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pmid: "39182227"
title: "O declínio temporal associado à idade nas bactérias produtoras de butirato desempenha um papel patogênico chave no início e progressão da neuropatologia e déficits de memória em camundongos 3×Tg-AD."
authors: "Chilton PM, Ghare SS, Charpentier BT, Myers SA, Rao AV, Petrosino JF, Hoffman KL, Greenwell JC, Tyagi N, Behera J, Wang Y, Sloan LJ, Zhang J, Shields CB, Cooper GE, Gobejishvili L, Whittemore SR, McClain CJ, Barve SS"
journal: "Gut microbes"
pubdate: "2024"
doi: "10.1080/19490976.2024.2389319"
source: "PMC Full Text"

O declínio temporal associado à idade nas bactérias produtoras de butirato desempenha um papel patogênico chave no início e progressão da neuropatologia e déficits de memória em camundongos 3×Tg-AD.

Autores

Chilton PM, Ghare SS, Charpentier BT, Myers SA, Rao AV, Petrosino JF, Hoffman KL, Greenwell JC, Tyagi N, Behera J, Wang Y, Sloan LJ, Zhang J, Shields CB, Cooper GE, Gobejishvili L, Whittemore SR, McClain CJ, Barve SS

Periodico

Gut microbes (2024)

Conteudo

Declínio temporal associado à idade em bactérias produtoras de butirato desempenha um papel patogênico fundamental no início e progressão da neuropatologia e déficits de memória em camundongos 3×Tg-AD
RESUMO
Alterações no eixo intestino-microbioma-cérebro estão cada vez mais sendo reconhecidas como envolvidas na patogênese da doença de Alzheimer (DA). No entanto, as consequências funcionais da disbiose entérica que ligam a microbiota intestinal e a patologia cerebral na progressão da DA permanecem em grande parte indeterminadas. O presente trabalho investigou o papel causal do declínio temporal associado à idade em bactérias produtoras de butirato e butirato na etiopatogênese da DA. Análises longitudinais de metagenômica, neuropatologia e memória foram realizadas no modelo de camundongo 3×Tg-AD. Análises metataxonômicas mostraram um declínio temporal significativo na diversidade alfa, marcado por uma diminuição nas comunidades bacterianas produtoras de butirato e uma redução concomitante na produção de butirato cecal. A análise de metagenômica inferida identificou a via bacteriana do acetil-CoA como a principal via de síntese de butirato impactada. Concomitantemente, houve um declínio associado à idade na acetilação transcricionalmente permissiva da histona 3 nas lisinas 9 e 14 (H3K9/K14-Ac) em neurônios hipocampais. Importantemente, essas alterações no eixo microbioma-intestino-cérebro precederam a neuropatologia relacionada à DA, incluindo estresse oxidativo, hiperfosforilação da tau, déficits de memória e disfunção neuromuscular, que se manifestam por volta de 17-18 meses. O início da administração oral de tribuirina, um pró-fármaco de butirato, aos 6 meses de idade atenuou o declínio relacionado à idade nas bactérias produtoras de butirato, protegeu o status de H3K9/K14-Ac e atenuou o desenvolvimento de alterações neuropatológicas e cognitivas associadas à patogênese da DA. Esses dados implicam causalmente o declínio associado à idade em bactérias produtoras de butirato como uma característica patogênica chave do eixo microbioma-intestino-cérebro que afeta o início e a progressão da DA. Importantemente, a regulação das bactérias produtoras de butirato e a consequente síntese de butirato pode ser uma estratégia terapêutica significativa na prevenção e tratamento da DA.
Fundo
Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva relacionada à idade, caracterizada patologicamente pela formação de placas senis extracelulares compostas principalmente por agregados de β-amiloide e emaranhados neurofibrilares de tau hiperfosforilada intraneuronais (NFTs), com um declínio gradual nas funções cognitivas. Alterações no microbioma intestinal (disbiose) são cada vez mais reconhecidas como associadas a alterações no eixo microbioma-intestino-cérebro que participam da etiopatogênese da DA. Estudos em animais e humanos mostraram que a disbiose entérica, envolvendo mudanças composicionais no microbioma intestinal, está associada ao desenvolvimento de alterações neuropatológicas e déficits cognitivos e de memória na patogênese da DA. Além disso, transferências microbianas fecais de pacientes com DA levam a prejuízos na neurogênese hipocampal adulta em ratos receptores. No entanto, as consequências funcionais da disbiose entérica que afetam os metabólitos microbianos envolvidos na ligação entre a microbiota intestinal e a patologia cerebral na progressão da DA estão apenas começando a ser compreendidas.

No que diz respeito aos aspectos funcionais do microbioma intestinal e à consequente síntese de metabólitos microbianos, uma função importante das bactérias intestinais é a fermentação de fibras dietéticas indigestíveis, levando à produção de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Particularmente, entre os SCFAs produzidos pelo microbioma intestinal, o butirato demonstrou abranger múltiplos benefícios à saúde, incluindo propriedades neuroprotetoras que influenciam direta ou indiretamente as funções cerebrais. Notavelmente, também há indicações de que o butirato tem o potencial de atenuar processos neuropatológicos relevantes subjacentes à patogênese da DA. Estudos em animais e humanos relataram uma diminuição nas bactérias produtoras de butirato na DA; no entanto, esses estudos foram transversais e forneceram informações apenas sobre a abundância estática dos táxons microbianos produtores de butirato associados à patogênese da DA. Assim, o principal objetivo deste estudo foi investigar as mudanças longitudinais associadas à idade nos táxons microbianos produtores de butirato e as mudanças concomitantes na funcionalidade (síntese de butirato), juntamente com os impactos na progressão da DA.
A fenotipagem e caracterização sistemáticas demonstraram que o modelo de camundongo 3×Tg-AD da DA (3×Tg) desenvolve gradualmente alterações neuropatológicas envolvendo tanto placas de Aβ quanto NFT de forma relacionada à idade ao longo da vida útil de 4 a 18 meses. Isso torna o modelo 3×Tg idealmente adequado para examinar o desenvolvimento de disbiose microbiana intestinal relacionada à idade e seu papel patogênico no início e progressão da DA e nas patologias associadas de amiloide e tau. Vale ressaltar que as informações são limitadas em relação às mudanças composicionais e funcionais no microbioma intestinal antes do início da DA sintomática. Portanto, usamos os camundongos 3×Tg para investigar a ligação causal entre a disbiose microbiana intestinal associada à idade, especialmente a perda de bactérias produtoras de butirato, e o início e progressão da DA. Além disso, testamos a eficácia da suplementação oral de tributirina (TB) como uma potencial estratégia de intervenção para mitigar os efeitos da disbiose microbiana intestinal que afeta as comunidades microbianas produtoras de butirato e o consequente desenvolvimento da DA. A TB é uma molécula dietética de triacilglicerol de ocorrência natural composta por três moléculas de ácido butírico esterificadas com glicerol que funciona como um pró-fármaco de butirato. A TB é quimicamente estável, mas é rapidamente hidrolisada por lipases pancreáticas e gástricas para liberar butirato. A hidrólise completa de um mol de TB tem o potencial de gerar três moles de ácido butírico. Trabalhos realizados por nós e por outros documentaram a capacidade de usar a administração oral de TB para atingir concentrações farmacologicamente relevantes de butirato no plasma de roedores. Importante, além de atuar como um pró-fármaco de butirato para aumentar as concentrações sistêmicas de butirato por um período sustentado de tempo, a TB exibe melhores propriedades farmacocinéticas com menor toxicidade do que o butirato.
O presente trabalho, que traça o perfil do microbioma intestinal por meio de sequenciamento do gene 16S rRNA juntamente com análise de metagenômica inferida usando PICRUSt2, determinou o impacto das mudanças temporais associadas à idade na composição e função das bactérias produtoras de butirato em relação ao desenvolvimento de alterações neuropatológicas e déficits de memória subjacentes à DA nos camundongos 3×Tg. O exame e a determinação das características específicas da microbiota intestinal e dos metabólitos microbianos que afetam o desenvolvimento da neuropatologia e disfunção cognitiva relacionadas à DA seriam relevantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas ao eixo microbioma-intestino-cérebro para pacientes com DA.
Métodos
Camundongos transgênicos triplos homozigotos modelando a doença de Alzheimer de início precoce, B6;129-Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa Psen1tm1Mpm/Mmjax (3×Tg; RRID:MGI:3720782), desenvolvidos na Universidade da Califórnia por Frank LaFerla, foram adquiridos do MMRC. Camundongos B6129SF2/J (B6.129; RRID: IMSR_JAX:101045) foram adquiridos do Jackson Labs e usados como camundongos controle não transgênicos (nTg). Todos os camundongos foram alojados em uma instalação livre de patógenos específicos com ciclos de 12 horas de luz/12 horas de escuridão na Universidade de Louisville, e os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes federais e institucionais com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais e do Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade de Louisville.
Desenho experimental
Camundongos fêmeas 3×Tg desenvolvem de forma mais consistente características dependentes da idade da neuropatologia da DA envolvendo o acúmulo de placas Aβ e NFT consistindo de tau fosforilada. Relatos demonstraram progressão consistente, dependente da idade e previsível da patologia semelhante à DA em fêmeas, mas não em machos, camundongos 3×Tg.camundongos fêmeas de seis meses de idade 3×Tg foram separados em dois grupos (n = 6 cada). Um grupo foi tratado duas vezes por semana com tributerina não diluída (TB; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 2 g/kg por gavagem oral até os 16 meses de idade, e um grupo não foi tratado. A dosagem de TB foi baseada em nossos estudos anteriores que avaliaram seu papel como um pró-fármaco eficaz de butirato. Aos 17 meses de idade, esses camundongos, juntamente com camundongos 3×Tg não tratados de 12 meses (n = 6) e de 2 meses (n = 5), foram submetidos aos testes comportamentais/funcionais descritos abaixo. Quando o grupo tratado com TB atingiu 18 meses, os camundongos foram profundamente anestesiados e perfundidos com solução salina tamponada com fosfato (PBS) após eutanásia por pneumotórax. Fígado, conteúdo cecal, pellets fecais e intestino foram coletados e os locais dos tecidos foram clampeados para permitir a perfusão com 50 ml de formaldeído a 4% (preparado fresco a 4% p/v a partir de paraformaldeído em PBS, pH 7.2). Os cérebros perfundidos foram coletados, dissecados em hemisférios e fixados durante a noite em formaldeído a 4% e depois incubados em sacarose a 30% por 72 h a 4°C.
Imuno-histoquímica e imunofluorescência
Os hemisférios cerebrais foram embebidos em parafina, e cortes sagitais de 5 μm foram cortados, montados em lâminas e incubados a 60°C por 48 h. Os cortes foram simultaneamente desparafinizados, reidratados e desmascarados antigênicos usando reagente Trilogy (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) antes da coloração com anticorpo primário (Tabela Suplementar S1), conforme descrito anteriormente. A imunocoloração foi realizada para a detecção de neurônios, Aβ, proteína tau fosforilada em diferentes sítios, bem como proteínas contendo adutos resultantes de processos de estresse oxidativo, 4-hidroxinonenal (4-HNE) e acroleína. As informações sobre os anticorpos estão listadas na Tabela Suplementar S1. Após a coloração, os cortes de tecido foram analisados principalmente no hipocampo e no subículo em um microscópio de fluorescência Keyence BZ-810 All-in-One (RRID:SCR_023617) para imageamento de fluorescência e campo claro. As áreas positivas para imunofluorescência foram quantificadas nos cortes corados usando o software Keyence H3A Analyzer (RRID:SCR_017375). A coloração com DAB (3,3’-diaminobenzidina) foi utilizada para detecção imuno-histoquímica de Aβ, 4-HNE e acroleína. A área positiva para Aβ foi quantificada usando o software ImageJ (RRID:SCR_003070). Para a coloração de 4-HNE e acroleína, duas formas de quantificação foram utilizadas: (1) contagem manual cega e (2) quantificação automatizada de punctas coradas. Usando o software Keyence Analyzer, os parâmetros foram ajustados para detectar a coloração punctata ajustando as configurações de circularidade e matiz para corresponder à coloração positiva com DAB. Essa análise excluiu áreas irregularmente formadas com matizes correspondentes e diferenciou entre eventos de coloração positiva sobrepostos. Ambos os métodos produziram resultados semelhantes, mas as contagens automatizadas do software Keyence são apresentadas. Os dados de quantificação são apresentados como média ± desvio padrão obtidos de 4–6 animais por coloração, usando um corte de tecido imageando o subículo por animal.
Os métodos de sequenciamento do gene 16S rRNA foram adaptados daqueles desenvolvidos para os Projetos Microbioma Humano e da Terra. Resumidamente, as amostras cecais obtidas de camundongos 3×Tg foram usadas para extrair o DNA genômico bacteriano total usando o kit MagAttract PowerSoil (Qiagen, Redwood City, CA). A região 16Sv4 foi amplificada por PCR e sequenciada na plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, CA; RRID:SCR_016379) usando um protocolo paired-end de 2 × 250 pb, gerando leituras pareadas com sobreposição quase completa. Além disso, as leituras de sequência foram demultiplexadas, desnaturadas usando o algoritmo Deblur e atribuídas a unidades taxonômicas operacionais (OTU) com 97% de similaridade usando o banco de dados SILVA mais recente (RRID:SCR_006423) contendo apenas sequências da região v4 do gene 16S rRNA para determinar taxonomias usando a função 'usearch_global' do usearch70. O arquivo biome foi gerado para informações filogenéticas alinhando as sequências centróides com MAFFT (RRID:SCR_011811) e uma árvore foi criada via FastTree (RRID:SCR_015501). O arquivo biome foi resumido, registrou-se o número de leituras por amostra e mesclado com um arquivo gerado para as estatísticas gerais de leitura, produzindo um arquivo de resumo final com leituras, estatísticas e informações taxonômicas.
Análise PICRUSt2
A Investigação Filogenética de Comunidades pela Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt2; RRID:SCR_022647) foi usada para análise preditiva das vias de síntese de butirato no microbioma intestinal de camundongos 3×Tg envolvidos neste estudo. Configurações padrão do plugin q2-PICRUSt2, que utiliza dados de sequência e informação gênica gerados na forma de saída do QIIME2 com o algoritmo de desnaturação Deblur. Os dados do gene 16S rRNA foram usados juntamente com informações relativas aos números de cópias dos genes de síntese de butirato presentes em cada grupo taxonômico arqueano e bacteriano sequenciado no banco de dados Integrated Microbial Genomes (IMG). O posicionamento da sequência com o banco de dados do genoma de referência foi concluído usando o pipeline SEPP do plugin q2-PICRUSt2. O arquivo de saída contém valores normalizados correspondentes à contribuição do genoma bacteriano em uma amostra específica para a expressão de um ID específico da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (ID de Ortólogo KEGG; RRID:SCR_012773).
Manuseio animal antes das avaliações de memória e função neuromuscular
Os animais foram manuseados por pelo menos 3 dias antes dos testes para aclimatação à manipulação experimental. Grupos de 3×Tg foram randomizados para cegar o investigador dos testes quanto ao tratamento ou grupos etários. Os testes incluíram teste de reconhecimento de novo objeto (NORT), teste de labirinto em Y, teste de preensão e teste de rotarod, descritos abaixo.
O NORT mede o desenvolvimento e a retenção da memória de reconhecimento usando a tendência instintiva de roedores em explorar preferencialmente objetos novos em vez de objetos conhecidos. Após um período de treinamento de 10 minutos em um campo aberto contendo dois objetos semelhantes, os camundongos foram removidos da área por 4 h e, em seguida, reintroduzidos na área contendo um objeto conhecido original e um objeto novo, e registrados por 5 minutos. A quantidade de tempo que cada camundongo passou explorando cada objeto no campo foi medida e comparada. Os resultados são expressos como o Índice de Reconhecimento (RI: ). Uma pontuação de RI ≤0,5 indica déficits de memória.
Teste do labirinto em Y
Como um teste de alternância espontânea usado para avaliar o comportamento exploratório e a memória de trabalho espacial de curto prazo, o teste do labirinto em Y também explora a preferência instintiva por explorar áreas novas. Os camundongos foram colocados no centro de um labirinto em Y com três ou dois braços abertos, e seus movimentos foram registrados por 8 minutos. A alternância espontânea entre os braços de 3 e 2 aberturas foi avaliada, e a porcentagem de alternância foi calculada. Pontuações mais baixas são indicativas de maiores déficits funcionais.
Teste de preensão dos membros anteriores
Este teste foi utilizado para avaliar a função neuromuscular conforme publicado anteriormente. Os sujeitos foram levantados pela cauda até a altura em que as patas dianteiras estivessem na mesma altura de uma barra horizontal e, em seguida, incentivados a agarrar a barra. Uma vez garantidas preensas simétricas e firmes de ambas as patas dianteiras, o camundongo foi puxado lenta e suavemente até que sua preensão fosse quebrada. A força na qual a preensão foi perdida foi registrada 3–5 vezes para determinar o melhor desempenho, que é então anotado como força de preensão. A força de preensão foi calculada como força de preensão por grama de peso corporal. Ambas as medidas são diretamente proporcionais à função neuromuscular.
Teste do rotarod
O teste do rotarod foi utilizado para avaliar a coordenação motora e o equilíbrio. A velocidade de rotação foi ajustada para acelerar de 4 a 40 rpm ao longo de 300 segundos, e o tempo (latência) e a velocidade (rpm) necessários para o animal cair da haste foram medidos. Antes de iniciar o estudo do rotarod, todos os camundongos foram autorizados a caminhar no rotarod por 1 minuto na velocidade constante (4 rpm). A velocidade foi então gradualmente acelerada para 40 rpm em 2 minutos, quando a velocidade da haste foi mantida. Um tempo de latência de 300 segundos foi registrado para camundongos que não caíram. Os ensaios foram realizados quatro vezes e conduzidos a cada 15 minutos.
Excluindo as análises de metagenômica do 16S rRNA e PiCRUSt2, todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 9.2 (RRID:SCR_002798). A maioria das estatísticas de comparação utilizou ANOVA unidirecional comum com análise post-hoc de Tukey para comparações múltiplas, onde a significância foi determinada em p < 0,05. Testes t não pareados paramétricos foram realizados com a correção de Welch, que assume um desvio padrão desigual entre os grupos. Quando os dados falharam nos testes de normalidade, foram realizadas análises não paramétricas de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney. Para a análise dos dados de metagenômica do 16S, a função ADONIS no pacote R VEGAN (versão 2.4–2; RRID:SCR_011950) foi utilizada para realizar comparações pareadas da composição da comunidade entre os grupos de tratamento de camundongos com base na matriz de dissimilaridade de Bray–Curtis (métricas de diversidade beta). Todas as comparações pareadas foram significativas com p < 0,05 utilizando a correção de Benjamini–Hochberg para comparações múltiplas [http://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html].
Resultados
Alterações estruturais e funcionais dependentes da idade na microbiota intestinal de camundongos 3×Tg
Para avaliar as mudanças relacionadas à idade no microbioma intestinal de camundongos 3×Tg, o sequenciamento do rDNA 16S do conteúdo cecal foi realizado em camundongos com 2, 12 e 18 meses de idade. Um total de 380.989 leituras mapeadas (média ± DP: 14.111 ± 9.804) foi obtido dos 28 camundongos de todos os grupos, que foram agrupados em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade. O conjunto final de OTUs consistiu em 485 OTUs classificadas em 81 gêneros, 36 famílias, 24 ordens, 9 classes e 7 filos.
O aumento da idade está associado a uma diminuição na diversidade microbiana intestinal
Diminuição da diversidade microbiana associada à idade e alterações na composição microbiana em camundongos 3×Tg.
A diversidade composicional do microbioma intestinal foi avaliada usando medidas de diversidade alfa e beta. Em comparação com animais de 2 meses, os camundongos de 12 meses exibiram uma redução de 50% na riqueza da amostra, medida por OTU observado e Chao-1 (ambos p < 0,001; Figura 1a,b), ambas medidas de diversidade alfa. Essas reduções persistiram aos 18 meses (p < 0,05). A uniformidade da amostra, outro componente da diversidade alfa, também foi avaliada usando o Índice de Diversidade de Shannon (Figura 1c). Embora reduções na uniformidade da amostra tenham sido evidentes em camundongos de 12 e 18 meses, apenas o último diferiu significativamente dos 2 meses. Esses dados indicam que a diversidade alfa do microbioma cecal diminui significativamente com o avanço da idade em camundongos 3×Tg. Em contraste com os camundongos 3×Tg, os camundongos nTg não exibiram nenhuma diminuição associada à idade nas medidas de diversidade alfa microbiana intestinal aos 12 e 17 meses em comparação com os 5 meses; no entanto, uma modesta diminuição na diversidade microbiana aos 17 meses, em comparação com os 12 meses, foi observada (Figura Suplementar S1).
A diversidade beta, uma medida da diversidade entre amostras, foi avaliada usando a métrica de distância de Bray Curtis ponderada e visualizada por análise de coordenadas principais (PCoA). Gráficos tridimensionais de PCoA demonstraram agrupamento distinto da microbiota intestinal de acordo com a idade e que as populações microbianas eram significativamente diferentes entre si (p < 0,05). Em particular, o microbioma intestinal de camundongos de 12 e 18 meses mostrou segregação distinta daqueles do grupo de 2 meses (Figura 1d), indicando que a mudança na composição geral do microbioma intestinal ocorreu nos primeiros 12 meses em camundongos 3×Tg e então se estabilizou em grande parte.

Um aumento na idade está associado a mudanças na composição do microbioma intestinal (disbiose)

Sete filos foram detectados nos conteúdos cecais de nossos camundongos. Entre eles, os dois principais filos bacterianos, Firmicutes e Bacteroidota, mostraram mudanças significativas dependentes da idade em sua abundância relativa (Figura Suplementar S2A). Especificamente, a abundância relativa de Firmicutes diminuiu 50% em animais de 12 meses em comparação com os de 2 meses (Figura 1e). Em contraste, a abundância relativa de Bacteroidota aumentou quase na mesma proporção durante o mesmo período (Figura 1f). Consistente com as medidas de diversidade microbiana, ambas as mudanças foram mantidas em animais de 18 meses (Figura 1e). Importante, a razão Firmicutes para Bacteroidota (F/B), um indicador conhecido para a saúde do microbioma intestinal, foi significativamente diminuída em camundongos de 12 e 18 meses em comparação com os de 2 meses (Figura 1g).

A disbiose intestinal associada à idade é marcada por uma diminuição nas bactérias produtoras de butirato em camundongos 3×Tg

Estudos pré-clínicos e clínicos sugerem que os ácidos graxos de cadeia curta produzidos pelo microbioma intestinal desempenham um papel na proteção contra a patologia da DA. Como observamos uma diminuição dependente da idade no filo Firmicutes, que abriga a maioria dos micróbios produtores de butirato, examinamos ainda o efeito da idade na abundância relativa de bactérias produtoras de butirato dentro deste filo nos conteúdos cecais de 3×Tg. Com base no catálogo de bactérias produtoras de butirato criado por Singhal et al., identificamos cinco famílias produtoras de butirato pertencentes ao filo Firmicutes. Assim como em nossa análise de Firmicutes como um todo, houve uma diminuição significativa no total de famílias produtoras de butirato em camundongos de 12 e 18 meses em comparação com camundongos de 2 meses (Figura 1h). Especificamente, nossos dados demonstraram que a idade avançada foi associada a uma diminuição significativa na família Ruminococcaceae, uma das maiores famílias bacterianas produtoras de butirato (Figura 1i), e uma consequente redução nos níveis de butirato cecal (Figura Suplementar S2D).

Em consonância com a diversidade microbiana não afetada, camundongos nTg não demonstraram uma diminuição dependente da idade no filo Firmicutes nem na abundância relativa de bactérias produtoras de butirato totais dentro deste filo (Figura Suplementar S1B,C).
Administração oral de tributerina atenua as alterações estruturais e funcionais associadas à idade na microbiota intestinal de camundongos 3×Tg

Com base na perda observada, dependente da idade, de micróbios-chave produtores de butirato e na consequente diminuição dos níveis de butirato cecal, examinamos os efeitos terapêuticos da administração oral de TB. A partir dos 6 meses de idade, camundongos 3×Tg demonstram deposição da proteína Aβ e início da patologia da DA. Conforme mostrado na Figura Suplementar S3A, o acúmulo de Aβ foi prontamente detectável no subículo de camundongos 3×Tg de 7 meses de idade. Portanto, a administração oral de TB foi iniciada em camundongos 3×Tg de 6 meses de idade e continuada até os 16 meses de idade. Amostras cecais foram analisadas para avaliar o impacto da suplementação prolongada de TB na disbiose microbiana intestinal e na consequente perda de bactérias produtoras de butirato.

A TB atenua a diminuição associada à idade na diversidade e disbiose do microbioma intestinal em camundongos 3×Tg

A administração oral de TB previne a diminuição na diversidade e composição microbiana em camundongos 3×Tg de 18 meses de idade.

Os conteúdos cecais de camundongos 3×Tg que receberam TB oral apresentaram um maior grau de uniformidade microbiana, medido pelo Índice de Diversidade de Shannon, do que os controles não tratados (p < 0,05; Figura 2a). Além disso, a riqueza do microbioma, avaliada pelo índice Chao-1, também tendeu a ser maior com o tratamento com TB (p < 0,06; Figura 2b). Consistente com as medidas de diversidade alfa, a diversidade beta, visualizada usando gráficos de PCoA de Bray-Curtis ponderados (Figura 2c), mostrou que o microbioma intestinal de animais submetidos ao tratamento com TB era composicionalmente distinto daquele de animais não tratados. Curiosamente, o microbioma intestinal de camundongos que receberam TB demonstrou menor dispersão em seu agrupamento e pareceu mais semelhante ao grupo de 2 meses de idade, particularmente ao longo do eixo PC1, o que indicou que a administração de TB ajudou a manter uma composição do microbioma intestinal semelhante à de camundongos jovens (Figura Suplementar S2B).

Além disso, a análise baseada em taxonomia demonstrou que a TB também induziu mudanças na distribuição geral dos filos microbianos (Figura Suplementar S2C). Especificamente, a abundância relativa do filo Firmicutes foi quase 2 vezes maior em camundongos tratados com TB em comparação com seus equivalentes não tratados (Figura 2d). Sem uma mudança significativa no filo Bacteroidota, a razão F/B foi significativamente maior em camundongos que receberam TB (Figura 2e,f). Em conjunto, esses dados sugerem que a administração oral de TB preveniu alterações na diversidade e disbiose do microbioma intestinal que ocorreram em camundongos 3×Tg de 18 meses de idade.

A TB atenua a perda associada à idade de bactérias produtoras de butirato em camundongos 3×Tg
O tratamento oral com TB ajudou a manter uma abundância relativa significativamente maior de famílias produtoras de butirato totais em comparação com camundongos não tratados (Figura 2g). Especificamente, TB levou a um enriquecimento significativo de bactérias na principal família produtora de butirato, Lachnospiraceae, e um aumento marginal nas comunidades de Ruminococcaceae (Figura 2h,i). Além disso, em consonância com a suplementação oral de TB, os níveis de butirato cecal aumentaram significativamente em camundongos 3×Tg de 18 meses de idade, mesmo que o tratamento tenha terminado aos 16 meses de idade (Figura Suplementar S2D).
Perfis funcionais previstos de genes sintetizadores de butirato afetados pela idade e tributirina no conteúdo cecal de camundongos 3×Tg
Alterações na abundância de genes sintetizadores de butirato observadas em camundongos 3×Tg.
Efeitos do envelhecimento e da suplementação de TB no potencial de síntese de butirato da microbiota intestinal em camundongos 3×Tg.
Gene Nome da Enzima Via de Síntese de Butirato 2mo vs. 12mo 2mo vs. 18mo 12mo vs. 18mo 18mo vs. 18mo+TB Tendência Valor-p Tendência Valor-p Tendência Valor-p Tendência Valor-p puuE or GABA-T 4-aminobutirato transaminase 4-Aminobutirato ↓ n.s. ↓ 0,023 ↓ n.s. ↑ n.s. 4Hbt, cat2, or abfT butiril-CoA:4-hidroxibutirato CoA transferase Acetil-CoA ↓ 0,055 ↓ 0,052 ↓ n.s. ↑ 0,070 phbB acetoacetil-CoA redutase Acetil-CoA ↓ n.s. ↓ n.s. ↓ 0,012 ↑ 0,049 atoB tiolase Acetil-CoA ↓ 0,039 ↓ 0,032 ↓ n.s. ↑ n.s. ptb fosfato butiriltransferase Acetil-CoA ↓ n.s. ↓ 0,051 ↓ n.s. ↑ n.s. buk butirato quinase Acetil-CoA ↓ 0,062 ↓ 0,037 ↓ n.s. ↑ n.s. crt crotonase Acetil-CoA ↓ 0,045 ↓ 0,039 ↓ n.s. ↑ 0,061 gctA glutaconato CoA transferase α Glutarato ↓ 0,041 ↓ 0,042 ↓ n.s. ↑ n.s. gctB glutaconato CoA transferase β Glutarato ↓ 0,037 ↓ 0,038 ↓ n.s. ↑ n.s. kamA lisina-2.3-aminomutase Lisina ↓ 0,049 ↓ 0,031 ↓ n.s. ↑ n.s. bcd butirato-CoA desidrogenase (incluindo proteína de transferência de elétrons subunidades α, β) Comum a todas ↓ 0,047 ↓ 0,039 ↓ n.s. ↑ n.s. estA esterase putativa tributirina esterase ↓ 0,036 ↓ 0,024 ↓ n.s. ↑ 0,030
Resultados do teste de Kruskal–Wallis comparando a abundância de genes sintetizadores de butirato em amostras cecais de camundongos 3×Tg aos 2, 12 e 18 meses de idade. TB: tributirina; n.s.: sem significância. As abreviações das enzimas estão definidas na legenda da Figura 2.
Os efeitos da idade e da suplementação com TB nas características funcionais do microbioma associadas à síntese de butirato foram examinados por meio de metagenômica inferida. A determinação putativa de genes sintetizadores de butirato foi obtida a partir da saída do PICRUSt2 usando um inventário interno atualizado de genes relacionados ao butirato previamente descritos. Esta análise preditiva mostrou que o microbioma intestinal de camundongos 3×Tg de 12 e 18 meses apresentou uma redução significativa na abundância de genes sintetizadores de butirato associados às quatro vias de síntese de butirato, a saber, as vias do acetil-CoA, lisina, 4-aminobutirato e glutarato (Tabela 1, Figura 3). Além disso, entre as quatro vias, os genes envolvidos na via de síntese de butirato por acetil-CoA foram os mais afetados pelo envelhecimento em camundongos 3×Tg. Notavelmente, a suplementação oral com TB atenuou as diminuições associadas à idade nos genes sintetizadores de butirato (Tabela 1, Figura 3). Adicionalmente, o gene que codifica a putativa esterase de TB (estA), que hidrolisa a TB para gerar butirato, foi previsto como significativamente reduzido em camundongos 3×Tg de 12 e 18 meses em comparação com os de 2 meses, indicando uma capacidade potencialmente diminuída do microbioma intestinal de derivar butirato da TB dietética em camundongos envelhecidos. Consequentemente, a expressão de estA foi prevista como aumentada em camundongos de 18 meses tratados com TB em comparação com aqueles sem tratamento (p = 0,030; Tabela 1).
Coletivamente, esses resultados demonstram que um componente significativo da disbiose associada à idade em camundongos 3×Tg envolve uma diminuição nas bactérias produtoras de butirato, que pode ser tratada pela suplementação com TB.
A suplementação oral com TB reduz significativamente tanto os marcadores de inflamação quanto de estresse oxidativo e previne a hiperfosforilação da tau
A TB previne a hiperfosforilação da tau, um componente crítico da patologia semelhante à DA em camundongos 3×Tg.
Inicialmente, examinamos o acúmulo relacionado à DA de placas Aβ e da proteína tau fosforilada (p-tau), que estão ligados ao desenvolvimento de neuroinflamação e estresse oxidativo. Conforme relatado anteriormente, camundongos 3×Tg desenvolveram acúmulo relacionado à DA de placas Aβ e p-tau de forma dependente da idade (Figura 4). Além disso, os estados de fosforilação da tau foram avaliados por i) coloração única com anticorpos monoclonais D2Z4G (S404) ou AT8 (S202, T205) e ii) co-coloração e colocalização com D2Z4G e AT8 para indicar hiperfosforilação. Esses dados mostraram que o acúmulo de p-tau corada individualmente foi detectado aos 12 meses de idade e aumentou significativamente aos 18 meses. No entanto, a detecção de tau hiperfosforilada, que é indicativa de sua mudança conformacional neuropática, foi observada apenas em idade avançada de 18 meses. Essas alterações de Aβ e p-tau foram predominantemente observadas no componente mais inferior do hipocampo, o subículo (Figura 4a,c), que tem sido associado à memória espacial e de trabalho.
O estresse oxidativo associado à idade é abolido em camundongos 3×Tg através da administração oral de TB.
A patologia da DA em modelos humanos e murinos, incluindo camundongos 3×Tg, é caracterizada por aumento do estresse oxidativo, o que pode levar a danos neuronais e morte. Notavelmente, tanto os adutos de 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE; Figura 5a,b) quanto os de acroleína (Figura 5c,d) aumentaram com a idade. Pouco ou nenhum 4-HNE ou acroleína foi detectado no hipocampo aos 2 meses de idade, mas ambos estavam aumentados aos 12 meses e significativamente aumentados aos 18 meses de idade no estrato lúcido e na camada molecular do hipocampo. A coloração para acroleína e 4-HNE não pareceu estar presente nas regiões CA ou nos neurônios do giro denteado. Nenhum dos marcadores estava significativamente aumentado no cerebelo ou no córtex frontal (dados não mostrados).

A suplementação com TB iniciada aos 6 meses de idade reduziu significativamente o acúmulo tanto de 4-HNE (Figura 5a,b) quanto de acroleína (Figura 5c,d) no hipocampo de animais com 18 meses de idade. Curiosamente, embora nenhuma diferença tenha sido observada no acúmulo de placas Aβ ou de p-tau corado individualmente em animais tratados com TB (Figura 4), a hiperfosforilação patológica, demonstrada por coloração dupla e colocalização, foi marcadamente inibida pela administração oral de TB (Figura 4c,d). Além disso, a análise por imagem confocal do subículo de camundongos de 18 meses e de camundongos de 18 meses tratados com TB estabeleceu que a hiperfosforilação da tau ocorreu em neurônios e foi significativamente diminuída pela administração oral de TB (Figura 4e).

A suplementação oral com TB previne a diminuição dependente da idade da histona H3-K9/K14-ac no hipocampo

A suplementação com TB previne a diminuição relacionada à idade de H3K9/K14-ac em camundongos 3×Tg.

Uma função biológica importante do butirato é a inibição de histona desacetilases (HDACs), afetando o status de acetilação das histonas e os mecanismos reguladores epigenéticos. Para determinar os efeitos funcionais no SNC exercidos pela perda de bactérias produtoras de butirato, avaliamos o status de acetilação da histona 3 nos resíduos de lisina 9 e lisina 14 (H3-K9/K14-Ac), que representa modificações de histonas associadas a elementos reguladores gênicos ativos. Notavelmente, a H3-K9/K14-Ac total diminuiu no hipocampo com a idade em cérebros 3×Tg (Figura 6a,b). Essas alterações de acetilação de histonas associadas à idade foram detectadas em todo o hipocampo e foram predominantes entre os neurônios hipocampais presentes no giro denteado, que são críticos para a formação da memória. Especificamente, os neurônios do giro denteado demonstraram coloração robusta para H3-K9/K14-Ac aos 2 meses, que tendeu a ser menor aos 12 meses e foi significativamente diminuída aos 18 meses de idade (Figura 6a,b). Importante, a proporção de neurônios NeuN+ que foram corados positivamente para H3-K9/K14-Ac no giro denteado foi completamente preservada pelo tratamento com TB (grupo 18mo+TB; Figura 6a,c). Notavelmente, uma correlação direta significativa (r = 0,4842, p = 0,0357) foi observada entre o total de bactérias produtoras de butirato e o status de acetilação da histona H3 (H3-K9/K14-Ac) da região hipocampal (Figura 6d).
A suplementação com tribuirina ab-roga déficits de memória de curto prazo e espacial dependentes da idade em camundongos 3×Tg
A TB protege camundongos 3×Tg do desenvolvimento de déficits de memória e neuromusculares aos 17 meses.

A memória episódica de curto prazo e a memória espacial foram medidas em camundongos 3×Tg com 2, 10 e 17 meses de idade usando o Teste de Reconhecimento de Objetos Novos (NORT) e o teste do labirinto em Y, respectivamente. O NORT e o teste do labirinto em Y exploram ambos o instinto roedor de explorar novos objetos e situações para medir a formação de memória associada ao hipocampo e são frequentemente usados para testar déficits cognitivos semelhantes à DA em camundongos. Conforme mostrado por traçados de trajetória representativos, a exploração de objetos novos diminuiu com a idade e foi amplamente restaurada nos camundongos idosos que receberam TB (Figura 7a). O índice de reconhecimento (RI) do NORT (Figura 7b) indicou interação preferencial com um objeto novo em uma arena habituada quatro horas após aprender um conjunto de dois objetos idênticos. Em camundongos 3×Tg de 17 meses, o RI do NORT foi significativamente reduzido em comparação com camundongos de 2 ou 10 meses (Figura 7b), indicando déficits na memória de curto prazo. O desempenho dos camundongos de 17 meses tratados com TB foi semelhante ao observado em camundongos de 2 ou 10 meses. A memória espacial dependente do hipocampo foi testada usando o teste do labirinto em Y, e os camundongos 3×Tg de 17 meses apresentaram desempenho reduzido tanto nos testes de labirinto em Y de 3 braços quanto de 2 braços em comparação com camundongos de 10 meses (Figura 7c,d). A suplementação oral com TB resultou em desempenhos significativamente melhores tanto nas medições do NORT quanto do labirinto em Y em camundongos de 17 meses, com pontuações comparáveis às dos camundongos 3×Tg de 10 meses (Figura 7a–c). Além disso, foi observada uma forte correlação positiva (r = 0,5449, p = 0,0087) entre as bactérias produtoras de butirato totais e o RI do NORT (Figura 7e). Em conjunto, esses dados sugerem que as perdas associadas à idade nas comunidades produtoras de butirato do microbioma intestinal desempenharam um papel significativo no desenvolvimento de déficits de memória de curto prazo em camundongos 3×Tg.

A suplementação com tribuirina trata efetivamente as perdas na função neuromuscular e na coordenação motora em camundongos 3×Tg
Conforme mostrado em outros estudos de modelos de camundongos DA que expressam proteínas tau polimórficas, tanto a função muscular quanto a coordenação motora diminuíram com a idade nos camundongos 3×Tg (Figura 7f,g). Embora a força de preensão dos membros anteriores (grama-força/peso corporal) tenha diminuído aos 10 meses, sem declínio adicional aos 17 meses, o tratamento com TB protegeu contra essa perda de força (Figura 7f). O desempenho de equilíbrio e coordenação no teste do rotarod variou amplamente tanto nos camundongos 3×Tg de 2 quanto de 10 meses, mas aos 17 meses eles exibiram uma latência para o tempo de queda acentuadamente reduzida, indicativa de coordenação motora e/ou equilíbrio diminuídos. Os camundongos de 17 meses tratados com TB, no entanto, exibiram coordenação motora comparável aos camundongos de 10 meses e significativamente superior à dos camundongos de 17 meses não tratados (Figura 7g).
Esses estudos demonstraram que o tratamento da TB começando aos 6 meses de idade inibiu dramaticamente a perda da função neurológica em camundongos 3×Tg, conforme indicado por aumentos na memória, cognição e função neuromuscular. Portanto, a TB impediu a progressão dos sinais clínicos de comprometimento cognitivo no contexto da patogênese semelhante à DA.
Estudos pré-clínicos e clínicos documentaram a incidência de proporções diminuídas de bactérias produtoras de butirato em associação com a DA; no entanto, informações sobre as mudanças dinâmicas nessas populações durante o desenvolvimento da DA permanecem amplamente indeterminadas. Assim, buscamos examinar de forma abrangente o declínio temporal associado à idade nas comunidades bacterianas produtoras de butirato que se correlacionam com o desenvolvimento de alterações neuropatológicas em camundongos 3×Tg. A avaliação taxonômica inicial das mudanças associadas à idade no microbioma intestinal demonstrou uma diminuição significativa no filo Firmicutes. Notavelmente, o filo Firmicutes abrange a maioria das bactérias produtoras de butirato dentro de distintas famílias bacterianas. Nosso estudo aproveitou o compêndio bem fundamentado de comunidades produtoras de butirato e identificou cinco famílias produtoras de butirato pertencentes ao filo Firmicutes, que demonstraram coletivamente um declínio associado à idade em sua abundância relativa e uma redução concomitante na produção cecal de butirato. Além disso, esta análise também revelou que, entre essas famílias em declínio, houve uma diminuição significativa associada à idade em Ruminococcaceae, uma das maiores famílias bacterianas produtoras de butirato. Estudos clínicos transversais em pacientes com DA também relataram diminuições na abundância de Firmicutes, juntamente com declínio nas famílias Ruminococcaceae e Lachnospiraceae. Isso apoia a relevância clínica dos achados no modelo animal pré-clínico 3×Tg e demonstra de forma abrangente a diminuição longitudinal associada à idade nas famílias produtoras de butirato no contexto da patogênese da DA. Vale notar que os camundongos nTg, desprovidos de qualquer neuropatologia relacionada à DA, não demonstraram alterações longitudinais associadas à idade na diversidade microbiana ou no total de bactérias produtoras de butirato. Com relação às mudanças relacionadas à idade no microbioma intestinal, a análise transversal demonstrou uma diminuição nas bactérias produtoras de butirato em camundongos C57BL/6J relativamente mais velhos (≥20 meses). Portanto, é concebível que os camundongos nTg possam potencialmente experimentar uma diminuição nas bactérias produtoras de butirato em uma idade relativamente mais tardia (além do ponto temporal de 17 meses do estudo). Esses dados demonstram que houve uma diferença distinta entre camundongos 3×Tg e seus equivalentes nTg no desenvolvimento e na trajetória da disbiose microbiana intestinal relacionada à idade, marcada pela perda de comunidades bacterianas totais produtoras de butirato. Além disso, esses dados também implicam que a diminuição temporal nas bactérias produtoras de butirato que ocorre em camundongos 3×Tg em uma idade relativamente mais precoce (observável aos 12 meses), antes do desenvolvimento de alterações neuropatológicas, é provavelmente uma consequência dos efeitos combinados do envelhecimento e da doença de Alzheimer.
Além das análises taxonômicas que mostram alterações na composição de bactérias produtoras de butirato, a análise metagenômica inferida forneceu informações sobre a alteração funcional nas vias metabólicas do butirato associadas às comunidades microbianas produtoras de butirato. Trabalhos anteriores demonstraram que, no contexto das comunidades microbianas produtoras de butirato, direcionar vias completas é uma forma mais convincente de prever a função butirogênica. Dessa forma, nossa análise metagenômica da função butirogênica geral do microbioma intestinal identificou a via do acetil-CoA como a principal via bacteriana para a produção de butirato, que foi significativamente reduzida de forma dependente da idade nos camundongos 3×Tg. Os efeitos temporais associados à idade na redução da via do acetil-CoA são um componente altamente significativo e relevante da perda de produção de butirato e da disbiose funcional do microbioma. Vale ressaltar que o microbioma murino compartilha semelhanças com o microbioma humano, que também compreende o acetil-CoA como a principal via de síntese de butirato, presente na maioria das bactérias produtoras de butirato que impulsionam a produção de butirato. Importante, esses dados em camundongos 3×Tg demonstram que a diminuição temporal observada nas bactérias sintetizadoras de butirato associadas à idade: i) é um componente principal da perda de diversidade geral que diminui progressivamente ao longo do tempo, ii) corresponde à perda funcional da síntese de butirato, conforme indicado pela diminuição nos níveis de butirato cecal, e iii) correlaciona-se com o desenvolvimento de alterações neuropatológicas relacionadas à DA. Vale destacar que a disbiose microbiana intestinal evidente aos 12 meses precedeu a manifestação da neuropatologia relacionada à DA aos 18 meses, incluindo estresse oxidativo, tauopatia (hiperfosforilação da tau) e déficits de memória, bem como perda de força muscular e desenvolvimento de disfunção neuromuscular. Importante, essas alterações temporais no microbioma intestinal foram indicativas de seu possível papel causal no início e na progressão da patologia da DA.
A relação causal do declínio composicional e funcional associado à idade nas bactérias produtoras de butirato na patogênese da DA foi corroborada pelos resultados da administração oral do pró-fármaco de butirato, tributirina. A administração de TB foi propositalmente iniciada aos 6 meses de idade em camundongos 3×Tg, o que corresponde ao estágio inicial do desenvolvimento de patologias progressivas de amiloide e tau. Importante, a administração de TB preveniu o declínio relacionado à idade nas famílias totais produtoras de butirato e nos níveis cecais de butirato, que se correlacionaram significativamente com a atenuação das alterações neuropatológicas e cognitivas associadas à patogênese da DA. No entanto, o efeito profilático benéfico observado do TB foi independente dos níveis de β-amiloide e da formação de placas senis, que permaneceram inalterados. Esses dados estão de acordo com as observações em um modelo de camundongo transgênico relacionado de patologia amiloide e déficits cognitivos, no qual a redução dos níveis endógenos de tau preveniu déficits comportamentais sem alterar seus altos níveis de Aβ. Além disso, em estudos clínicos, a relevância da correlação fraca entre a carga de placas amiloides cerebrais e a frequência, gravidade ou perda neuronal da doença foi reconhecida. Ademais, a identificação de amiloidose cerebral em cerca de 30 a 40% dos indivíduos na faixa dos 70 anos e 50% dos centenários sem comprometimento cognitivo foi observada. Em conjunto, nossos dados, juntamente com trabalhos anteriores, sustentam fortemente o papel fundamental da tau hiperfosforilada na patogênese da DA no modelo animal 3×Tg de DA, que pode ser prevenida pela administração oral de TB.
Após administração oral, o TB é hidrolisado em butirato, aumenta os níveis plasmáticos de butirato e fornece capacidades inibitórias da HDAC. Em consonância com a função biológica da inibição da HDAC, o TB/butirato preveniu o extenso declínio temporal associado à idade nos níveis de acetilação de H3K9 e H3K14 nas populações neuronais do CA1 e CA3 do hipocampo e preservou a função de memória. A acetilação da histona H3 tanto na lisina 9 quanto na 14 (H3K9/K14-Ac) é bem estabelecida como modificações de histonas que caracterizam um estado de cromatina promotora transcricionalmente ativa e é frequentemente associada à transcrição em andamento. Portanto, a diminuição temporal nos níveis de acetilação de H3K9/K14 potencialmente representa repressão transcricional de genes relevantes que contribuem para a função de memória. Nesse sentido, trabalhos anteriores demonstraram que uma diminuição na acetilação geral de histonas cerebrais em camundongos transgênicos Tg2576 para DA leva à regulação negativa transcricional e à expressão de genes envolvidos na integridade e plasticidade sináptica, levando ao comprometimento da função de memória. Além disso, em diferentes modelos animais de DA, a inibição da função da HDAC pela aplicação de inibidores de HDAC pan e seletivos de isoforma, incluindo o butirato, foi observada como contrapondo os déficits de memória e aprendizado associados à patogênese da DA. Os dados atuais sugerem fortemente que, em camundongos 3×Tg, as diminuições antecedentes associadas à idade nas comunidades produtoras de butirato e na síntese de butirato desempenham um papel causal na desregulação das HDACs do hipocampo e na consequente desacetilação de resíduos específicos de lisina de histonas, provavelmente levando à repressão transcricional de genes relacionados à memória e ao aprendizado. A identidade desses genes específicos afetados pela perda de bactérias produtoras de butirato e níveis de butirato que poderiam afetar a função de memória ainda precisa ser definida.
Os efeitos benéficos do TB também suprimiram a hiperfosforilação de tau, uma marca registrada da patologia da DA. Esse efeito neuroprotetor do TB poderia potencialmente ter sido desencadeado por meio de sua função inibitória da HDAC e envolvendo a inibição da glicogênio sintase quinase 3β (GSK3β). Sabe-se que os inibidores de HDAC inibem a GSK3β, uma quinase que participa da hiperfosforilação patogênica de tau durante a patogênese da DA. Além disso, um inibidor seletivo de HDAC3 também demonstrou diminuir a hiperfosforilação de tau ao inibir diretamente mecanismos dependentes de HDAC3 que medeiam a fosforilação de tau.
Além de prevenir o desenvolvimento da neuropatologia associada à DA e da disfunção cognitiva, o TB/butirato também inibiu significativamente a perda concomitante de função neuromuscular e coordenação motora. Fenótipos associados à sarcopenia envolvendo alterações patológicas na força e função muscular, juntamente com declínio cognitivo, são observados em pacientes humanos com DA. Vale notar que as HDACs desempenham papéis reguladores-chave no metabolismo do músculo esquelético e foram associadas ao desenvolvimento de atrofia e disfunção muscular. Diante disso, os dados sugerem que a disbiose microbiana intestinal iniciou alterações temporais nas HDACs no músculo esquelético, levando a fenótipos relacionados à sarcopenia que são alvo terapêutico da função inibidora de HDAC do TB/butirato. De fato, o butirato, por meio de sua função inibidora de HDAC, demonstrou atenuar a sarcopenia relacionada à idade, envolvendo a perda de massa e função muscular esquelética.

Os efeitos neuroprotetores da administração oral de TB também envolveram função antioxidante, evidenciada pela inibição da formação e acúmulo associados à idade dos principais subprodutos da oxidação lipídica, 4-HNE e acroleína. Trabalhos anteriores demonstraram que os subprodutos da peroxidação lipídica são biomarcadores clinicamente relevantes do estresse oxidativo e contribuem significativamente para o desenvolvimento da fisiopatologia da DA. No que diz respeito à relação com outras características patológicas da DA, sabe-se que o produto da peroxidação lipídica acroleína instiga a hiperfosforilação da tau através da ativação de proteínas quinases ativadas por estresse, como GSK3β e p38 quinase. A inibição da formação associada à idade dos subprodutos neuropatológicos da peroxidação lipídica 4-HNE e acroleína pelo TB/butirato é provavelmente mediada pela indução do sistema antioxidante glutationa/glutationa-S-transferase (GST).

No geral, esses dados apoiam nossa afirmação de que o declínio associado à idade nas bactérias produtoras de butirato no microbioma intestinal atua como uma característica patogênica chave do eixo microbioma-intestino-cérebro durante o início e a progressão da DA. Além disso, os dados demonstram que a regulação das bactérias produtoras de butirato e a consequente síntese de butirato podem ser um tratamento terapêutico significativo para a progressão da DA.

Material Suplementar

Abreviaturas

3×Tg
Modelo de camundongo 3×Tg-AD
4-HNE
4-hidroxi-2-nonenal
acetil-CoA
acetil-coenzima A
DA
Doença de Alzheimer
Aβ
amiloide-β
h
horas
NFT
emaranhado neurofibrilar
nTg
não transgênico
PBS
tampão fosfato-salino
PICRUSt2
Investigação filogenética de comunidades por reconstrução de estados não observados 2
p-tau
proteína tau fosforilada
SCFA
ácidos graxos de cadeia curta
TB
tributirina

Declaração de divulgação
Nenhum potencial conflito de interesses foi relatado pelo(s) autor(es).

Contribuições dos autores
Conceitualização: J.C.G., B.T.C., P.M.C., N.T., S.S.G., S.R.W., S.S.B; Metodologia: B.T.C., J.C.G., S.A.M., J.Z., K.L.H., P.M.C., J.B., Y.W., L.J.S.; Análise de Dados: B.T.C., S.S.G, P.M.C., S.A.M., A.V.R., J.F.P, K.L.H., N.T., J.B.; Aquisição de Financiamento: C.J.M., S.S.B., Supervisão: P.M.C., S.S.G., N.T., L.G., S.S.B.; Redação – rascunho original: B.T.C, S.S.G., P.M.C., N.T.; Redação – revisão e edição: P.M.C., S.S.G., B.T.C., S.A.M., A.V.R., J.F.P., K.L.H., N.T., C.B.S., C.E.C., L.G., S.R.W., C.J.M., S.S.B. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Consentimento para publicação
Nenhum sujeito humano foi utilizado nestes estudos; portanto, nenhum consentimento foi necessário para a condução deste trabalho.
Declaração de disponibilidade de dados
Os dados que apoiam os achados deste estudo estão disponíveis junto ao autor correspondente, [SSB], mediante solicitação razoável em conformidade com as diretrizes de compartilhamento de dados do NIH.
Material suplementar
Dados suplementares para este artigo podem ser acessados online em https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2389319
Referências
O diagnóstico neuropatológico da doença de Alzheimer
Microbiota na neuroinflamação e disfunção sináptica: um foco na doença de Alzheimer
Papéis e mecanismos da microbiota intestinal em pacientes com doença de Alzheimer
Microbiota intestinal: do órgão esquecido a um potencial ator-chave na patologia da doença de Alzheimer
Microbiota de pacientes com Alzheimer induz déficits na cognição e neurogênese hipocampal
A neurofarmacologia do butirato: o pão com manteiga do eixo microbiota-intestino-cérebro?
Eixo microbioma intestinal-cérebro-cirrose
Butirato de sódio reduz os níveis de amiloide-β cerebral e melhora o desempenho da memória cognitiva em um modelo de camundongo transgênico da doença de Alzheimer em estágio inicial da doença
Efeito do Clostridium butyricum contra a neuroinflamação mediada por micróglia na doença de Alzheimer através da regulação da microbiota intestinal e do metabólito butirato
Papéis protetores dos ácidos graxos de cadeia curta derivados da microbiota intestinal nos mecanismos neuropatológicos do beta-amiloide do tipo doença de Alzheimer
Fenotipagem e caracterização sistemática do modelo de camundongo 3xTg-ad da doença de Alzheimer
Determinação da distribuição posicional de grupos butiril em triacilgliceróis de gordura do leite, misturas de triacilgliceróis e isômeros posicionais isolados de triacilgliceróis por cromatografia gasosa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H
Tributirina, um pró-fármaco estável e rapidamente absorvido do ácido butírico, potencializa os efeitos antiproliferativos do dihidroxicolecalciferol em células de câncer de cólon humano
Fundamento para o fornecimento luminal de butirato em doenças intestinais
Butirato como agente diferenciador: farmacocinética, análogos e status atual
Tributirina inibe a repressão epigenética induzida por etanol do CPT-1A e atenua a esteatose e lesão hepática
A administração oral de tributirina aumenta a concentração de butirato na veia porta e previne a lesão hepática induzida por lipopolissacarídeo em ratos
Modelo triplo-transgênico da doença de Alzheimer com placas e emaranhados

Progressão temporal e regional da patologia semelhante à doença de Alzheimer em camundongos 3xTg-AD

A expressão da fosfodiesterase 4b desempenha um papel importante na neuroinflamação induzida pelo álcool

Estrutura, função e diversidade do microbioma humano saudável

Análise de comunidades microbianas de ultra-alto rendimento nas plataformas Illumina HiSeq e MiSeq

Deblur resolve rapidamente padrões de sequência de comunidade de nucleotídeo único

O projeto do banco de dados de genes de RNA ribossômico SILVA: processamento de dados aprimorado e ferramentas baseadas na web

Paralelização do programa de alinhamento de sequências múltiplas MAFFT

FastTree 2 – árvores de máxima verossimilhança aproximada para grandes alinhamentos

PICRUSt2 para predição de funções metagenômicas

Ciência de dados de microbioma reprodutível, interativa, escalável e extensível usando QIIME 2

Curiosidade e exploração

Progesterona e estrogênio regulam a neuropatologia semelhante à doença de Alzheimer em camundongos fêmeas 3xTg-AD

Atenuação do comprometimento do comportamento de alternância espontânea induzido por escopolamina por antagonista, mas não por agonista inverso e agonista β-carbolinas

Caracterização de ratos deficientes em distrofina: um novo modelo para distrofia muscular de Duchenne

A indução de tenascina-C exacerba o dano cerebral pós-AVC

Efeitos da luz infravermelha distante em camundongos transgênicos para a doença de Alzheimer

O papel dos ácidos graxos de cadeia curta da microbiota intestinal na comunicação intestino-cérebro

Microbiota intestinal alterada em um modelo de camundongo da doença de Alzheimer

Perspectivas para aplicações clínicas de bactérias produtoras de butirato

A diminuição na via do acetil-CoA utilizando bactérias produtoras de butirato é uma característica patogênica chave da disbiose microbiana intestinal funcional induzida pelo álcool e do desenvolvimento de doença hepática em camundongos

O subículo: o que faz, o que pode fazer, e o que a neuroanatomia ainda tem a nos dizer

Lesões eletrolíticas do subículo ventral alteram fracamente a memória espacial, mas potencializam a locomoção induzida por anfetamina

Estresse oxidativo e neurotoxicidade induzidos pelo peptídeo β-amiloide (1-42): implicações para a neurodegeneração no cérebro da doença de Alzheimer. Uma revisão

O peptídeo β-amiloide e a patologia amiloide são centrais para as cascatas de estresse oxidativo e inflamação sob as quais o cérebro da doença de Alzheimer existe

Inibição da atividade da histona desacetilase pelo butirato

Um marco da cromatina e início da transcrição na maioria dos promotores em células humanas

O padrão de modificação de histonas de genes ativos revelado através da análise genômica global da cromatina de um eucarioto superior

Circuitos funcionais de novos neurônios no giro denteado

Comprometimento rápido e reversível da memória episódica por uma dieta rica em gordura em camundongos

Um novo teste de tentativa única para estudos neurobiológicos da memória em ratos. 1: dados comportamentais

Caracterização comportamental abrangente de um modelo de camundongo com duplo knock-in APP/PS-1 da doença de Alzheimer

Modelagem de limitações funcionais, comprometimentos da marcha e patologia muscular na doença de Alzheimer: estudos em camundongos 3xTg-AD
Impulsividade, diminuição da exploração social e disfunção executiva em um modelo de camundongo de demência frontotemporal
O papel dos ácidos graxos de cadeia curta na comunicação microbiota–intestino–cérebro
Microbiota intestinal em pacientes com espectro da doença de Alzheimer: uma revisão sistemática e meta-análise
Microbiota intestinal alterada em adultos com declínio cognitivo subjetivo: o estudo SILCODE
Disbiose estrutural e funcional da microbiota fecal em pacientes chineses com doença de Alzheimer
A microbiota intestinal é alterada em pacientes com doença de Alzheimer
Alterações do microbioma intestinal na doença de Alzheimer
Anormalidades na sinalização microbiota/butirato/FFAR3 no intestino envelhecido prejudicam a função cerebral
Revelando as vias de síntese bacteriana de butirato por meio da análise de dados (meta)genômicos
A redução da tau endógena melhora os déficits induzidos pela beta-amiloide em um modelo de camundongo da doença de Alzheimer
A alta concentração de beta-amiloide 42 no líquido cefalorraquidiano está associada à cognição normal em indivíduos com amiloidose cerebral
Imagem de amiloide em indivíduos cognitivamente normais, populações de risco e doença de Alzheimer pré-clínica
Prevalência da doença de Alzheimer em pessoas muito idosas: um estudo neuropatológico prospectivo
Estudos clínico-patológicos em demência: sujeitos não demenciados com doença de Alzheimer confirmada patologicamente
A acetilação de H3K9 e H3K14 ocorre concomitantemente em muitos elementos reguladores de genes, enquanto H3K14ac marca um subconjunto de promotores indutíveis inativos em células-tronco embrionárias de camundongo
Domínios de cromatina ativa são definidos por ilhas de acetilação reveladas pelo mapeamento genômico completo
O fenilbutirato melhora o déficit cognitivo e reduz a patologia tau em um modelo de camundongo da doença de Alzheimer
Inibidores de histona desacetilases em doenças neurodegenerativas, neuroproteção e diferenciação neuronal
Intervenção farmacológica das enzimas histona desacetilases nos distúrbios neurodegenerativos
Tubastatina A/ACY-1215 melhora a cognição em camundongos transgênicos para a doença de Alzheimer Mice1
O estabilizador de humor valproato ativa o promotor do gene FGF1 humano por meio da inibição das atividades de HDAC e GSK-3
O valproato reduz a fosforilação da tau por meio das vias de sinalização da quinase 5 dependente de ciclina e da glicogênio sintase quinase 3
A inibição da HDAC3 reverte as patologias relacionadas à doença de Alzheimer in vitro e no modelo de camundongo 3xTg-ad
Sarcopenia e funções musculares em vários estágios da doença de Alzheimer
Associação da força muscular com o risco de doença de Alzheimer e a taxa de declínio cognitivo em idosos residentes na comunidade
Papéis emergentes das histona desacetilases na atrofia muscular relacionada à idade
O inibidor de histona desacetilase butirato melhora o metabolismo e reduz a atrofia muscular durante o envelhecimento
Papel dos subprodutos da oxidação lipídica no cérebro da doença de Alzheimer: foco na acroleína
As toxicidades de Aβ e tau na doença de Alzheimer estão ligadas via ativação de p38 induzida por estresse oxidativo: papel protetor da vitamina E
A ativação da quinase p38 liga a fosforilação da tau, o estresse oxidativo e eventos relacionados ao ciclo celular na doença de Alzheimer
O lítio inibe a fosforilação da proteína tau semelhante à doença de Alzheimer em neurônios
Envolvimento do sistema antioxidante glutationa/glutationa S-transferase na proliferação de células musculares lisas vasculares inibida pelo butirato
A genotoxicidade do 4-hidroxi-2-nonenal em células tumorais de cólon humano está associada aos níveis celulares de glutationa e à modulação da expressão da glutationa S-transferase A4 pelo butirato
O papel das glutationa S-transferases como defesa contra eletrófilos reativos na parede dos vasos sanguíneos