pmid: "41826362"
title: "Butirato prolonga a saúde e a vida em camundongos com deficiência mitocondrial."
authors: "Gabandé-Rodríguez E, Gómez de Las Heras MM, Ramírez-Ruiz de Erenchun P, Simó C, García-Cañas V, Inohara N, Berenguer-López I, Enríquez-Zarralanga V, Fernández-Almeida Á, Oller J, Soto-Heredero G, Carrasco E, Vázquez-Muñoz C, Delgado-Pulido S, Escrig-Larena JI, Francos-Quijorna I, Justo-Méndez R, Aranda JF, Poulton J, Lechuga-Vieco AV, Enríquez JA, Núñez G, Mittelbrunn M"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2026 Mar 13"
doi: "10.1038/s41467-026-70547-4"
source: "PMC Full Text"
Butirato prolonga a saúde e a vida em camundongos com deficiência mitocondrial.
Autores
Gabandé-Rodríguez E, Gómez de Las Heras MM, Ramírez-Ruiz de Erenchun P, Simó C, García-Cañas V, Inohara N, Berenguer-López I, Enríquez-Zarralanga V, Fernández-Almeida Á, Oller J, Soto-Heredero G, Carrasco E, Vázquez-Muñoz C, Delgado-Pulido S, Escrig-Larena JI, Francos-Quijorna I, Justo-Méndez R, Aranda JF, Poulton J, Lechuga-Vieco AV, Enríquez JA, Núñez G, Mittelbrunn M
Periodico
Nature communications (2026 Mar 13)
Conteudo
Butirato prolonga a saúde e a longevidade em camundongos com deficiência mitocondrial
As doenças mitocondriais levam progressivamente à falência multissistêmica, com opções de tratamento ainda extremamente limitadas. Aqui, para investigar estratégias que aliviam a disfunção mitocondrial, primeiro geramos um modelo de camundongo knockout ubíquo e induzível por tamoxifeno do fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), uma proteína codificada pelo núcleo envolvida na manutenção do DNA mitocondrial (mtDNA) — camundongos Tfamfl/flUbcCre-ERT2 (iTfamKO). A deficiência sistêmica de TFAM desencadeia o declínio mitocondrial em uma miríade de tecidos em camundongos adultos. Consequentemente, camundongos iTfamKO manifestam disfunção multiorgânica, incluindo lipodistrofia, sarcopenia, alterações metabólicas, insuficiência renal, neurodegeneração e desregulação locomotora, que resultam na morte prematura desses camundongos. Curiosamente, camundongos iTfamKO exibem ruptura da barreira intestinal e disbiose intestinal, com níveis reduzidos de ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) derivados da microbiota, como o butirato. Camundongos com uma versão deficiente de revisão da DNA polimerase gama mitocondrial (camundongos mtDNA-mutator) mimetizam a disfunção da barreira intestinal e a disbiose bacteriana com níveis reduzidos de butirato, sugerindo que diferentes modelos de camundongos com disfunção mitocondrial compartilham a geração insuficiente de butirato. A transferência de microbiota de camundongos controle saudáveis ou a administração de tributirina, um precursor do butirato, retardam múltiplos sinais de multimorbidade, prolongando a vida útil em camundongos iTfamKO. Mecanisticamente, a suplementação com butirato recupera marcas epigenéticas de acilação de histonas que são perdidas no intestino de camundongos com deficiência de Tfam. No geral, nossos achados destacam a relevância de preservar a simbiose hospedeiro-microbiota em distúrbios relacionados à disfunção mitocondrial.
Aqui, os autores mostram que estratégias para restaurar a simbiose hospedeiro-microbiota, preservando os níveis de butirato, retardam a multimorbidade e prolongam a vida útil em camundongos com disfunção mitocondrial, em associação com remodelação epigenética no intestino.
Mitocôndrias são organelas altamente dinâmicas que servem como centros bioenergéticos e de sinalização em células eucarióticas, sustentando funções relevantes como o manuseio de cálcio, regulação da apoptose e estresse oxidativo, biossíntese lipídica e, mais importante, produção do principal combustível celular — ATP. Uma das peculiaridades das mitocôndrias é que essas organelas abrigam seu próprio genoma, o DNA mitocondrial (mtDNA), que codifica 13 subunidades da cadeia transportadora de elétrons que sustenta a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para a produção de ATP. A replicação, transcrição e manutenção do mtDNA são controladas pelo fator de transcrição mitocondrial codificado pelo núcleo (TFAM). O TFAM é essencial para a OXPHOS e a biogênese mitocondrial, e a deficiência germinativa de TFAM é letal embrionariamente. Portanto, a geração de modelos de camundongos knockout específicos de tecido tem ilustrado ainda mais a importância das mitocôndrias em diferentes tipos celulares. Consistentemente, defeitos que afetam a função mitocondrial precipitam o desenvolvimento de doenças mitocondriais, um grupo de distúrbios metabólicos hereditários que apresentam manifestações musculares, cardiovasculares, metabólicas e neurológicas graves. Embora diretrizes estejam disponíveis na clínica para gerenciar sintomas e complicações da doença mitocondrial, opções terapêuticas limitadas ainda estão disponíveis.
O intestino é uma barreira biológica regulada por uma camada de células epiteliais intimamente aderidas que secreta muco e peptídeos antimicrobianos. Importante, o colapso dessa barreira está associado ao aumento da morbidade e mortalidade em diferentes espécies. Além do fornecimento de energia, o metabolismo mitocondrial desempenha um papel importante na homeostase intestinal, uma vez que coordena a auto-renovação e diferenciação das células-tronco intestinais, programas de morte celular, contratilidade das células musculares lisas e a biodisponibilidade de oxigênio no lúmen. Consequentemente, pacientes que vivem com distúrbios mitocondriais geralmente sofrem de atrofia mucosa crônica e dismotilidade gastrointestinal com esvaziamento retardado, resultando em constipação grave. Além disso, o intestino abriga um ecossistema altamente diverso de microrganismos, a microbiota intestinal, que vive em simbiose com o hospedeiro, fornecendo vias metabólicas essenciais. Entre outros, os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) sintetizados por bactérias intestinais, como acetato, propionato e butirato, fortalecem a barreira intestinal e moldam a fisiologia do hospedeiro. Mecanisticamente, os AGCCs podem desencadear cascatas de sinalização extracelular e intracelular, bem como remodelar o panorama epigenético, ajustando assim a imunidade, o metabolismo e a expressão gênica no hospedeiro. Recentemente, pesquisas mostraram que o butirato derivado da microbiota regula a expressão gênica no intestino de camundongos ao controlar os níveis de butirilação da histona H3. Dados seus efeitos pleiotrópicos, a manipulação dos AGCCs tem sido proposta como uma opção terapêutica para uma infinidade de doenças inflamatórias, cardiometabólicas e neurológicas. Embora esses resultados pareçam encorajadores, a eficácia dos AGCCs em modelos de doença mitocondrial que apresentam falência multiorgânica sistêmica permanece incerta.
Neste trabalho, exploramos essa linha de intervenção em um novo modelo de camundongo de disfunção mitocondrial por deleção induzível e ubíqua de TFAM, que espelha a multimorbidade associada às doenças mitocondriais.
Resultados
Deleção de TFAM em camundongos adultos induz falência sistêmica de órgãos
A Imagem representativa de camundongos controle e iTfamKO. B Curvas de sobrevivência de Kaplan–Meier (n = 7 para controle, n = 16 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001). C Avaliação longitudinal do peso corporal relativo após administração de tamoxifeno (n = 17 para controle, n = 15 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001). D Secções representativas coradas com hematoxilina e eosina (H&E) do tecido adiposo branco gonadal e quantificação da área de superfície dos adipócitos (n = 4 para controle, n = 4 para iTfamKO, *P = 0,0221). Barra de escala: 50 μm. E Testes de tolerância à glicose e suas respectivas áreas sob a curva (AUC) (n = 6 para controle, n = 6 para iTfamKO, **P = 0,0036 para t = 15 min, **P = 0,0094 para t = 30 min, ****P ≤ 0,0001 para t = 60 min, **P = 0,0081 para t = 90 min, **P = 0,0044 para t = 120 min, ****P ≤ 0,0001 para AUC). F Secções representativas do parênquima pulmonar coradas com Sirius Red. Barra de escala: 100 μm. G Quantificação do peso pulmonar normalizado pelo comprimento da tíbia (n = 5 para controle, n = 4 para iTfamKO, *P = 0,0217). H Secções representativas da aorta coradas com van Gieson elástico (EVG) e quantificação de rupturas de elastina (n = 5 para controle, n = 4 para iTfamKO, *P = 0,0132). Barra de escala: 50 μm. I Secções representativas de músculo esquelético coradas com H&E e quantificação da área de secção transversal das miofibras (n = 4 para controle, n = 4 para iTfamKO, **P = 0,0041). Barra de escala: 50 μm. J Níveis relativos de mRNA dos genes associados a doenças mitocondriais Gdf15 e Mthfd2 no músculo esquelético (n = 5 para controle, n = 4 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001 para Gdf15, **P = 0,0018 para Mthfd2). K Teste de força de preensão do membro anterior (n = 12 para controle, n = 12 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001). L Desempenho no teste de Rotarod (n = 21 para controle, n = 19 para iTfamKO, *P = 0,0121 para tentativa 2, *P = 0,0191 para tentativa 3, *P = 0,021 para tentativa 4). M Desempenho no teste de campo aberto (n = 14 para controle, n = 7 para iTfamKO, ***P = 0,0008 para distância, ***P = 0,0004 para velocidade de exploração, ***P = 0,0005 para tempo imóvel). N Imagem representativa e quantificação de partículas de lipofuscina em neurônios cerebrais (n = 4 para controle, n = 4 para iTfamKO, *P = 0,0286). Barra de escala: 20 μm. O Secções representativas do parênquima renal coradas com H&E e quantificação da área glomerular e tubular (n = 6 para controle, n = 5 para iTfamKO, *P = 0,0329 para área tubular, ****P ≤ 0,0001 para área glomerular). Barra de escala: (secções renais inteiras) 2,5 mm, (glomérulos) 50 μm. P Gel representativo corado com Coomassie de amostras de urina.
Quantificação de Q e R: (Q) baço (n = 5 para controle, n = 4 para iTfamKO, *P = 0,0211) e (R) peso do timo normalizado pelo comprimento da tíbia (n = 6 para controle, n = 5 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001). S Concentração de hemoglobina (n = 18 para controle, n = 14 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001). T Relação neutrófilo-linfócito (NLR) no sangue (n = 17 para controle, n = 13 para iTfamKO, **P = 0,0015). Todos os experimentos foram realizados 90 dias após a injeção de tamoxifeno. Os dados são apresentados como média ± EPM, onde cada ponto representa uma amostra biológica. Os valores de P foram determinados por B teste de log-rank (Mantel–Cox), C análise de variância (ANOVA) de duas vias, D, G–K, M–O e Q–S teste t de Student bicaudal não pareado, L análise de efeitos mistos com teste de comparações múltiplas de Šidák, ou T teste U de Mann–Whitney bicaudal.
Os valores de P foram determinados por ANOVA de duas vias (curva) com teste de comparações múltiplas de Šidák ou (AUC) teste t de Student bicaudal não pareado. Os dados de origem e os valores de P para dados não significativos são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Para induzir o declínio mitocondrial em camundongos adultos, cruzamos camundongos portadores de alelos flanqueados por loxP do gene que codifica TFAM (Tfamfl/fl) com camundongos que expressam uma recombinase Cre-ERT2 induzível por tamoxifeno sob o controle do gene Ubc ubíquo (UbcCre-ERT2) para gerar camundongos Tfamfl/flUbcCre-ERT2. Este sistema permitiu o knockdown sistêmico e induzível do gene Tfam em camundongos adultos (Fig. S1A), evitando a letalidade embrionária relatada da deleção germinativa de TFAM. Consistentemente, observamos uma queda notável nos níveis de transcritos de Tfam em uma miríade de tecidos após a administração de tamoxifeno (Fig. S1B). Com o tempo, camundongos adultos Tfamfl/flUbcCre/ERT2+/– (doravante camundongos iTfamKO) manifestaram um fenótipo progeroide a partir de 70 a 90 dias após a administração de tamoxifeno, com uma vida útil encurtada em comparação com companheiros de ninhada controle pareados por idade (Fig. 1A, B).
Além disso, 90 dias após a administração de tamoxifeno, esses camundongos desenvolveram uma síndrome de morbidade multissistêmica que engloba uma perda acentuada de peso corporal e lipodistrofia, mostrando uma redução aguda dos tecidos adiposos branco e marrom, bem como adipócitos menores (Fig. 1C, D e Fig. S1C, D). Isso foi acompanhado por temperatura corporal diminuída (Fig. S1E) e sinais de intolerância à glicose (Fig. 1E). Os camundongos iTfamKO também manifestaram hipogonadismo, ou seja, um tamanho reduzido de ambos os testículos em machos e ovários em fêmeas (Fig. S1F). Em relação ao sistema cardiopulmonar, os camundongos iTfamKO apresentaram fibrose pulmonar grave (Fig. 1F) com aumento do peso pulmonar, sugerindo congestão pulmonar ou edema pulmonar (Fig. 1G). A avaliação histológica das aortas revelou um aumento nas dissecções da elastina (Fig. 1H), em linha com trabalhos anteriores de deleção específica de células musculares lisas de Tfam. Além disso, a análise do músculo esquelético em camundongos iTfamKO descobriu um diâmetro menor das fibras musculares e aumento da expressão do fator de diferenciação de crescimento 15 (Gdf15) e da metileno tetrahidrofolato desidrogenase 2 (Mthfd2), biomarcadores de doença mitocondrial que, juntamente com uma menor força de preensão, sugeriam sarcopenia grave (Fig. 1I-K). Os camundongos iTfamKO também exibiram sinais de incapacidade neurológica, como coordenação locomotora e atividade prejudicadas nos testes de rotarod e campo aberto (Fig. 1L, M e Fig. S1G), bem como desempenho reduzido no teste de construção de ninho (Fig. S1H). Além disso, o cérebro dos camundongos iTfamKO era menor (Fig. S1I) e abrigava marcadores de neurodegeneração, como aumento dos agregados neuronais de lipofuscina (Fig. 1N), níveis reduzidos do marcador pós-sináptico PSD-95 e níveis aumentados de Tau fosforilada, como consequência da depleção bem-sucedida de Tfam no cérebro (Fig. S1J, K).
Importante, camundongos iTfamKO apresentaram insuficiência renal com rins anormalmente aumentados, apresentando sinais de glomeruloesclerose e dilatação dos túbulos renais (Fig. 1O), o que foi associado a poliúria e urina extremamente clara, comumente encontrada em condições diabéticas, bem como albuminúria (Fig. 1P e Fig. S1L). Além disso, observamos que camundongos iTfamKO apresentaram níveis elevados de interleucina (IL)-6 e fator de necrose tumoral (TNF) no soro (Fig. S1M). Da mesma forma, o fígado de camundongos iTfamKO mostrou expressão aumentada de marcadores pró-inflamatórios como IL-6 e TNF e regulação negativa de moléculas anti-inflamatórias como IL-10, juntamente com forte expressão de genes pró-fibróticos como Serpin-1, Ccn2 e Spp1 (Fig. S1N). Vale notar que isso foi acompanhado pelo aumento da expressão dos marcadores de senescência Cdkn2a e Cdkn1a, que codificam respectivamente os inibidores de quinase dependentes de ciclina P16INK4a e P21Waf/Cip1, no fígado de camundongos iTfamKO (Fig. S1N).
Por último, o baço e o timo de camundongos iTfamKO mostraram uma atrofia substancial (Fig. 1Q, R), indicativa de alterações no sistema hematopoiético. Consequentemente, a análise hematológica de camundongos iTfamKO revelou níveis diminuídos de parâmetros relacionados ao número e função dos eritrócitos (Fig. S2A), destacando um perfil de anemia grave (Fig. 1S). Também observamos trombocitose e variações nos leucócitos, incluindo linfopenia e neutrofilia, levando a uma razão neutrófilo-linfócito (NLR) elevada, um parâmetro que prediz baixa sobrevida em múltiplas doenças, em camundongos iTfamKO em comparação com os controles (Fig. 1T e Fig. S2B, C).
Esses dados demonstram que a ablação sistêmica de Tfam em camundongos adultos leva à falência orgânica sistêmica, incluindo sarcopenia, alterações cardiometabólicas, anemia, insuficiência renal e neurodegeneração, concomitante com a indução de um programa pró-inflamatório e senescente em vários tecidos.
A integridade da barreira intestinal é interrompida em camundongos iTfamKO
Camundongos iTfamKO apresentam ruptura da barreira intestinal e sinais de constipação grave.
A Imagens representativas de microscopia eletrônica do epitélio do íleo e do cólon em camundongos controle e iTfamKO. Barra de escala: 1 μm. B Quantificação da área mitocondrial (n = 4 para controle, n = 6 para iTfamKO, **P = 0,0159 para cólon) e do número de corpos de inclusão eletrodensos por mitocôndria no epitélio do íleo e do cólon (n = 4 para controle, n = 6 para iTfamKO, *P = 0,0367 para íleo, **P = 0,0056 para cólon). C Quantificação da dimensão das criptas no íleo (n = 5 para controle, n = 4 para iTfamKO, ***P = 0,0002) e no cólon (n = 5 para controle, n = 5 para iTfamKO, *P = 0,0281). Barra de escala: (íleo) 125 μm, (cólon) 50 μm. D Cortes representativos corados com ácido periódico-Schiff (PAS) e quantificação da área corada no íleo (n = 6 para controle, n = 5 para iTfamKO, *P = 0,026) e no cólon (n = 6 para controle, n = 7 para iTfamKO, ***P = 0,0006). Barra de escala: 50 μm. E Imagem representativa e quantificação da porcentagem de células caliciformes secretoras no íleo (n = 6 para controle, n = 4 para iTfamKO, *P = 0,0182). Barra de escala: 10 μm. F Quantificação da espessura da camada de muco no cólon (n = 6 para controle, n = 7 para iTfamKO, ***P = 0,0004). G Mapa de calor representando valores normalizados dos níveis de expressão de genes associados a junções oclusivas (Cldn1, Ocln, Tjp1), peptídeos antimicrobianos (Defa5, Defensin, Crypt1, Lyz1, Ang4, Reg3g) e função de barreira (Tff3) no íleo avaliados por qPCR (n = 6 para controle, n = 10 para iTfamKO, *P = 0,0424 para Cldn1, *P = 0,0262 para Ocln, *P = 0,0283 para Defa5, *P = 0,0378 para Defensin, ***P = 0,0008 para Crypt1, *P = 0,0181 para Lyz1, *P = 0,0141 para Ang4, ****P ≤ 0,0001 para Reg3g e Tff3). H Concentração de FITC-dextrano no soro (n = 10 para controle, n = 12 para iTfamKO, **P = 0,0093). I Níveis de proteína de ligação a LPS (LBP) no soro (n = 6 para controle, n = 5 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001). J Quantificação do número de fezes defecadas durante a noite (n = 6 para controle, n = 8 para iTfamKO, **P = 0,0015). K Porcentagem de água nas fezes (n = 9 para controle, n = 9 para iTfamKO, **P = 0,0071). Todos os experimentos foram realizados 90 dias após a injeção de tamoxifeno. Os dados são apresentados como médias ± EPM, onde cada ponto é uma amostra biológica. Os valores de P foram determinados pelo teste t de Student bicaudal não pareado de B a K. Os dados de origem e os valores de P para dados não significativos são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Considerando a importância da aptidão mitocondrial na manutenção da integridade da barreira intestinal, cuja ruptura está associada a uma infinidade de condições patológicas, buscamos investigar o estado do intestino delgado e grosso em camundongos iTfamKO adultos. Confirmamos que a expressão de Tfam tanto no íleo quanto no cólon estava notavelmente diminuída 90 dias após a indução da expressão da recombinase Cre (Fig. S3A). De acordo, a análise por microscopia eletrônica revelou que as mitocôndrias no íleo e no cólon de camundongos iTfamKO eram menores e apresentavam um aumento notável em corpos de inclusão eletrodensos (Fig. 2A, B), compatíveis com agregados anormais de fosfato de cálcio previamente relatados devido ao manuseio defeituoso de cálcio. O exame macroscópico desses órgãos revelou um aumento significativo no comprimento do intestino delgado, mas não no cólon, em camundongos iTfamKO em comparação com os controles (Fig. S3B). Além disso, a avaliação histológica do íleo e do cólon mostrou uma arquitetura tecidual alterada com criptas notavelmente menores (Fig. 2C). Essas alterações foram concomitantes com um número reduzido de células proliferativas Ki67+ nas criptas (Fig. S3C, D) e expressão aumentada do marcador de senescência P21Waf/Cip1 no íleo de camundongos iTfamKO em comparação com camundongos controle da mesma ninhada (Fig. S3E).
Um componente crucial da barreira intestinal é a camada de muco fornecida pelas células caliciformes, que impede que as bactérias luminais façam contato direto com o epitélio, ao mesmo tempo que serve como habitat para simbiontes comensais. Embora o número de células caliciformes permaneça inalterado (Fig. S3F), o conteúdo de mucopolissacarídeos dentro dessas células estava notavelmente aumentado tanto no íleo quanto no cólon de camundongos iTfamKO (Fig. 2D e Fig. S3G, H). Isso foi acompanhado por uma porcentagem reduzida de células caliciformes secretando muco no lúmen intestinal (Fig. 2E e Fig. S3I) e, consequentemente, uma camada de muco notavelmente mais fina (Fig. 2F e Fig. S3J), sugerindo uma secreção defeituosa de muco mediada por células caliciformes neste modelo de camundongo. Para avaliar melhor a integridade física da barreira intestinal, examinamos a expressão de genes que codificam proteínas envolvidas nas junções estreitas (Cldn1, Ocln e Tjp1), peptídeos antimicrobianos (Defa5, Defensin, Crypt1, Lyz1, Ang4 e Reg3g) e participando da regeneração da mucosa (Tff3), que mostraram uma regulação negativa geral no íleo, mas não no cólon, de camundongos iTfamKO em comparação com os controles (Fig. 2G e Fig. S3K). Isso se traduziu em aumento da permeabilidade intestinal e translocação de bactérias para a periferia em camundongos iTfamKO, conforme confirmado pelo aumento da penetração de FITC-dextrana após administração oral e níveis elevados de proteína de ligação a LPS (LBP) no soro, um marcador substituto de translocação bacteriana (Fig. 2H, I).
Não observamos quaisquer traços de colite, como cólon encurtado ou sangue nas fezes, no estado estacionário em camundongos iTfamKO. Em vez disso, esses camundongos exibiram sinais marcantes de constipação, demonstrados por uma diminuição na frequência de amostras fecais defecadas (Fig. 2J), juntamente com um peso substancialmente reduzido e percentual de teor de água nas fezes (Fig. 2K e Fig. S3L), sugerindo defeitos no peristaltismo intestinal e na absorção de água.
A deficiência sistêmica de Tfam leva à disbiose bacteriana e à redução dos níveis de SCFA
A deficiência sistêmica de Tfam leva à disbiose bacteriana e à redução da produção de SCFA.
Os parâmetros do índice de Shannon e do índice de espécies observadas (Sobs) de α-diversidade no (A) íleo (n = 9 para controle, n = 8 para iTfamKO, *P = 0,0365 para índice de Shannon, **P = 0,0089 para Sobs) e (B) microbiota residente no cólon (n = 9 para controle, n = 8 para iTfamKO) de camundongos controle e iTfamKO. Gráficos de escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) dos valores de β-diversidade (índices θYC) em (C) o íleo (n = 9 para controle, n = 8 para iTfamKO) e (D) microbiota residente no cólon (n = 9 para controle, n = 7 para iTfamKO, **P = 0,0074). E Esquerda: unidades taxonômicas operacionais (OTUs) diferencialmente abundantes representadas com valores de análise discriminante linear (LDA) de tamanho do efeito discriminante linear (LEfSe, P < 0,05; FDR, Q < 0,05; |SNR| > 0,5; |LDA| > 2; |fold change| > 10; abundância máxima > 0,001) comparando a microbiota ileal e colônica em camundongos controle versus iTfamKO. Direita: mapa de calor representando os valores de abundância. Quantificação de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) nas (F) fezes (n = 9 para controle, n = 9 para iTfamKO, ****P ≤ 0,0001 para SCFA total, ***P = 0,0006 para acetato, ***P = 0,0002 para propionato, ***P = 0,0004 para butirato, ****P ≤ 0,0001 para isobutirato, ***P = 0,0003 para 2-metilbutirato, **P = 0,0013 para valerato, ***P = 0,0007 para isovalerato) e G o soro (n = 8 para controle, n = 8 para iTfamKO, **P = 0,0092 para SCFA total, ***P = 0,0006 para butirato, *P = 0,0236 para isobutirato, *P = 0,0184 para valerato, *P = 0,0486 para isovalerato). Todos os experimentos foram realizados 90 dias após a injeção de tamoxifeno. Os dados são apresentados como médias ± EPM, onde cada ponto é uma amostra biológica. Os gráficos de caixa e bigodes representam o intervalo interquartil entre o primeiro e o terceiro quartis (percentis 25 e 75, respectivamente), a mediana e os valores máximo e mínimo. Os valores de P foram determinados por A, B, F e G teste t de Student bicaudal não pareado, C e D análise de variância multivariada permutacional (PERMANOVA), ou E LEfSe. Os dados de origem e os valores de P para dados não significativos são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Perturbações metabólicas no intestino estão associadas a mudanças patogênicas na microbiota intestinal. Para caracterizar a composição das comunidades bacterianas no intestino de camundongos iTfamKO, realizamos o sequenciamento do gene 16S rRNA em amostras do íleo terminal e do cólon desses camundongos 90 após a administração de tamoxifeno. As análises de α-diversidade indicaram uma redução em parâmetros como os índices de Shannon e espécies observadas (Sobs) na microbiota ileal, mas não na colônica (Fig. 3A, B). Além disso, as análises de β-diversidade por escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) indicaram uma configuração notavelmente distinta da microbiota intestinal no cólon dos camundongos iTfamKO em comparação com os controles da mesma ninhada (Fig. 3C, D). A análise composicional em ambos os compartimentos intestinais sugeriu uma redução acentuada em bactérias pertencentes à ordem Clostridiales, como as famílias Lachnospiraceae e Ruminococcaceae, no microbioma ileal e colônico dos camundongos iTfamKO em comparação com os controles (Fig. 3E). Essas alterações foram acompanhadas por uma expansão de bactérias da ordem Bacillales, incluindo membros da família Staphylococcaceae, tanto no íleo quanto no cólon deste modelo murino (Fig. 3E).
Para aprofundar os dados metagenômicos do 16S rRNA, realizamos uma análise funcional preditiva do microbioma intestinal. Notavelmente, os perfis de sequenciamento da microbiota residente no íleo revelaram uma redução nas vias bioquímicas relacionadas à degradação de carboidratos, por exemplo, fucose, D-glucarato e ramnose em camundongos iTfamKO (Fig. S4). A utilização de polissacarídeos pela microbiota intestinal leva à produção equilibrada de metabólitos promotores de saúde, como os SCFAs. Para examinar se as alterações composicionais e metabólicas observadas na microbiota intestinal impactavam a produção de SCFAs, quantificamos essas espécies moleculares em amostras fecais e séricas de camundongos usando cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS). Notavelmente, observamos uma redução significativa na concentração de SCFAs totais, bem como em cada um deles (isto é, acetato, propionato, butirato, isobutirato, 2-metilbutirato, valerato e isovalerato) nas fezes desses camundongos (Fig. 3F). Isso se correlacionou com a diminuição da maioria dos SCFAs nos conteúdos cecal e colônico, mas não no ileal (Fig. S5A). Corroborando que essas alterações também ocorrem sistemicamente, observamos uma redução significativa dos SCFAs totais e da maioria das espécies individuais de SCFAs, com exceção do acetato e propionato, no soro dos camundongos iTfamKO em comparação com os controles da mesma ninhada (Fig. 3G).
Na tentativa de esclarecer quais bactérias poderiam estar envolvidas nessa queda de AGCCs, realizamos análises de correlação de Spearman entre a microbiota residente no íleo e cólon e a concentração de espécies de AGCC nas mesmas amostras. Focando nas unidades taxonômicas operacionais (UTOs) que diminuíram na microbiota intestinal de camundongos iTfamKO, os resultados revelaram dez UTOs que se correlacionaram positivamente com os níveis reduzidos dessas moléculas (Fig. S5B). Entre elas, encontramos membros pertencentes às famílias Ruminococcaceae e Lachnospiraceae, que representam bactérias produtoras de AGCC cruciais na microbiota intestinal.
Em conjunto, nossos achados sugerem que a deleção de Tfam leva a alterações mitocondriais no intestino, resultando na ruptura da barreira intestinal, dismotilidade intestinal e disbiose bacteriana associada a uma redução acentuada na produção de AGCC.
Camundongos mutadores de mtDNA apresentam disbiose intestinal e níveis reduzidos de butirato
Camundongos mutadores de mtDNA mostram disbiose bacteriana e níveis reduzidos de butirato
A Scheme of 50-week-old Polgwt and Polgmut mice. B Levels of LPS-binding protein (LBP) in the serum (n = 5 for Polgwt, n = 4 for Polgmut, ****P ≤ 0.0001). C Heatmap depicting normalized values of expression levels of genes associated with tight junctions (Cldn1, Ocln, Tjp1), antimicrobial peptides (Defa5, Defensin, Crypt1, Lyz1, Ang4, Reg3g), and barrier function (Tff3) in the ileum (n = 7 for Polgwt, n = 4 for Polgmut, **P = 0.0095 for Defa5, **P = 0.0095 for Defensin, *P = 0.05 for Crypt1, **P = 0.0095 for Ang4) and the colon (n = 7 for Polgwt, n = 4 for Polgmut, ****P ≤ 0.0001 for Ocln, *P = 0.0324 for Tjp1) assessed by qPCR. D Shannon index and Shannon evenness parameters of α-diversity in fecal microbiota (n = 7 for Polgwt, n = 11 for Polgmut, *P = 0.0262 for Shannon index, **P = 0.0077 for Shannon evenness). E Non-metric multidimensional scaling (NMDS) plots of β-diversity values (θYC indexes) in fecal microbiota (n = 7 for Polgwt, n = 12 for Polgmut, ***P = 0.0001). F Quantification of short-chain fatty acid species in the feces (n = 9 for Polgwt, n = 10 for Polgmut, *P = 0.0266 for butyrate). G Left: differentially abundant operational taxonomic units (OTUs) depicted with linear discriminant analysis (LDA) values of linear discriminant effect size (LEfSe, P < 0.05; FDR, Q < 0.05; |SNR| > 0.5; |LDA| > 1; |fold change| > 5; maximal abundance > 0.001) comparing fecal microbiota in Polgwt versus Polgmut mice. Right: heatmap depicting abundance values. H Heatmap depicting Spearman’s rank correlation coefficients between differentially abundant OTUs and the concentration of butyrate in the feces. Data are shown as means ± SEM, where each dot is a biological sample. Box-and-whisker plots represent the interquartile range between the first and third quartiles (25th and 75th percentiles, respectively), the median, and the maximal and minimal values. P-values were determined by B–D, and F unpaired two-tailed Student’s t-test, E permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA), G LEfSe, or H using the OTU association command of mothur (v.1.40.5) software package. Source data and P-values for non-significant data are provided as a Source Data file.
We wondered whether another mouse model of mitochondrial deficiency showing premature multimorbidity also exhibited alterations in intestinal barrier integrity and gut microbiota composition. For that, we examined PolgAD257A/D257A (Polgmut) or mtDNA-mutator mice that carry a deficient proof-reading version of the gene encoding the mtDNA polymerase gamma, therefore leading to a progressive accumulation of somatic mutations in the mtDNA that trigger premature multimorbidity. We analyzed Polgmut mice at 50 weeks of age, once they show signs of multimorbidity, compared with age-matched control mice (Fig. 4A).
Notavelmente, camundongos Polgmut apresentaram disfunção da barreira intestinal com níveis 2 vezes maiores de LBP no soro em comparação com os irmãos controle (Fig. 4B). Isso foi acompanhado pela expressão reduzida de genes que codificam peptídeos antimicrobianos, como Defa5, Defensin, Crypt e Ang4 no íleo, e expressão reduzida de genes participantes da arquitetura de junções estreitas como Ocln e Tjp1 no cólon de camundongos Polgmut em comparação com os controles (Fig. 4C). Análises da microbiota fecal nesses camundongos revelaram uma redução marcante nos parâmetros de α-diversidade, como o índice de Shannon e a uniformidade de Shannon em camundongos Polgmut (Fig. 4D), sugerindo perda de espécies bacterianas nesse modelo de camundongo. Além disso, análises de β-diversidade por NMDS demonstraram uma configuração substancialmente diferente da microbiota fecal (Fig. 4E). Semelhante ao observado em camundongos iTfamKO, a quantificação por LC-MS das espécies de AGCC nas fezes de camundongos Polgmut revelou níveis reduzidos de butirato nesses camundongos quando comparados aos camundongos controle (Fig. 4F). Notavelmente, a análise funcional preditiva dos dados metagenômicos do 16S rRNA mostrou regulação negativa das vias bioquímicas relacionadas à utilização de carboidratos (Fig. S6). Além disso, a avaliação das vias metabólicas preditivas compartilhadas por camundongos iTfamKO e Polgmut mostrou regulação negativa nas vias ligadas à degradação de compostos aromáticos (Fig. S7), que são normalmente metabolizados em acetil-coenzima A (acetil-CoA) — um substrato para a biossíntese de butirato nas bactérias intestinais.
A avaliação da abundância relativa de bactérias nas fezes desses camundongos mostrou uma redução geral em bactérias pertencentes à ordem Clostridiales, como as famílias Lachnospiraceae e Ruminococcaceae, e pertencentes a Bacteroidales, incluindo a família Porphyromonadaceae. Encontramos uma expansão anormal de Bacteroidaceae e alguns membros de Enterobacteriaceae em camundongos Polgmut em comparação com os irmãos controle (Fig. 4G). A análise de correlação de Spearman entre OTUs diferencialmente abundantes e níveis de butirato revelou sete OTUs que estavam diminuídas nesses camundongos mutantes e correlacionadas positivamente com os níveis reduzidos de butirato. Essas OTUs correspondiam a membros bem conhecidos produtores de butirato das famílias Lachnospiraceae, Ruminococcaceae e Porphyromonadaceae (Fig. 4H).
Assim, nossos achados revelam que um modelo alternativo de multimorbidade devido à disfunção mitocondrial manifesta ruptura da integridade da barreira intestinal, bem como disbiose intestinal, caracterizada pela perda de táxons produtores de butirato.
A suplementação de butirato melhora a falência orgânica sistêmica, estendendo a saúde e a vida útil em camundongos iTfamKO
A Desenho experimental de ensaios de transplante de microbiota fecal (FMT) de camundongos doadores controle ou iTfamKO para camundongos receptores iTfamKO (camundongos iTfamKO FMTControl ou iTfamKO FMTKO, respectivamente). B Avaliação longitudinal do peso corporal em relação à administração de tamoxifeno (n = 19 para controle, n = 21 para FMTKO, n = 23 para FMTControl, ****P ≤ 0.0001 para controle versus FMTKO e controle versus FMTControl, **P = 0.0051 para FMTKO versus FMTControl). C Análise de força de preensão dos membros anteriores (n = 11 para controle, n = 9 para FMTKO, n = 10 para FMTControl, ****P ≤ 0.0001). D Níveis de proteína ligante de LPS (LBP) no soro (n = 5 para controle, n = 6 para FMTKO, n = 6 para FMTControl, *P = 0.0156 para controle versus FMTKO, **P = 0.0029 para controle versus FMTControl). E Percentual de água nas fezes (n = 10 para controle, n = 6 para FMTKO, n = 7 para FMTControl, **P = 0.0011 para controle versus FMTKO, **P = 0.0041 para FMTKO versus FMTControl). F Quantificação das espécies de ácidos graxos de cadeia curta nas fezes (n = 8 para controle, n = 9 para FMTKO, n = 9 para FMTControl; acetato: *P = 0.0296 para controle versus FMTKO, **P = 0.0035 para controle versus FMTControl; butirato: *P = 0.0238 para controle versus FMTKO, *P = 0.0176 para FMTKO versus FMTControl; *P = 0.0118 para isobutirato; **P = 0.0012 para 2-metilbutirato; *P = 0.0229 para valerato; *P = 0.0266 para isovalerato). G Curvas de sobrevivência de Kaplan–Meier (n = 9 para controle, n = 12 para FMTKO, n = 19 para FMTControl, *P = 0.0133 para FMTKO versus FMTControl). Os dados são apresentados como médias ± EPM, onde cada ponto representa uma amostra biológica. Os valores de P foram determinados por B análise de variância (ANOVA) de duas vias com teste de comparações múltiplas de Tukey, C–F ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Tukey, ou G teste log-rank (Mantel–Cox). Os dados de origem e valores de P para dados não significativos são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Considerando a disbiose intestinal encontrada em camundongos iTfamKO, investigamos a contribuição da microbiota intestinal para o fenótipo de multimorbidade desses camundongos. Assim, desenhamos uma estratégia para substituir a microbiota intestinal por meio de ensaios de transplante de microbiota fecal (FMT). Resumidamente, transferimos microbiota fecal de camundongos doadores controle ou iTfamKO para camundongos receptores iTfamKO (denominados iTfamKO FMTControle e iTfamKO FMTKO, respectivamente) começando 30 dias após a administração de tamoxifeno (Fig. 5A). Camundongos iTfamKO FMTControle apresentaram perda de peso corporal ligeiramente tardia e aumento da força muscular quando comparados aos camundongos iTfamKO FMTKO (Fig. 5B, C), sem alterações nos níveis de LBP (Fig. 5D). Além disso, o teor de água nas fezes foi recuperado para os níveis dos camundongos controle nos camundongos iTfamKO FMTControle (Fig. 5E), sugerindo melhora nos sinais de constipação. Além disso, descobrimos que os níveis de alguns Ácidos Graxos de Cadeia Curta (AGCCs), como butirato e, em menor grau, isobutirato, 2-metilbutirato e isovalerato, foram restaurados em camundongos iTfamKO que receberam microbiota de camundongos controle saudáveis (Fig. 5F). Notavelmente, isso foi associado a uma extensão na vida máxima em 70% (de 115 para 196 dias) em camundongos iTfamKO FMTControle em comparação com camundongos iTfamKO FMTKO (Fig. 5G).
A suplementação com tributirina prolonga a saúde e a vida em camundongos iTfamKO.
A Delineamento experimental de camundongos controle e iTfamKO alimentados com dieta padrão (SD) ou dieta suplementada com 10% de tributirina (TB).
B Quantificação de butirato nas fezes (n = 10 para controle SD, n = 3 para controle TB, n = 9 para iTfamKO SD, n = 8 para iTfamKO TB, ***P = 0,0005 para controle SD versus iTfamKO SD, *P = 0,04 para iTfamKO SD versus controle TB).
C Avaliação longitudinal do peso corporal em relação à administração de tamoxifeno (n = 19 para controle SD, n = 5 para controle TB, n = 21 para iTfamKO SD, n = 19 para iTfamKO TB, ****P ≤ 0,0001 para controle SD versus iTfamKO SD e controle SD versus iTfamKO TB, *P = 0,03 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB).
D Análise da força de preensão dos membros anteriores (n = 18 para controle SD, n = 5 para controle TB, n = 20 para iTfamKO SD, n = 17 para iTfamKO TB, ****P ≤ 0,0001 para controle SD versus iTfamKO SD, iTfamKO SD versus iTfamKO TB e iTfamKO SD versus controle TB, ***P = 0,0007 para controle SD versus iTfamKO TB).
E Níveis relativos de mRNA dos genes associados a doenças mitocondriais Gdf15 e Mthfd2 no músculo esquelético (n = 5 para controle SD, n = 6 para iTfamKO SD, n = 5 para iTfamKO TB; Gdf15: **P = 0,0036 para controle SD versus iTfamKO SD; Mthfd2: **P = 0,0029 para controle SD versus iTfamKO SD).
F Teste de tolerância à glicose e sua respectiva quantificação da área sob a curva (AUC) (n = 13 para controle SD, n = 5 para controle TB, n = 12 para iTfamKO SD, n = 9 para iTfamKO TB; AUC: ***P = 0,0009 para controle SD versus iTfamKO SD, *P = 0,0199 para controle TB versus iTfamKO SD, *P = 0,0205 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB).
G Quantificação dos níveis de glicemia de jejum (n = 13 para controle SD, n = 5 para controle TB, n = 12 para iTfamKO SD, n = 9 para iTfamKO TB, ****P ≤ 0,0001 para controle SD versus iTfamKO SD, controle TB versus iTfamKO SD e iTfamKO SD versus iTfamKO TB, *P = 0,0262 para controle TB versus iTfamKO TB).
H Gel representativo corado com Coomassie e quantificação de amostras de urina (n = 10 para controle SD, n = 9 para iTfamKO SD, n = 8 para iTfamKO TB, ****P ≤ 0,0001 para controle SD versus iTfamKO SD e controle SD versus iTfamKO TB, **P = 0,005 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB).
I Curvas de sobrevivência de Kaplan–Meier (n = 10 para controle SD, n = 5 para controle TB, n = 9 para iTfamKO SD, n = 8 para iTfamKO TB, **P = 0,0046 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB).
Os dados são apresentados como médias ± EPM, onde cada ponto representa uma amostra biológica.
Os valores de P foram determinados por B e E teste de Kruskal–Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn; C análise de efeitos mistos com teste de comparações múltiplas de Šidák; D, G e H análise de variância (ANOVA) de uma via com teste de comparações múltiplas de Tukey; ou I teste log-rank (Mantel–Cox).
F Os valores de P foram determinados por (curva) ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Tukey ou (AUC) ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Tukey. Os dados de origem e os valores de P para dados não significativos são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Uma vez que o FMT de camundongos controle saudáveis resgatou os níveis de butirato em camundongos receptores iTfamKO, o que está associado à melhora na saúde e na mortalidade, exploramos ainda mais o potencial terapêutico de restaurar os níveis de butirato neste modelo de camundongo. Para esse propósito, camundongos iTfamKO foram alimentados com uma dieta suplementada com 10% de tributirina (TB), um precursor do butirato na forma de um éster triacilglicerol de ácidos butíricos, iniciando 30 dias após a administração de tamoxifeno (Fig. 6A). Camundongos iTfamKO alimentados com dieta suplementada com TB mostraram níveis aumentados de butirato nas fezes em comparação com camundongos iTfamKO alimentados com dieta padrão (Fig. 6B e Fig. S8A). A recuperação do butirato foi associada a um atraso na perda de peso corporal (Fig. 6C), e notavelmente ao aumento da força muscular avaliada pelo teste de preensão, que foi acompanhado pela diminuição da expressão dos genes associados a doenças mitocondriais Gdf15 e Mthfd2 no músculo esquelético (Fig. 6D, E). Além disso, camundongos iTfamKO alimentados com dieta suplementada com TB mostraram melhora no manuseio da glicose pelos testes de tolerância à glicose, e níveis restaurados de glicose em jejum quase aos níveis dos camundongos controle (Fig. 6F, G). Além disso, a quantificação dos níveis de albumina na urina indicou melhora na função renal em camundongos iTfamKO alimentados com dieta suplementada com TB (Fig. 6H). A suplementação com TB não afetou o tamanho do baço nem os parâmetros hematológicos em camundongos iTfamKO tratados (Fig. S8B, C). Importante, a administração de TB prolongou notavelmente a expectativa de vida mediana em ~ 25% (de 98 para 123 dias) e a expectativa de vida máxima em mais de 75% (de 106 para 186 dias) em camundongos iTfamKO alimentados com dieta suplementada com TB em comparação com aqueles que receberam dieta padrão (Fig. 6I).
Em conjunto, nossos achados apoiam a noção de que intervenções para restaurar os níveis de butirato retardam os sinais de multimorbidade e prolongam a expectativa de vida em camundongos iTfamKO.
A recuperação do butirato restaura as marcas de acilação de histonas epigenéticas no intestino de camundongos iTfamKO.
A administração de tributirina restaura as marcas epigenéticas dependentes da microbiota no íleo de camundongos iTfamKO.
A Immunoblot representativo e quantificação das marcas de acetilação e butirilação da histona H3 no íleo de camundongos controle, iTfamKO e controles tratados com antibióticos (Abx) (n = 4 para controle SD, n = 6 para iTfamKO SD, n = 3 para controle Abx; H3K9ac: **P = 0,0016 para controle SD versus iTfamKO SD, **P = 0,0029 para controle SD versus controle Abx; H3K9bu: ***P = 0,0004 para controle SD versus iTfamKO SD, **P = 0,0026 para controle SD versus controle Abx; H3K27bu: **P = 0,0067 para controle SD versus iTfamKO SD, *P = 0,0122 para controle SD versus controle Abx). B Mapa de calor representando os valores normalizados dos níveis de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) nas fezes de camundongos selvagens recebendo veículo (Veh) ou Abx (n = 3 para controle Veh, n = 3 para controle Abx, **P = 0,001 para AGCC totais, **P = 0,0023 para acetato, ****P ≤ 0,0001 para propionato, ***P = 0,0003 para butirato, *P = 0,00159 para isobutirato, *P = 0,0112 para 2-metilbutirato, ***P = 0,0002 para valerato, *P = 0,0143 para isovalerato). C Immunoblot representativo e quantificação das marcas de acetilação e butirilação da histona H3 no íleo de camundongos controle e iTfamKO alimentados com dieta padrão (SD) ou dieta suplementada com 10% de tribuirina (TB) (n = 4 para controle SD, n = 5 para iTfamKO SD, n = 5 para iTfamKO TB; H3K9ac: *P = 0,0225 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB; H3K9bu: *P = 0,0395 para controle SD versus iTfamKO SD, *P = 0,0353 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB; H3K27bu: *P = 0,035 para iTfamKO SD versus iTfamKO TB). D Agrupamento hierárquico de genes diferencialmente expressos (DEGs) na análise de RNA-seq em massa no íleo. E Delineamento experimental da análise transcriptômica de genes cuja expressão foi previamente relatada como dependente da marca H3K27bu. F Mapa de calor representando a expressão de genes dependentes de H3K27bu nos dados de RNA-seq do íleo. Os dados são apresentados como médias ± EPM, onde cada ponto é uma amostra biológica. Os valores de P foram determinados por A e C ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Tukey ou B teste t de Student bicaudal não pareado. Os dados fontes e valores de P para dados não significativos são fornecidos como um arquivo de Dados Fonte.
O butirato derivado da microbiota intestinal demonstrou remodelar o panorama epigenético das células intestinais através da acilação da histona H3. Para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da suplementação com TB, analisamos os níveis de acetilação e butirilação nos resíduos de lisina 9 e 27 da histona H3 no íleo por Western Blotting. Em comparação com camundongos controle, os camundongos iTfamKO exibiram uma redução notável nos níveis de H3K9ac, H3K9bu e H3K27bu no íleo (Fig. 7A). Confirmando o papel crucial dos AGCC derivados da microbiota na aquisição dessas modificações histônicas, observamos resultados semelhantes em camundongos controle depletados de microbiota após tratamento com um coquetel de antibióticos de amplo espectro (Abx) (Fig. 7A), que apresentaram uma perda quase completa de AGCC em comparação com os controles que receberam veículo (Fig. 7B).
Exploramos o potencial do TB em restaurar essas modificações de histonas em camundongos iTfamKO. Notavelmente, a suplementação com TB restaurou os níveis de H3K9ac, H3K9bu e H3K27bu no íleo de camundongos iTfamKO quando comparados com aqueles que receberam uma dieta padrão (Fig. 7C). Para investigar como o TB afetou o panorama transcriptômico no íleo, realizamos a análise de sequenciamento em massa de RNA em amostras de camundongos controle, iTfamKO e iTfamKO suplementados com TB. O agrupamento hierárquico dos genes diferencialmente expressos mostrou que os camundongos controle e iTfamKO suplementados com TB se agruparam juntos (Fig. 7D). Isso sugeriu que o TB restaurou parcialmente as alterações na expressão gênica no íleo desses camundongos, com regulação positiva de genes envolvidos na integridade estrutural da mucosa (Vill, Krt80, Sh3pxd2b, Loxl1, Matn2) e na regulação da resposta imune (FoxP3, Ctla4, Ccr3, Ccl22) (Fig. S9), que são cruciais para o correto desempenho da barreira intestinal. A butirilação da histona H3 foi recentemente associada à regulação transcricional de genes envolvidos em vias relevantes para a homeostase intestinal, como complexos juncionais intercelulares e estresse oxidativo. Portanto, examinamos a expressão de genes previamente publicados como dependentes da marca H3K27bu (Fig. 7E). Com foco nos genes cuja expressão foi reprimida no íleo de camundongos iTfamKO em comparação com os controles, descobrimos que o TB regulou positivamente genes envolvidos na arquitetura de junção célula-célula (Tjp2, Cdh2, Dsp) e na organização do citoesqueleto (Nck2, Rhpn2, Dyrk1a, Krt78), que são relevantes para a regulação da barreira física do intestino (Fig. 7F e Fig. S10). Além disso, observamos aumento da expressão de genes participantes da resposta ao estresse oxidativo (Jun, Src), bem como na proliferação celular e morfogênese tecidual, com ênfase especial na funcionalidade das células musculares (Tgfbr2, Zfand5) que pode desempenhar um papel no peristaltismo intestinal (Fig. 7F). Assim, a suplementação com butirato restaura as modificações epigenéticas de histonas no intestino de camundongos iTfamKO, corrigindo a expressão de alguns genes envolvidos na homeostase intestinal.
No geral, nossos resultados indicam que a disrupção da barreira intestinal e a disbiose intestinal são características da disfunção mitocondrial, levando à redução da produção de SCFA. Portanto, restaurar os níveis de butirato alivia a falência orgânica sistêmica e prolonga notavelmente a vida útil em camundongos iTfamKO.
A desregulação da homeostase intestinal, compreendendo aumento da permeabilidade intestinal e disbiose microbiana, tem sido cada vez mais associada a um amplo espectro de patologias não transmissíveis, incluindo distúrbios inflamatórios, metabólicos, cardiovasculares e neuropsiquiátricos. Embora o papel preciso da disbiose intestinal na patologia ainda seja pouco compreendido, seu impacto negativo no hospedeiro tem sido atribuído a seus subprodutos metabólicos desregulados. Os AGCCs, metabólitos-chave produzidos pela microbiota intestinal através da fermentação de carboidratos e proteínas da dieta e do hospedeiro, desempenham um papel central na salvaguarda da integridade da barreira intestinal e da fisiologia do hospedeiro. Dados seus efeitos benéficos locais e sistêmicos, os AGCCs surgiram como agentes terapêuticos promissores para uma infinidade de condições inflamatórias, oncológicas, cardiometabólicas e neurológicas. Assim, a interação entre o hospedeiro e sua microbiota comensal é fundamental para preservar o mutualismo e garantir a saúde.
Neste estudo, demonstramos que dois modelos murinos distintos de disfunção mitocondrial sistêmica — camundongos iTfamKO e mtDNA-mutator — apresentam ruptura da barreira intestinal acompanhada por disbiose bacteriana profunda, caracterizada por uma redução marcante na diversidade microbiana e perda de simbiontes comensais. Observamos que a falha mitocondrial está associada à hiperpermeabilidade intestinal em ambos os camundongos iTfamKO e mtDNA-mutator. Relatos anteriores mostraram que a ablação de Tfam iniciada na idade adulta, especificamente no epitélio intestinal, impacta a dinâmica das células-tronco intestinais (CTIs), atenuando a maturação dos enterócitos. Camundongos mtDNA-mutator também apresentam atrofia das criptas intestinais e diminuição do número e da atividade das CTIs proliferativas devido à depleção de NAD+ e subsequente ativação da resposta integrada ao estresse, o que pode participar da ruptura da barreira física intestinal em nossos modelos murinos. Além do epitélio, a depleção de Tfam também afeta as células musculares lisas na mucosa intestinal de camundongos iTfamKO, o que perturba criticamente o peristaltismo intestinal e o esvaziamento intestinal, resultando em sinais de constipação como observado em pacientes com doenças mitocondriais.
Observamos alterações composicionais e metabólicas semelhantes na microbiota intestinal de camundongos iTfamKO e mtDNA-mutator, corroborando alterações da microbiota associadas à idade previamente relatadas em animais mtDNA-mutator. Essa falha endossimbiótica também foi descrita em camundongos sem a proteína de choque térmico mitocondrial 60, que apresentam diversidade microbiana reduzida e expansão de bactérias associadas a doenças, levando a patologia intestinal. No geral, esses estudos destacam um papel central das mitocôndrias do hospedeiro na formação da composição e função da microbiota intestinal, seja promovendo a homeostase ou contribuindo para o remodelamento patológico.
Camundongos iTfamKO e mtDNA-mutator compartilham uma redução nas bactérias produtoras de AGCC (ácidos graxos de cadeia curta) centrais, sugerindo interações conservadas entre hospedeiro e microbiota ligadas à aptidão mitocondrial. Notavelmente, entre os AGCC, apenas os níveis de butirato estão diminuídos nas fezes de camundongos mtDNA-mutator. Essa redução se correlaciona com a diminuição da abundância de táxons especializados na produção de butirato, como Lachnospiraceae e Ruminococcaceae, enquanto bactérias especializadas na produção de acetato ou propionato parecem não ser afetadas, explicando potencialmente os níveis inalterados desses metabólitos. Como as bactérias produtoras de butirato dependem de uma camada de muco intacta, a função prejudicada das células caliciformes em camundongos iTfamKO pode estar por trás da perda de bactérias produtoras de AGCC. Essas descobertas estão alinhadas com relatos anteriores mostrando que a função mitocondrial é necessária para a deposição adequada de mucina e que a ruptura da camada de muco leva à perda de bactérias benéficas produtoras de AGCC tanto em camundongos quanto em humanos. Além disso, o metabolismo mitocondrial modula a biodisponibilidade de oxigênio no lúmen intestinal, e mudanças nos níveis de oxigênio podem alterar ainda mais a composição da microbiota comensal.
Além das complicações intestinais, as estratégias de FMT (transplante de microbiota fecal) parecem ser uma ferramenta viável para aliviar condições cardiovasculares, metabólicas e neurológicas. Nesse sentido, descobrimos que o transplante de microbiota fecal de camundongos controle saudáveis retarda os sinais da doença e prolonga a vida útil em camundongos iTfamKO, o que está associado a níveis restaurados de butirato. Notavelmente, a reposição de butirato mitiga a sarcopenia e melhora o manuseio da glicose, o metabolismo e a função renal em camundongos iTfamKO. Em linha com isso, estratégias para remodelar a microbiota intestinal e seus AGCC derivados mostraram efeitos benéficos em camundongos Ndusf4–/– que mimetizam a síndrome de Leigh, uma doença mitocondrial que cursa com sintomas neurológicos. Da mesma forma, estratégias para restaurar a eubiose e aumentar os níveis de butirato exerceram efeitos benéficos em modelos de camundongos de esclerose lateral amiotrófica, uma condição intimamente ligada à disfunção mitocondrial. Além de melhorar os resultados de saúde, a administração de butirato pode prolongar a longevidade em diferentes modelos experimentais, semelhante ao detectado em camundongos iTfamKO após administração de tribuirina. Vale notar que observamos que o tratamento com tribuirina é substancialmente mais eficaz do que a FMT em camundongos iTfamKO, provavelmente refletindo mecanismos de ação distintos. Enquanto a tribuirina fornece diretamente uma fonte sustentada de butirato, contornando assim a necessidade de colonização bacteriana, a estratégia de FMT depende do enxerto bem-sucedido de uma microbiota saudável em um ambiente intestinal hostil, limitando assim seu impacto benéfico em camundongos iTfamKO.
Mecanisticamente, o butirato pode modular as modificações pós-traducionais das histonas por meio da inibição das histonas desacetilases, e atuando como substrato para acetilação, propionilação e butirilação diretas, vinculando o metabolismo microbiano ao panorama epigenético do hospedeiro. Particularmente, observamos que os níveis de histona H3 butirilada e a expressão de vários genes dependentes de butiril-H3 que são cruciais para a homeostase intestinal estavam diminuídos no íleo de camundongos iTfamKO. A recuperação dessas marcas epigenéticas após a suplementação com TB foi associada à regulação positiva de genes envolvidos na barreira física e na resposta ao estresse oxidativo no intestino desses camundongos. Essa regulação dependente de SCFA das acilações das histonas fornece uma estrutura molecular pela qual os sinais microbianos ditam a expressão gênica e os resultados de saúde do hospedeiro. Como os efeitos terapêuticos da tributirina podem ser atribuídos a outros mecanismos moleculares, estudos futuros devem esclarecer a relevância da remodelação epigenética dependente de butirato em distúrbios que apresentam disfunção mitocondrial. Por exemplo, o butirato também pode servir como agonista para receptores acoplados à proteína G e fatores de transcrição, como os Receptores Ativados por Proliferadores de Peroxissomos (PPARs). De acordo, agonistas de PPAR demonstraram aumentar o condicionamento mitocondrial em uma miríade de patologias que apresentam declínio na função mitocondrial. Em células com mitocôndrias competentes, o butirato também pode atuar como fonte de energia, que pode ser metabolizada em acetil-CoA por meio da oxidação de ácidos graxos para ajudar a sustentar a bioenergética celular. Após a depleção induzível de TFAM, a extensão da renovação mitocondrial poderia criar uma janela terapêutica para o butirato atuar como um substrato bioenergético alternativo.
O butirato, por meio de seu papel duplo na regulação do metabolismo e do panorama epigenético, oferece benefícios terapêuticos potenciais em várias condições relacionadas à disfunção mitocondrial. Portanto, é tentador especular que estratégias que visam restaurar a simbiose hospedeiro-microbiota ou normalizar metabólitos derivados da microbiota poderiam melhorar a progressão de doenças associadas à função mitocondrial deficiente.
Métodos
Todos os procedimentos de experimentação animal foram autorizados pelos Comitês de Ética em Experimentação Animal do Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM) e do Centro Superior de Investigaciones Científicas (ProEx 20.5/25), fazendo todos os esforços para minimizar o desconforto dos camundongos. Camundongos Tfamfl/flUbcCre-ERT2 foram gerados pelo cruzamento de camundongos Tfamfl/fl com camundongos que expressam a recombinase Cre indutível Cre-ERT2 sob o controle do gene da ubiquitina (camundongos UbCre-ERT2). A colônia de camundongos Tfamfl/flUbcCre-ERT2 foi criada e mantida no Biotério do CBM sob condições específicas livres de patógenos. Tanto camundongos Tfamfl/flUbcCre-ERT2–/– quanto Tfamfl/flUbcCre-ERT2+/– receberam administração intraperitoneal de 20 mg/ml de tamoxifeno (Sigma-Aldrich) dissolvido em uma solução de 10% de etanol em óleo de milho por cinco dias consecutivos. Para estudos de suplementação com tribuirina, os camundongos foram alimentados com uma dieta padrão (Research Diets, D11112201i) ou uma dieta padrão suplementada com 10% (p:p) de tribuirina (Research Diets, D24012601i). Camundongos PolgAD257A/D257 (Polgmut) ou mutantes de mtDNA e seus controles, camundongos PolgAwt, foram criados e mantidos no Biotério do Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) sob condições específicas livres de patógenos. Dois a cinco camundongos foram alojados por gaiola, separados por genótipo e sexo, e alimentados ad libitum, recebendo materiais de papelão como parte do enriquecimento ambiental. Os camundongos foram criados em fundo C57BL/6J, e a maioria dos estudos foi realizada em camundongos fêmeas para facilitar a normalização da microbiota por meio de troca de camundongos e/ou gaiolas antes de iniciar o experimento.
Testes de tolerância à glicose
Após a determinação dos níveis de glicose sanguínea em jejum noturno, os camundongos receberam injeção intraperitoneal de glicose na dose de 2 g por quilograma de peso corporal [10% (p:v)]. Em seguida, os níveis de glicose sanguínea foram determinados a partir do sangue da cauda dos camundongos aos 15, 30, 60, 120 e 180 min, usando tiras reativas de glicose Contour Next e um glicosímetro (Bayer).
Medições de temperatura corporal
A temperatura corporal foi medida em camundongos imobilizados com o abdômen exposto. Um sensor de termômetro infravermelho foi então posicionado abaixo da parte inferior do abdômen, a aproximadamente 2–5 mm de distância da superfície abdominal, enquanto o camundongo era segurado com o corpo paralelo ao chão. Três medições foram realizadas para cada camundongo.
Avaliação da força de preensão dos membros anteriores
Os camundongos foram segurados pela cauda, e a força de preensão dos membros anteriores foi medida como força de tensão usando um transdutor de força digital (Grip Strength Meter, Bioseb). Cinco a sete medições por tentativa foram realizadas para cada camundongo, com alguns segundos de intervalo entre as medições.
Teste do rotarod
A coordenação motora foi avaliada em um aparelho rotarod acelerador (Ugo Basile). Camundongos foram treinados por dois dias consecutivos em velocidade constante: no primeiro dia, quatro vezes a 4 rotações por minuto (rpm) por 1 min e, no segundo dia, quatro vezes a 8 rpm por 1 min. No dia seguinte, o instrumento rotarod foi configurado para acelerar progressivamente de 4 a 40 rpm por 5 min. Durante as tentativas de aceleração, a latência para cair da haste foi medida. Os camundongos foram testados quatro vezes.
Teste de campo aberto
Para experimentos comportamentais, os camundongos foram simultaneamente transferidos para uma sala de comportamento onde se habituaram por vários dias antes do início dos testes. O ciclo claro/escuro foi de 12/12 h (luzes acesas às 8:00). Todos os experimentos foram realizados durante a fase clara. Para minimizar a variabilidade, cada animal foi sempre testado no mesmo horário do dia. O teste de campo aberto foi medido em uma arena quadrada de 43 × 43 cm e registrado por 3 dias. Os camundongos foram primeiro habituados ao escuro por 30 min e depois colocados na arena iluminada por 10 min. O movimento livre foi registrado e analisado usando o software ANY-maze™ Video Tracking System (Stoelting Co.). Para avaliar a locomoção, a distância total percorrida, a velocidade de exploração e o tempo imóvel foram quantificados.
Teste de construção de ninho
O desempenho na construção de ninho foi realizado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os camundongos foram alojados individualmente durante a noite em gaiolas limpas contendo maravalha, mas sem enriquecimento ambiental. Em seguida, um novo ninho intacto foi colocado dentro da gaiola. Na manhã seguinte, a construção do ninho foi pontuada da seguinte forma: ninho principalmente intocado (1 ponto); ninho parcialmente rasgado, mas principalmente plano (2 pontos); ninho principalmente rasgado, mas sem ninho identificável (3 pontos); ninho identificável, mas principalmente plano (4 pontos); ninho perfeitamente construído com paredes cobrindo o corpo do camundongo (5 pontos).
Análises hematológicas
O sangue foi extraído por punção da veia submandibular em tubos Microvette® EDTA K2. O plasma sobrenadante foi coletado das amostras anticoaguladas após centrifugação a 10.000 × g por 12 min a 4 °C. Finalmente, o plasma foi avaliado com um analisador hematológico Abacus Junior ou Element HT5.
Camundongos em jejum de 2 h receberam, por gavagem oral, uma diluição de 1:3–1:4 (v:v) de 250 mg/ml de sonda de dextrano-fluoresceína isotiocianato (FITC) de 4 kDa (Sigma-Aldrich) na dose de 0,6 g por quilograma de peso corporal. Após 2 h, 100 a 120 μl de sangue foram coletados em tubos BD Microtainer® da veia facial dos camundongos e centrifugados a 6000 × g por 10 min a 4 °C para obtenção da fração sérica. As medições de FITC-dextrano foram realizadas em duplicata por quantificação fluorimétrica do soro de camundongo misturado com igual volume de solução salina tamponada com fosfato (PBS) [1:9 (v:v)]. Diluições de soro de camundongo não tratado em FITC-dextrano diluído com PBS foram usadas como curva padrão para calcular as concentrações sanguíneas de FITC-dextrano. Cem microlitros de padrões ou soros diluídos foram medidos em um leitor de 96 poços FLUOstar OPTIMA® (BMG Labtech) com comprimento de onda de excitação de 492 nm e comprimento de onda de emissão de 525 nm.
Análise da produção fecal e do conteúdo de água nas fezes
Os camundongos foram alojados individualmente durante a noite em gaiolas limpas, sem maravalha ou enriquecimento ambiental, e o número de fezes por gaiola foi enumerado no dia seguinte. Uma amostra fecal fresca de cada animal foi imediatamente coletada após o alojamento, pesada e seca a 50 °C durante a noite. Na manhã seguinte, as amostras foram pesadas novamente, e a diferença foi considerada o conteúdo de água fecal, expresso como porcentagem.
Transplante de microbiota fecal (TMF)
Os TMF foram realizados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, camundongos em jejum de 6 h receberam, por gavagem oral, durante 3 dias consecutivos, 200 μl de um coquetel de antibióticos composto por neomicina (1 mg/ml) (Nzytech), ampicilina (1 mg/ml) (Nzytech), metronidazol (1 mg/ml) (Sigma-Aldrich) e vancomicina (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich) em água autoclavada. No dia seguinte, quatro a cinco pellets fecais frescos foram agrupados de camundongos doadores em 600 μl de tampão reduzido (0,5 mg/ml de cisteína e 0,2 mg/ml de Na₂S em PBS) e vortexados por 1 min. Os homogenatos foram então centrifugados a 500 × g por 5 min para remover partículas grandes. Finalmente, 200 μl de suspensão fecal foram administrados por gavagem oral a camundongos receptores em jejum de 4 h, duas vezes por semana durante 2 semanas e, depois, uma vez por semana até a eutanásia. Após o TMF, a suspensão restante foi aplicada na pelagem dos camundongos receptores, e suas gaiolas foram reabastecidas com pellets fecais frescos e maravalha suja dos camundongos doadores para garantir a coprofagia.
Experimentos de depleção da microbiota
Os camundongos foram aleatoriamente designados para grupos de tratamento com veículo ou antibióticos (Abx). Os camundongos do último grupo receberam um coquetel de neomicina (1 mg/ml) (Nzytech), ampicilina (1 mg/ml) (Nzytech), metronidazol (1 mg/ml) (Sigma-Aldrich) e vancomicina (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich) em água potável autoclavada suplementada com sacarose (2 mg/ml) para melhorar a palatabilidade, renovada semanalmente. Os camundongos do grupo veículo foram tratados com água com sacarose sem antibióticos pelo mesmo período.
Análise histológica, imuno-histoquímica e de imunofluorescência
Os tecidos foram coletados de camundongos eutanasiados após perfusão intracardíaca com PBS gelado. Os órgãos foram então fixados em formalina tamponada neutra a 10% por 24 h e desidratados em etanol a 70% até o processamento. Os órgãos desidratados foram embebidos em parafina e processados com micrótomo para obtenção de cortes. Em seguida, os cortes foram desparafinizados e corados conforme detalhado nas legendas das figuras para seu exame histológico. As imagens foram capturadas usando a objetiva de 5× de um microscópio vertical AxioImager M1 (Zeiss) conectado a uma câmera DMC6200 (Leica) e ao software LasX (v4.13). Os comprimentos das criptas e vilosidades foram medidos desde a base da cripta até a junção cripta-vilosidade e, a partir daí, até a ponta da vilosidade, respectivamente. A quantificação das áreas coradas com Ácido Periódico de Schiff (PAS) ou Azul Alcião foi realizada utilizando o software ImageJ (v1.53n) após deconvolução da imagem. O número de células PAS-positivas (células caliciformes) no íleo e cólon foi contado e normalizado pelo comprimento da vilosidade ou da cripta, respectivamente. As áreas identificadas como PAS-positivas ou Azul Alcião-positivas por limiarização foram medidas e normalizadas pela área total do tecido. Vinte e cinco a cinquenta unidades cripta-vilosidade por camundongo foram quantificadas de maneira simples-cega. As rupturas da lâmina elástica, definidas como interrupções nas fibras elásticas, foram contadas em toda a camada média de 3 cortes transversais consecutivos por camundongo, e o número médio de rupturas foi calculado. A quantificação das imagens foi realizada utilizando o software NanoZoomer Digital Pathology (v2.7.25).
Análise de imunofluorescência
Para coloração por imunofluorescência cerebral, o hemisfério esquerdo de cada cérebro foi fixado por imersão em paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS por 24 h à temperatura ambiente (TA) e armazenado em PBS a 4 °C. Em seguida, os hemisférios fixados foram embebidos em uma solução de sacarose a 10%–agarose a 4% em tampão fosfato (PB). Os blocos resultantes foram cortados com um vibrátomo (Leica), obtendo-se secções sagitais de 40 μm de espessura, que foram armazenadas a −20 °C em glicerol a 40%, etilenoglicol a 30% em PB 0,2 M, pH 7,4. As fatias cerebrais foram lavadas com solução salina tamponada com Tris (TBS), permeabilizadas e bloqueadas com solução de bloqueio (Triton X-100 a 0,5% e BSA a 2% em TBS) por 1 h à TA. As secções foram então incubadas durante a noite com anticorpo anti-NeuN de camundongo (diluição 1:500; Millipore, MAB377) diluído em solução de bloqueio a 4 °C. Após 3 lavagens com TBS, cada secção foi incubada com anticorpos secundários conjugados a fluoróforos por 1 h à TA. Elas foram lavadas novamente com TBS e os núcleos foram contracorados com DAPI por 5 min (diluição 1/5000; Merck, 268298). Por fim, as secções foram montadas em lâminas usando Meio de Montagem Prolong Glass (Invitrogen). As imagens foram adquiridas usando a objetiva de imersão em óleo 25× de um microscópio confocal LSM710 acoplado a um microscópio vertical AxioImager M2 (Zeiss) e ao software ZEN Black 2010, e foram analisadas com o software ImageJ (v1.53n). Os grânulos de lipofuscina foram quantificados de forma simples-cega em lâminas cerebrais devido às suas propriedades autofluorescentes.
Microscopia eletrônica
Após a coleta, uma porção do íleo e do cólon foi fixada com PFA a 4% e glutaraldeído a 2% em PB 0,1 M, pH 7,4. Os tecidos foram pós-fixados com tetróxido de ósmio a 1% e ferrocianeto de potássio a 1% em água por 1 h a 4 °C, desidratados com concentrações decrescentes de etanol e, finalmente, embebidos em resina EPON. Secções de oitenta nm do tecido embebido foram obtidas usando um ultramicrótomo Ultracult E e montadas em grades de slot de cobre revestidas com carbono. As secções foram contracoradas com acetato de uranila a 2% e citrato de chumbo por 1 h. As preparações foram examinadas com um microscópio eletrônico de transmissão (JEM1400 Flash, Jeol), e as imagens foram adquiridas com uma câmera CMOS Oneview (Gatan). A área das mitocôndrias e o número de inclusões corporais por mitocôndria foram quantificados de forma simples-cega usando o software ImageJ (v1.53n).
Análise imuno-histoquímica
Para a imunocoloração, as secções ileais desparafinizadas foram reidratadas e fervidas em tampão citrato (tampão citrato 10 mM, Triton X-100 a 0,05%, pH 6) para recuperação antigênica. Em seguida, as secções foram bloqueadas em soro de cabra a 10%, soro de cavalo a 5%, Triton X-100 a 0,05% e BSA a 2% em PBS por 45 min. A peroxidase endógena e a biotina foram bloqueadas com peróxido de hidrogênio-metanol a 1% por 10 min e um kit de bloqueio de biotina (Vector Laboratories), respectivamente. As secções foram incubadas com um anticorpo de cabra anti-Ki67 (RD Systems, AF3667) e a cor foi obtida com 3,3′-diaminobenzidina (Vector Laboratories). As secções foram contracoradas com hematoxilina e montadas em DPX (Fluka). As lâminas foram digitalizadas com um scanner NanoZoomer-RS (Hamamatsu). O número de células positivas para Ki67 foi quantificado de forma simples-cega usando o software NanoZoomer Digital Pathology (v2.7.25).
Imunoblot
Para a análise de Western blot, os tecidos congelados foram dissecados e homogeneizados em tampão RIPA (Tris–HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 a 1%, desoxicolato de sódio a 1%, SDS a 0,1%) com inibidores de proteases (cOmpleteTM, Sigma-Aldrich) e de fosfatases (Sigma-Aldrich). A concentração de proteínas nas amostras homogeneizadas foi determinada usando o kit PierceTM BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific) ou o DC Protein Assay (Bio-Rad), seguindo as instruções do fabricante. Trinta a 50 μg de lisados cerebrais, ou 20 μg de lisados ileais, foram preparados em tampão Laemmli (Tris–HCl 25 mM pH 6,8, SDS a 1%, glicerol a 3,5%, 2-mercaptoetanol a 0,4% e azul de bromofenol a 0,04%) e separados por eletroforese em géis de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,04%.
As proteínas foram então transferidas para membranas de nitrocelulose por transferência úmida para lisados cerebrais ou usando o sistema Trans-Blot® TurboTM (Bio-Rad) para lisados de íleo e, após bloqueio com BSA 5% ou leite 5% em TBS com 0,1% de Tween-20 [T-TBS], as membranas foram incubadas durante a noite com anticorpo de coelho anti-TFAM (diluição 1:1000; Proteintech, 22586), anticorpo de coelho anti-calnexina (diluição 1:10.000; Abcam, ab22595), anticorpo de coelho anti-tau-P Ser 396 (diluição 1:1000; Life Technologies, 44752G), anticorpo de camundongo anti-PSD-95 (diluição 1:1000; BD Biosciences, 610495) ou anticorpo de camundongo anti-vinculina (diluição 1:10.000; Abcam, ab129002) para lisados cerebrais, ou anticorpo de coelho anti-H3K9ac (diluição 1:5000; Abcam, ab4441), anticorpo de coelho anti-H3K9bu (diluição 1:500; PTMBio, PTM-305), anticorpo de coelho anti-H3K27bu (diluição 1:1000; Merck, ABE2854), ou anticorpo de coelho anti-H3 (diluição 1:1000; Abcam, ab1791) para lisados de íleo diluídos em T-TBS a 4 °C com agitação suave. Após lavagem com T-TBS, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários correspondentes conjugados à peroxidase de rábano-silvestre em diluição de 1:2500 a 1:15.000 por 1 h à temperatura ambiente. O sinal da proteína foi detectado com o substrato PierceTM ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific), e a quimioluminescência foi medida com um Amersham™ Imager 680 (GE HealthCare). Cada proteína de interesse foi quantificada usando o software ImageJ (v1.53n) medindo a intensidade média dos pixels da banda correspondente e normalizando o valor para a respectiva proteína de controle. Imagens completas e não cortadas de qualquer imagem de blot cortada são fornecidas nos arquivos de Informações Suplementares e Dados Suplementares.
Isolamento de RNA e Análise de qPCR
A extração de RNA total foi realizada com um homogeneizador MagNA Lyser® (Roche) usando 1 cm de tecido congelado em 700 μl de reagente TRIzol® (Invitrogen). O RNA da fase aquosa resultante foi posteriormente purificado usando o RNeasy Mini Kit (QIAGEN) seguindo as instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade foram determinadas medindo a absorbância a 260 e 280 nm em um espectrofotômetro Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific).
As bibliotecas de cDNA foram preparadas a partir do RNA total e, em seguida, validadas e quantificadas por um Agilent 4200 TapeStation na Haplox. Após passar pela inspeção da biblioteca, o mRNA de fita simples foi sequenciado na plataforma Illumina Novaseq Xplus, e arquivos FastQ foram gerados contendo dados de nucleotídeos e escores de qualidade para cada posição. A qualidade dos arquivos FastQ foi verificada usando FastQC (v0.11.9). As leituras de sequenciamento de RNA foram mapeadas para o genoma de referência do Mus musculus GRCm39 usando os softwares Hisat2 (v2.2.1) ou STAR (v2.5.2). As leituras foram então pré-processadas com SAMtools (v1.13) para transformar arquivos de Mapa de Alinhamento/Sequência em arquivos de Mapa de Alinhamento Binário e classificadas. O número de leituras cobertas por cada gene foi calculado pelo HTSeq-Count (v1.99.2).
A análise de dados downstream foi realizada com R (v4.3.2). A análise de expressão gênica diferencial (DEG) foi realizada usando DESeq2 (v1.44). Genes com valor de P < 0,05 e |log2-fold change| > 0,6 foram determinados como apresentando diferenças estatisticamente significativas na comparação entre grupos. A análise de super-representação (ORA) e a análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) foram realizadas usando o pacote clusterProfiler (v4.8.3) nos bancos de dados GO, KEGG, WikiPathways, Reactome e Hallmarks of the Molecular Signatures. Gráficos PCA, diagramas de cordas e mapas de calor foram visualizados usando ggplot2 (v3.4.4), circlize (v0.4.15) e pheatmap (v1.0.12), respectivamente.
Para a análise de qPCR, a transcrição reversa foi realizada usando 500 ng de extratos de RNA e o Maxima™ First Strand cDNA Synthesis Kit e dsDNase (Thermo Fisher Scientific). A reação foi realizada em um termociclador ProFlex™ PCR System (Applied Biosystems) a 25 °C por 10 min, seguido de 50 °C por 15 min e 85 °C por 5 min. As amostras de cDNA foram então resfriadas a 4 °C e armazenadas a −20 °C para a análise de qPCR. As condições de amplificação foram determinadas pelos primers para apresentar eficiência de amplificação próxima a 100% e um pico único nas análises de curva de melting. Incluímos diluição de 1:15-1:25 das amostras de cDNA na reação de qPCR, juntamente com 5 μl de polimerase (Go Taq® Master Mix, Promega) e 0,5 μl de cada solução de primer forward e reverse (estoque de 5 μM) adicionados a placas de 384 poços. A reação foi realizada em um termociclador Bio-Rad CFX 384. Os pares de primers 5′−3′ (FW, RV. Sigma) usados para qPCR estão listados na Tabela S1.
Os dados de RT-PCR quantitativo foram analisados usando o método 2-ΔΔCt para calcular as alterações relativas na expressão gênica, onde ΔΔCt é a diferença entre os valores de Ct da amostra problema e os do controle. A expressão relativa em cada figura representa os níveis de indução do gene de interesse em relação a Hprt, Pp1a ou B2m.
Análise de proteína na urina
A urina foi coletada de camundongos após imobilizá-los sobre um pedaço de Parafilm e imediatamente congelada a −80 °C. Dez microlitros de amostras de urina ou 0,05 mg/ml de BSA (Bio-Rad) em tampão Laemmli foram carregados em um gel de poliacrilamida a 12% na presença de SDS em voltagem constante para realizar eletroforese. O gel de eletroforese foi então corado com uma solução de azul de Coomassie a 0,1% (p:v) em metanol a 20% e ácido acético a 10%, aquecendo o gel por 1 min no micro-ondas e colocando-o em um agitador por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, o gel foi descorado usando uma solução de metanol a 20% e ácido acético a 10%, aquecendo-o por 30 s no micro-ondas e depois lavando-o várias vezes com a solução indicada até que as bandas começassem a ficar visíveis. As imagens foram adquiridas com um Amersham™ Imager 680 (GE HealthCare). A banda correspondente à albumina foi quantificada usando o software ImageJ (v1.53n). Varreduras completas não cortadas de quaisquer imagens de gel cortadas são fornecidas no arquivo de Dados Suplementares.
Detecção de citocinas por Luminex
Sangue (100–120 μl) foi coletado em tubos BD Microtainer® da veia facial ou após eutanásia dos camundongos e centrifugado a 6000 × g por 10 min a 4 °C para obtenção da fração sérica. As citocinas das amostras de soro foram quantificadas utilizando o ensaio imunoenzimático multiplexado baseado em beads Cytokine & Chemokine 26-Plex Mouse ProcartaPlex™ Panel 1 (Invitrogen, EPX260-26088-901) seguindo as instruções do fabricante.
Quantificação de proteína de ligação a LPS (LBP) por ELISA
Amostras de soro de camundongos foram diluídas e processadas seguindo as instruções do fabricante (Enzyme Immunoassay for quantification of mouse LBP, Biometec). A placa foi medida em um leitor Dynex Opsys MRTM 96-plate (Aspect Scientific) em comprimento de onda de excitação de 450 nm para quantificação de absorbância e a 630 nm para correção de comprimento de onda.
Análise da microbiota por sequenciamento do gene 16S rRNA
As análises de sequência do gene 16S rRNA foram realizadas conforme relatado anteriormente. Em resumo, o DNA bacteriano extraído de amostras coletadas do conteúdo total do íleo e cólon, ou de fezes expelidas, foi extraído usando o kit E.Z.N.A stool DNA (Omega Biotek) seguindo as instruções do fabricante. Amplicons da região V4 do gene 16S rRNA foram obtidos em cada amostra usando o seguinte par de primers 5′−3′: CCTACGGGAGGCAGCAG (FW) e ATTACCGCGGCTGCTGG (RV). As bibliotecas foram então sequenciadas usando um instrumento Illumina MiSeq, e as sequências foram curadas e analisadas usando o pacote de software mothur (v.1.40.5).
Quantificação de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) por UPLC-MS/MS
Padrões de oito AGCC de cadeia reta e ramificada [ácido acético (AA), ácido propiônico (PA), ácido isobutírico (i-BA), ácido butírico (BA), ácido 2-metilbutírico (2-Me-BA), ácido isovalérico (i-VA), ácido valérico (VA) e ácido 3-metilvalérico (3-Me-VA)], 3-nitrofenilhidrazina (3NPH), cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDC), ácido fórmico e piridina foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Acetonitrila (ACN) foi adquirida da VWR. Curvas de calibração foram construídas usando uma solução mista de AGCC em ACN-água (50:50, v/v), com faixas de 1–10.000 µM para AA e 0,1–1000 µM para PA, i-BA, BA, 2-Me-BA, i-VA e VA.
Os SCFAs foram extraídos de 50 mg de conteúdo fecal, ileal, cecal ou do cólon usando 100 µl de ACN-água (50:50, v/v) contendo 5 µM de padrão interno, homogeneizados usando um sistema FastPrep-24 5 G (MP Biomedicals), incubados a 800 rpm por 15 min a 10 °C e centrifugados a 14.000 × g por 30 min a 4 °C. Para amostras de soro, os SCFAs foram extraídos adicionando 60 μl de metanol gelado (contendo PI) a 30 μl de soro, seguido de incubação em gelo por 1 h. Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 14.000 × g por 15 min a 4 °C. Quarenta microlitros do sobrenadante foram então misturados com 20 µl de 200 mM de 3-nitrofenilhidrazina (3NFH) e 120 mM de EDC/6% de piridina em ACN-água (50:50, v/v), seguido de incubação por 30 min a 40 °C. Após resfriamento até a temperatura ambiente, as amostras fecais, cecais e do cólon foram diluídas 20 vezes com 10% de ACN em água, enquanto as amostras de soro e conteúdo ileal foram diluídas 2 vezes ou 4 vezes, respectivamente, com 10% de ACN em água. Todas as amostras foram subsequentemente centrifugadas a 14.000 × g por 10 min a 4 °C e analisadas por UPLC-MS/MS. Os padrões e brancos foram processados usando o mesmo protocolo de derivatização.
A análise de SCFAs foi conduzida seguindo um protocolo descrito anteriormente. As análises foram realizadas usando um sistema Agilent 1260 Infinity II acoplado a um LC-MS Ultivo 6465 Triple Quadrupole, equipado com uma fonte ESI Agilent Jet Stream e controlado via MassHunter Workstation (Agilent Technologies). A aquisição por monitoramento de reações múltiplas (MRM) foi conduzida usando as transições e parâmetros ótimos listados na Tabela S2.
Análises estatísticas, reprodutibilidade e design de figuras
Análises estatísticas foram realizadas utilizando os softwares GraphPad Prism 9 ou Past 3.22. Nenhum método estatístico foi utilizado para predeterminar o tamanho amostral. Outliers foram identificados e excluídos pelo método ROUT (5%). Se os dados seguiam uma distribuição normal após a aplicação do teste de Shapiro–Wilk, as comparações entre dois conjuntos de dados foram realizadas usando o teste t de Student bicaudal não pareado, e as comparações entre mais de dois conjuntos de dados foram realizadas usando análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias ou análise de efeitos mistos com testes de comparação múltipla de Tukey ou Šidák. Caso contrário, as comparações entre dois ou mais conjuntos de dados foram calculadas usando os testes não paramétricos bicaudal de Mann–Whitney U e Wilcoxon ou o teste H de Kruskal–Wallis com teste de comparação múltipla de Dunn, respectivamente. Para curvas de sobrevivência, foi aplicado o teste log-rank de Mantel–Cox. A análise de variância multivariada permutacional (PERMANOVA) foi realizada com base em 9999 permutações. Diferenças com valores de P ≤ 0,05 foram consideradas significativas. *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; e ****P ≤ 0,0001. Salvo indicação em contrário, os dados experimentais foram representados como médias ± erro padrão da média (EPM), onde cada ponto representa uma amostra biológica individual de cada grupo experimental. Os gráficos de caixa e bigodes representam o intervalo interquartil entre o primeiro e o terceiro quartis (percentis 25 e 75, respectivamente), a mediana e os valores máximo e mínimo. Nas legendas das figuras, n denota o número de camundongos agrupados por grupo no experimento. As figuras foram elaboradas utilizando GraphPad Prism 9 e Adobe Illustrator (v29.0.1).
Resumo do relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Portfolio Reporting Summary vinculado a este artigo.
Informações suplementares
Dados de origem
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e filiações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Enrique Gabandé-Rodríguez, Manuel M. Gómez de las Heras.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-026-70547-4.
Contribuições dos autores
Conceptualização: E.G.-R., M.M.G.H e M.M. Análise formal: E.G.-R., M.M.G.H., P.R.-R., C.S., V.G.-C., N.I., I.B.-L., V.E.-Z., A.F.-A., J.O., G.S.-H., E.C., S.D.-P. e J.F.A. Aquisição de financiamento: E.C., M.M. e G.N. Investigação: E.G.-R., M.M.G.H., P.R.-R., C.S., V.G.-C., N.I., I.B.-L., V.E.-Z., J.O., A.F.-A., G.S.-H., E.C., C.V.-M., S.D.-P., J.I.E.-L., I.F.-Q. e J.F.A. Recursos: R.J.-M., J.P., A.V.L.-V., J.A.E. e G.N. Visualização: E.G.-R., M.M.G.H e M.M. Redação—rascunho original: E.G.-R., M.M.G.H e M.M. Redação—revisão e edição: E.G.-R., M.M.G.H e M.M.
Revisão por pares
Informações de revisão por pares
A Nature Communications agradece aos revisores anônimos por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Os dados brutos de sequenciamento de RNA do íleo, bem como os dados brutos de sequenciamento do gene 16S rRNA da microbiota, estão disponíveis publicamente via NCBI com os números de BioProject PRJNA1301342 e PRJNA1291203, respectivamente. Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Referências
A genética e patologia da fosforilação oxidativa
O fator de transcrição mitocondrial A é necessário para a manutenção do mtDNA e embriogênese em camundongos
A respiração mitocondrial controla a função lisossomal durante respostas inflamatórias de células T
Danos mitocondriais e ativação da via STING levam à inflamação renal e fibrose
Células T com mitocôndrias disfuncionais induzem multimorbidade e senescência prematura
A terapia com células T CD4 combate o inflamaging e a senescência ao preservar a integridade da barreira intestinal
Modificação genética da sobrevivência em camundongos knockout específicos de tecido com cardiomiopatia mitocondrial
A regulação extracelular da respiração mitocondrial leva ao aneurisma da aorta
Secreção de insulina comprometida e perda de células beta em camundongos knockout específicos de tecido com diabetes mitocondrial
A deleção específica de tecido adiposo de TFAM aumenta a oxidação mitocondrial e protege camundongos contra obesidade e resistência à insulina
O metabolismo lipídico aberrante das células de Schwann ligado a déficits mitocondriais leva à degeneração axonal e neuropatia
Cardiomiopatia dilatada e bloqueios de condução atrioventricular induzidos pela inativação cardíaca específica da expressão do gene do DNA mitocondrial
Aumento da massa mitocondrial em camundongos com miopatia mitocondrial
Origens da especificidade de tecido e tipo celular na doença do DNA mitocondrial (mtDNA)
Doenças mitocondriais
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A disfunção da barreira intestinal liga marcadores metabólicos e inflamatórios do envelhecimento à morte em Drosophila
A disbiose microbiana associada à idade promove permeabilidade intestinal, inflamação sistêmica e disfunção de macrófagos
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