butirato na supressão da resposta inflamatória no epitélio corneano em estudos futuros.
Nossos resultados indicam que tanto as células epiteliais quanto as células apresentadoras de antígenos responderam ao butirato diminuindo o mRNA inflamatório de Tnf. Já mostramos anteriormente que tanto o epitélio corneano quanto as BMDCs respondem ao LPS secretando citocinas inflamatórias. Nosso estudo adiciona à literatura mostrando que outro subproduto bacteriano tem um efeito anti-inflamatório na superfície ocular e nas células apresentadoras de antígenos (APCs). No momento, não se sabe se esse efeito ocorre simultaneamente ou se o efeito nas células epiteliais segue o efeito nas APCs. Serão necessários mais testes para dissecar essa questão.
Nós e outros já mostramos anteriormente que as células Treg são protetoras na superfície ocular e que o estresse de ressecamento e a doença da superfície ocular relacionada à idade induzem células T reguladoras disfuncionais. O butirato produzido no intestino também demonstrou impactar a inflamação indiretamente em locais distais, aumentando os níveis de Tregs anti-inflamatórias periféricas. A adição de butirato a células T CD4+ naive cultivadas em condições polarizadoras de células Treg resulta no aumento da acetilação de histonas no promotor Foxp3, implicando a atividade inibidora de HDAC do butirato como um mecanismo para o aumento da expressão de Foxp3 e, assim, da diferenciação de Treg. De fato, foi demonstrado que células dendríticas derivadas do baço tratadas com butirato induzem a diferenciação de células T naive em células Treg FoxP3+ e suprimem a diferenciação em células T pró-inflamatórias interferon-γ + T, sendo necessário o transportador SLC5A8. A administração oral de butirato de sódio (NaB) no modelo de uveíte autoimune experimental (EAU) em camundongos aumentou a proporção de células Treg anti-inflamatórias para células Th17, resultando em menos doença. Curiosamente, outro estudo usando o modelo EAU mostrou que o propionato, outro SCFA com atividade inibidora de HDAC, também pode induzir Tregs e suprimir a indução de células T efetoras, resultando em menos doença. É possível que a facilitação da diferenciação de Treg em relação às células T pró-inflamatórias pelo butirato também possa desempenhar um papel no efeito protetor do butirato na superfície ocular. Com base em todas essas descobertas anteriores, prevemos que camundongos tratados com tributirina tenham números aumentados de Tregs FoxP3+ na superfície ocular e investigaremos isso mais a fundo em estudos de acompanhamento.

Finalmente, mostramos que na conjuntiva de camundongos submetidos ao estresse de ressecamento, há regulação positiva de genes envolvidos na sinalização de IFN tipo I, e o tratamento com tributirina reduz a expressão desses genes. Esse resultado está de acordo com nossos resultados de NanoString publicados anteriormente, comparando a expressão gênica em células conjuntivais humanas de pacientes com Síndrome de Sjögren (SS) com olho seco e indivíduos controle saudáveis, onde observamos regulação positiva da sinalização de IFN tipo 1 na SS. A SS é um distúrbio inflamatório autoimune caracterizado por disfunção secretora nos olhos e na boca; nos olhos, isso resulta em instabilidade do filme lacrimal, redução da produção de lágrimas e ruptura da barreira corneana. O aumento da expressão de genes de IFNs tipo I foi demonstrado em distúrbios autoimunes, incluindo SS, e os IFNs tipo I foram implicados na patologia da glândula lacrimal e da glândula salivar em SS humana e em modelos murinos de SS. Além disso, as lágrimas isoladas de camundongos submetidos a DS apresentam IFN-α elevado. Há evidências na literatura de que produtos microbianos, incluindo butirato, podem modular a sinalização de IFN tipo I. O butirato pode estar agindo diretamente na superfície ocular para reduzir a sinalização inflamatória de IFN tipo I, possivelmente por meio de sua atividade inibidora de HDAC para modular a expressão gênica de IFN tipo I.
Mecanismos propostos para o efeito protetor do butirato na superfície ocular. O butirato pode impactar a superfície ocular de duas maneiras diferentes, indiretamente por meio da modulação de células imunes e diretamente através da interação com o epitélio da superfície ocular que expressa SLC5A8 ou outros receptores de SCFA e modulando a expressão gênica por meio de sua atividade inibidora de HDAC. APC, Célula apresentadora de antígeno; HDAC, histona desacetilase; IFN, interferon; Treg, célula T reguladora. Desenho da figura criado com BioRender.com.

Nossos dados mostram que o butirato originário do intestino pode modular respostas inflamatórias na superfície ocular. Propomos dois mecanismos possíveis para a ação do butirato na superfície ocular, um mecanismo indireto via modulação de células imunes e um mecanismo direto no qual o butirato interage diretamente com a superfície ocular, baseados em nossos achados e em outros dados da literatura (Fig. 5). Conforme discutido, há suporte considerável na literatura para ambos os cenários. Neste estudo, a expressão de receptores de SCFA e do transportador de SCFA SLC5A8 na superfície ocular sugere que o butirato circulante pode interagir diretamente com o epitélio da superfície ocular. Em apoio a isso, o butirato suprimiu a expressão de genes pró-inflamatórios em explantes corneanos in vitro e necessitou do transportador SLC5A8 para esse efeito. Finalmente, o butirato administrado por via intragástrica melhora a doença da superfície ocular em um modelo de olho seco em camundongos. Juntos, esses achados contribuem para um crescente corpo de conhecimento sobre as ligações entre a microbiota intestinal e a saúde do olho.

Abreviaturas
APC
Célula apresentadora de antígeno
BMDC
Células dendríticas derivadas de medula óssea
DS
Estresse de dessecação
HDAC
Histona desacetilase
KO
Knock-out
LPS
Lipopolissacarídeo
OGD
Oregon green dextran
MFI
Intensidade média de fluorescência
NaB
Butirato de sódio
PBA
Fenilbutirato
SCFA
Ácido graxo de cadeia curta
SS
Síndrome de Sjögren
TB
Tributirina
Treg
Célula T reguladora
WT
Tipo selvagem

A versão online original deste Artigo foi revisada: A versão original deste Artigo continha um erro na grafia do nome do autor Cintia S. de Paiva, que foi incorretamente escrito como Cintia de Paiva. Além disso, a seção de Contribuições dos Autores agora diz: Conceitualização, L.S., H.H. e C.S.D.P.; Análise formal, L.S., H.H., R.A.C. e Z.Y.; Aquisição de financiamento, C.S.D.P.; Metodologia, L.S., H.H., Z.Y. e C.S.D.P.; Administração do projeto, C.S.D.P.; Supervisão, C.S.D.P.; Redação—rascunho original, L.S.; Redação—revisão e edição, L.S., H.H., R.A.C., Z.Y., S.C.P., R.A.B. e C.S.D.P.

Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Histórico de alterações
4/21/2022
Uma Correção a este artigo foi publicada: 10.1038/s41598-022-10856-y
Conceituação, L.S., H.H. e C.S.D.P.; Análise formal, L.S., H.H., R.A.C. e Z.Y.; Aquisição de financiamento, C.S.D.P.; Metodologia, L.S., H.H., Z.Y. e C.S.D.P.; Administração do projeto, C.S.D.P.; Supervisão, C.S.D.P.; Redação— rascunho original, L.S.; Redação— revisão e edição, L.S., H.H., R.A.C., Z.Y., S.C.P., R.A.B. e C.S.D.P.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pelo NIH EY026893 (CSDP), NEI Training Grant em Ciências da Visão T32 EY007001 (HH), NIH EY002520 (Core Grant para o Departamento de Oftalmologia de Pesquisa em Visão), Baylor Pathology & Histology Core (NIH P30 CA125123), Research to Prevent Blindness (bolsa irrestrita ao Departamento de Oftalmologia), Research to Prevent Blindness Stein Innovation Award (RAB), The Hamill Foundation (SCP), The Sid Richardson Foundation (SCP), The Baylor College of Medicine Genetically Engineered Rodent Models Core (NIH P30 CA125123). Os financiadores não tiveram nenhum papel no delineamento do estudo, na coleta, análises ou interpretação dos dados, na redação do manuscrito ou na decisão de publicar os resultados.
Disponibilidade de dados
Os dados de NanoString deste estudo podem ser encontrados no repositório GEO (Submission ID GSE195578, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
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A fisiopatologia da doença do olho seco: o que sabemos e direções futuras para pesquisa
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Microbiota intestinal como fonte de um antígeno substituto que desencadeia autoimunidade em um local imunologicamente privilegiado
A microbiota intestinal influencia a permeabilidade da barreira hematoencefálica em camundongos
A microbiota intestinal regula a massa óssea em camundongos
Lobel, L., Cao, Y. G., Fenn, K., Glickman, J. N. & Garrett, W. S. A dieta modifica pós-traducionalmente o proteoma microbiano intestinal de camundongos para modular a função renal. Science (80-. ).369, 1518–1524 (2020).
O butirato melhora a inflamação alérgica das vias aéreas ao limitar o tráfego e a sobrevivência dos eosinófilos
A isquemia-reperfusão pulmonar é um processo inflamatório estéril influenciado pela microbiota comensal em camundongos
O butirato derivado de micróbios comensais induz a diferenciação de células T reguladoras do cólon
Metabólitos produzidos por bactérias comensais promovem a geração de células T reguladoras periféricas
Um fator simbiótico comensal derivado de Bacteroides fragilis promove células T humanas CD39+Foxp3+ e função Treg
O microbioma intestinal molda as respostas imunes intestinais durante a saúde e a doença
Interações entre bactérias intestinais comensais e o sistema imunológico
A gênese do tecido linfoide induzida por comensais através de NOD1 regula
Cash, H. L., Whitham, C. V., Behrendt, C. L. & Hooper, L. V. Bactérias simbióticas direcionam a expressão de uma lectina bactericida intestinal. Science (80-. ).313, 1126–1130 (2006).
Papel da microbiota no fortalecimento da função da barreira mucosa ocular através da IgA secretora
Impacto da microbiota na resistência à ceratite ocular induzida por Pseudomonas aeruginosa
Diversidade alterada do microbioma mucosal e gravidade da doença na síndrome de Sjögren
Cerateconjuntivite lacrimal semelhante à Sjögren em camundongos livres de germes
Papel protetor das bactérias comensais na síndrome de Sjögren
O metabólito microbiano butirato estimula a formação óssea através da regulação mediada por células T reguladoras da expressão de WNT10B
O butirato derivado da microbiota limita a resposta autoimune ao promover a diferenciação de células T reguladoras foliculares
Matt, S. M. et al. Butirato e fibra solúvel dietética melhoram a neuroinflamação associada ao envelhecimento em camundongos. Front. Immunol.9, (2018).
Ácidos graxos de cadeia curta melhoram a uveíte imunomediada parcialmente alterando a migração de linfócitos do intestino
O butirato de sódio regula o equilíbrio de células Th17/Treg para melhorar a uveíte através da via Nrf2/HO-1
Venegas, D. P. et al. Ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) medeiam a regulação epitelial e imune intestinal e sua relevância para doenças inflamatórias intestinais. Front. Immunol.10, (2019).
O ácido graxo de cadeia curta butirato imprime um programa antimicrobiano em macrófagos
A inibição da via do inflamassoma NLRP3 pelo butirato melhora a cicatrização de feridas corneanas em queimadura alcalina da córnea
Lactatúria e perda da captação de lactato dependente de sódio no cólon de camundongos deficientes em SLC5A8
Percie du Sert, N. et al. Relato de pesquisa animal: Explicação e elaboração das diretrizes ARRIVE 2.0. PLOS Biol.18, e3000411 (2020).
Efeitos das terapias para olho seco na doença da superfície ocular induzida ambientalmente
Resposta inflamatória ao lipopolissacarídeo na superfície ocular em um modelo murino de olho seco
Vias gênicas diferencialmente expressas na conjuntiva da ceratoconjuntivite seca da síndrome de Sjögren
Transportadores de ácidos graxos de cadeia curta: papel na homeostase colônica
O butirato suprime a inflamação colônica através da regulação positiva de fas dependente de HDAC1 e apoptose mediada por fas de células T
A ativação de Gpr109a, receptor de niacina e do metabólito comensal butirato, suprime a inflamação e carcinogênese colônicas
O butirato derivado da microbiota regula dinamicamente a homeostase intestinal através da regulação da proteína associada à actina sinaptopodina
Sivaprakasam, S. et al. A deficiência de fibra dietética em camundongos nulos para Slc5a8 promove disbiose bacteriana e altera o transcriptoma epitelial colônico em direção a um ambiente pró-inflamatório. Can. J. Gastroenterol. Hepatol.2019, (2019).
A microbiota comensal induz a estrutura e funções da barreira colônica que contribuem para a homeostase
Slc5a8, um transportador de alta afinidade acoplado a Na+ para ácidos graxos de cadeia curta, é um supressor tumoral condicional no cólon que protege contra colite e câncer de cólon em condições de dieta pobre em fibras
Efeitos dos Triglicerídeos da Dieta nos Lipídios Séricos e Hepáticos e na Excreção de Esteróis de Ratos
Farmacocinética plasmática do butirato após administração intravenosa de butirato de sódio ou administração oral de tributirina ou butirato de sódio em camundongos e ratos
O estresse dessecante induz apoptose do epitélio corneal semelhante à síndrome de Sjögren mediada por linfócitos T CD4+ via ativação da via apoptótica extrínseca pelo interferon-γ
O estresse dessecante induz ceratoconjuntivite lacrimal semelhante à síndrome de Sjögren mediada por linfócitos T
A metaplasia escamosa do epitélio conjuntival induzida por olho seco é modulada pelo interferon-γ
Prevalência e fatores de risco para síndrome do olho seco
Schaumberg, D. A. et al. Diferenças Relatadas por Pacientes na Doença do Olho Seco entre Homens e Mulheres: Impacto, Manejo e Satisfação do Paciente. PLoS One8, (2013).
O DHA da dieta amplifica os circuitos de LXA4 nos tecidos e no PMN dos linfonodos e é protetor na doença do olho seco imunomediada
O probiótico Lactobacillus plantarum combate a regulação negativa induzida por TNF-α da expressão e função do SMCT1
Expressão gênica colônica em camundongos convencionais e isentos de germes com foco no receptor de butirato GPR109A e no transportador de butirato SLC5A8
Regulação das respostas do interferon tipo I
Indução do gene humano para p44, uma proteína de agregado microtubular associada à hepatite C, pelo interferon-alfa/beta
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O butirato reprograma a expressão de genes específicos estimulados por interferon
Disponibilidade sistêmica e metabolismo de ácidos graxos de cadeia curta derivados do cólon em indivíduos saudáveis: um estudo de isótopos estáveis
Efeitos da suplementação oral de butirato no potencial inflamatório de células mononucleares do sangue periférico circulante em homens saudáveis e obesos
Determinação de tributirina e seu metabólito butirato em amostras de plasma de ratos Wistar por cromatografia gasosa/espectrometria de massas
Ceratoconjuntivite lacrimal semelhante a Sjögren em camundongos isentos de germes
Características histoquímicas, lectina-histoquímicas e morfométricas das células caliciformes intestinais de camundongos isentos de germes e convencionais
O butirato modula especificamente a expressão do gene MUC em células caliciformes epiteliais intestinais privadas de glicose
A perda de p32/gC1qR/HABP1 da mucosa desencadeia deficiência energética e prejudica a diferenciação de células caliciformes na colite ulcerativa
Ácidos graxos de cadeia curta metabólitos da microbiota, GPCR e doenças inflamatórias intestinais
Macia, L. et al. Os receptores sensores de metabólitos GPR43 e GPR109A facilitam a homeostase intestinal induzida por fibra alimentar através da regulação do inflamassoma. Nat. Commun.6, (2015).
GPR109A como um receptor anti-inflamatório em células epiteliais do pigmento da retina e sua relevância para a retinopatia diabética
Efeito supressor de ácidos graxos de cadeia curta na produção de mediadores pró-inflamatórios por neutrófilos
O metabólito microbiano butirato regula a função de macrófagos intestinais via inibição da histona desacetilase
Inibição da atividade da histona desacetilase por ácidos graxos de cadeia curta e alguns metabólitos de polifenóis formados no cólon
Ativação do receptor toll-like 3 induz disfunção da barreira epitelial da córnea
Bloqueio do desenvolvimento de células dendríticas pelos produtos de fermentação bacteriana butirato e propionato através de inibição dependente do transportador (Slc5a8) de histonas desacetilases
A ceratoconjuntivite lacrimal espontânea relacionada à idade é acompanhada por células T reguladoras disfuncionais
A autoimunidade no Olho Seco se deve à resistência das Th17 à supressão por Treg
Del Papa, N. et al. O papel dos interferons na patogênese da síndrome de Sjögren e perspectivas terapêuticas futuras. Biomolecules11, (2021).
A deficiência do receptor de interferon tipo I previne a síndrome de Sjögren murina
Chaly, Y. et al. A sinalização do interferon tipo I é necessária para dacrioadenite no modelo de camundongo diabético não obeso da síndrome de Sjögren. Int. J. Mol. Sci.19, (2018).
Células dendríticas plasmacitoides são a principal fonte de IFN-α durante a imunopatogênese da disfunção da glândula lacrimal induzida por estresse de dessecação