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pmid: "28417940"
title: "Decocção de Folhas de Uncaria tomentosa Modula Diferentemente a Produção de ROS em Células Cancerígenas e Normais, e Afeta a Citotoxicidade da Cisplatina."
authors: "Kośmider A, Czepielewska E, Kuraś M, Gulewicz K, Pietrzak W, Nowak R, Nowicka G"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2017 Apr 12"
doi: "10.3390/molecules22040620"
source: "PMC Full Text"

Decocção de Folhas de Uncaria tomentosa Modula Diferentemente a Produção de ROS em Células Cancerígenas e Normais, e Afeta a Citotoxicidade da Cisplatina.

Autores

Kośmider A, Czepielewska E, Kuraś M, Gulewicz K, Pietrzak W, Nowak R, Nowicka G

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2017 Apr 12)

Conteudo

Decocção de Folhas de Uncaria tomentosa Modula Diferentemente a Produção de ROS em Células Cancerígenas e Normais, e Efeitos na Citotoxicidade da Cisplatina

Uncaria tomentosa é uma videira lenhosa com uma longa história de uso na medicina tradicional peruana e atualmente suplementos contendo essa videira como ingrediente estão disponíveis. Propriedades imunomoduladoras, anti-inflamatórias e anticancerígenas de Uncaria tomentosa foram sugeridas e atribuídas principalmente à presença de alcaloides oxindólicos tetra ou pentacíclicos. No entanto, a ação sinérgica de diferentes compostos presentes nos extratos e a modulação dos processos redox podem influenciar significativamente a atividade anticancerígena de Uncaria tomentosa. O objetivo do presente estudo foi investigar pela primeira vez os efeitos citotóxicos do extrato aquoso livre de alcaloides tetracíclicos (decocção) de folhas secas de Uncaria tomentosa em células normais e cancerígenas, e avaliar o efeito do extrato testado na citotoxicidade da cisplatina (CDDP). O extrato testado de Uncaria tomentosa não foi citotóxico para células NHDF, mas demonstrou efeito citotóxico contra células HepG2. O extrato aumentou a produção de ROS em células HepG2, o que resultou na diminuição do nível de GSH, levando à apoptose dessas células através da ativação da caspase-3 e caspase-7. Uma redução da forma ativa de NF-κB foi observada em células cancerígenas. Em células normais, o extrato não afetou a produção de ROS, o nível de GSH e a atividade de NF-κB, e manteve a viabilidade celular. A incubação de células HepG2 com decocção de Uncaria tomentosa e simultaneamente com CDDP resultou em um aumento da atividade citotóxica da CDDP contra HepG2, enquanto nas mesmas condições, Uncaria tomentosa preveniu a redução da viabilidade de células NHDF devido à CDDP. Os resultados indicam que a decocção de folhas de Uncaria tomentosa modula diferentemente o metabolismo oxidativo de células cancerígenas e normais, e aumentou a citotoxicidade da CDDP contra células cancerígenas e, ao mesmo tempo, aumentou a resistência de células normais saudáveis à cisplatina. Estudos adicionais são necessários para confirmar nossas observações e descrever o mecanismo molecular subjacente, e a potencial utilidade da decocção de Uncaria tomentosa na terapia adjuvante para o câncer.

1. Introdução
   Estudos anteriores revelaram que diferentes extratos orgânicos e aquosos de Uncaria tomentosa, uma planta peruana da família Rubiaceae, contêm substâncias biologicamente ativas, incluindo alcaloides oxindólicos pentacíclicos imunoestimulantes, triterpenos pentacíclicos do tipo ursano e glicosídeos do ácido quínóvico, que foram relatados como possuindo propriedades anti-inflamatórias e inibindo a replicação viral. Esses extratos também continham ésteres alquílicos carboxílicos, incluindo derivados do ácido quínico que, de acordo com os dados disponíveis, reduziram a proliferação de células neoplásicas e estimularam o reparo do DNA, além de antioxidantes como monômeros de catequina e proantocianidinas. Atualmente, suplementos dietéticos contendo essa videira como ingrediente estão disponíveis e são usados na terapia anticâncer.
   Estudos in vitro demonstraram efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos de extratos da casca de Uncaria tomentosa em várias linhagens celulares, incluindo células de leucemia humana K562 e HL60, células de linfoma B transformadas por EBV e células de câncer de mama MCF7. O extrato acetato de etila de Uncaria tomentosa em células HL60 causou alterações no potencial de membrana mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol e ativação da caspase-3.

Embora, em estudos in vitro, extratos orgânicos contendo grandes quantidades de alcaloides oxindólicos e alcaloides puros isolados de Uncaria tomentosa tenham inibido a proliferação de células neoplásicas, in vivo em camundongos portadores de carcinoma pulmonar de Lewis, um efeito inibitório mais forte no desenvolvimento do câncer foi causado por extratos aquosos com baixo teor de alcaloides. Os extratos aquosos contêm compostos polares, que estão mais disponíveis para o organismo. Também foi sugerido que as propriedades anti-inflamatórias e provavelmente anticancerígenas de Uncaria tomentosa podem estar relacionadas a uma ação sinérgica de diferentes compostos, e a modulação dos processos redox pode desempenhar um papel fundamental na atividade anticancerígena desta planta.

O objetivo do presente estudo foi investigar pela primeira vez a atividade citotóxica do extrato aquoso (decocção) livre de alcaloides tetracíclicos e rico em taninos de lâminas foliares secas de Uncaria tomentosa, e seu efeito na produção de EROs em células de hepatoma humano, HepG2, e em fibroblastos dérmicos humanos normais, NHDF. Também avaliamos a influência deste extrato na citotoxicidade da cisplatina contra células cancerígenas e em células normais saudáveis para fornecer uma visão sobre a potencial utilidade de Uncaria tomentosa no tratamento adjuvante para o câncer. Relatos anteriores concentraram-se nos efeitos de extratos de casca e raiz de Uncaria tomentosa em células cancerígenas, enquanto as folhas contêm compostos ativos semelhantes e o material apropriado pode ser coletado sem danos significativos à planta. O extrato utilizado neste estudo foi preparado de acordo com o procedimento comumente aceito para preparação de decocção de Uncaria tomentosa, aquecendo as folhas secas da planta em água.

2. Resultados e Discussão

2.1. Composição da Decocção Estudada de Folhas de Uncaria tomentosa
O decocto (extrato aquoso) das folhas de Uncaria tomentosa contém alcaloides oxindólicos pentacíclicos (13% da massa seca do extrato) e é livre de alcaloides tetracíclicos (Figura 1). Os alcaloides oxindólicos pentacíclicos: mitrafilina e pteropodina encontrados no extrato foram relatados como inibidores da proliferação de células cancerígenas e apresentam propriedades imunomoduladoras. Foi reconhecido que os alcaloides tetracíclicos podem reduzir significativamente a atividade dos alcaloides pentacíclicos, e de acordo com a Farmacopeia dos EUA, apenas extratos livres de alcaloides oxindólicos tetracíclicos podem ser usados em humanos para fins de pesquisa e/ou terapêuticos. O extrato testado contém também compostos fenólicos (Tabela 1), incluindo taninos condensados que pertencem às proantocianidinas e possuem atividade antioxidante.

2.2. Efeito do Decocto de Uncaria tomentosa na Viabilidade de Células Cancerígenas e Normais

O extrato das folhas de Uncaria tomentosa foi reconhecido como não tóxico para células NHDF, enquanto uma diminuição significativa na viabilidade celular foi observada apenas quando foram utilizadas altas concentrações do extrato >1 g/mL. No presente estudo, o tratamento de células HepG2 com este extrato causou uma diminuição significativa e dependente da concentração na viabilidade celular (Figura 2), e com base nos resultados do ensaio MTT, foi determinada a IC50 (concentração de inibição de 50% da viabilidade) de 580 µg/mL.

Células incubadas com o extrato e células controle também foram observadas por fluorescência (Figura 3). Com o aumento da concentração do extrato testado, houve uma diminuição progressiva no número de células HepG2 viáveis coradas em verde com calceína, e um aumento no número de células mortas coradas em vermelho com iodeto de propídio (PI). Na concentração do extrato de 145 µg/mL (Figura 3j–l), 22% das células HepG2 foram encontradas coradas em vermelho, e este número foi significativamente maior do que nas células controle (* p < 0,05). Nas imagens de fluorescência de células NHDF incubadas sob condições semelhantes às células HepG2, não foram observadas alterações significativas na morfologia celular e na quantidade de células coradas em vermelho (Figura 3a–f).

2.3. Efeito do Decocto de Uncaria tomentosa na Apoptose Celular

A incubação de células HepG2 com o decocto de folhas de Uncaria tomentosa nas concentrações de 72,5 µg/mL e 145 µg/mL resultou em um aumento no número de células positivas para anexina correspondentes a células apoptóticas, enquanto não foram observadas diferenças significativas no número de células positivas para anexina e positivas para PI. Concentrações do decocto de Uncaria tomentosa superiores a 145 µg/mL causaram um aumento significativo (* p < 0,05) no número de células em apoptose tardia (positivas para anexina e positivas para PI) ou também células necróticas (Figura 4). Sob condições semelhantes em células NHDF, nenhum efeito do decocto de Uncaria tomentosa nas concentrações de 72,5 µg/mL e 145 µg/mL sobre o número de células positivas para anexina, bem como positivas para anexina e positivas para PI, foi encontrado (dados não mostrados).

2.4. Efeito do Decocto de Uncaria tomentosa na Produção de ROS e no Nível de GSH
As alterações na viabilidade das células HepG2 podem estar associadas a mudanças funcionais na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e ao desenvolvimento de estresse oxidativo, portanto, a produção de EROs em células HepG2 e NHDF foi determinada.

Em células HepG2, o gráfico controle (para células sem o extrato) conforme mostrado na (Figura 5b) encontra-se abaixo dos gráficos de intensidade de DCF em células incubadas com diferentes concentrações de Uncaria tomentosa. Isso indica um aumento na produção celular de EROs causado pelo extrato de Uncaria tomentosa. A maior taxa de liberação de EROs foi observada durante os primeiros 0,5 h de incubação, enquanto após 1 h, os níveis de EROs se estabilizaram. O extrato de Uncaria tomentosa aumentou a formação de EROs, e um aumento estatisticamente significativo (* p < 0,05) foi observado. Sob condições experimentais semelhantes em células NHDF (Figura 5a), foi observado o efeito oposto do nosso extrato de Uncaria tomentosa na produção de EROs. Todas as doses testadas resultaram em níveis significativamente (* p < 0,05) mais baixos de intensidade de fluorescência em comparação aos controles, indicando menor produção de EROs pelas células NHDF tratadas com Uncaria tomentosa do que pelas células NHDF controle (não tratadas).

Nossos dados indicam que o extrato testado de Uncaria tomentosa pode induzir efeito citotóxico em células cancerígenas pela estimulação da superprodução de EROs. A glutationa (GSH) desempenha um papel significativo na manutenção do equilíbrio oxidativo-redutivo nas células, e seu nível é um indicador de resposta ao estresse oxidativo. Mostramos que em células HepG2 o extrato de Uncaria tomentosa causou uma redução dos níveis de GSH, e uma diminuição significativa (** p < 0,001) de GSH foi observada quando a concentração de Uncaria tomentosa de 145 µg/mL foi utilizada (Figura 6).

O extrato de Uncaria tomentosa em células NHDF (Figura 6) não causou alterações significativas nos níveis de GSH em comparação às células controle. A diminuição dos níveis de GSH predispõe as células a entrar na via de morte, enquanto os níveis persistentemente aumentados de GSH em células cancerígenas podem ser responsáveis por sua resistência a agentes quimioterápicos.

2.5. Efeito da Decocção de Uncaria tomentosa na Atividade da Caspase-3 e Caspase-7
A modulação dos processos redox pelo extrato testado pode desempenhar um papel fundamental na perda de viabilidade celular. A superprodução de ERO e a diminuição dos níveis de GSH podem levar à destruição das estruturas intracelulares, e as células podem entrar na via de morte, conforme indicado pelas alterações observadas na morfologia celular e no número de células positivas para Anexina. O efeito apoptótico da Uncaria tomentosa em células HepG2 foi confirmado pela ativação das caspases efetoras 3 e 7. Nas células HepG2, o extrato testado nas concentrações ≤145 µg/mL aumentou a atividade das caspases efetoras 3 e 7 em 250% (** p < 0,001, Figura 7) em comparação com a atividade basal (células não tratadas). Nas células NHDF, o efeito do extrato sobre essas caspases não foi significativo em comparação com as células não tratadas (controle) (Figura 7). Esses resultados estão de acordo com descobertas recentes de que a Uncaria tomentosa induziu a morte de células cancerígenas por meio da apoptose dependente da caspase-3.

2.6. Efeito da Decocção de Uncaria tomentosa na Atividade do NF-κB

O potencial de oxidação-redução de uma célula tem um impacto direto na regulação do NF-κB, que está envolvido em vários processos, incluindo proliferação e morte celular. Dados inconsistentes sobre os efeitos dos componentes individuais da Uncaria tomentosa, bem como de diferentes extratos na modulação da atividade do NF-κB foram relatados. O presente estudo mostrou que a incubação de células HepG2 com o extrato aquoso de Uncaria tomentosa resultou em cerca de 25%–30% de redução (* p < 0,05) da atividade do NF-κB (Figura 8), enquanto nas células NHDF incubadas com esse extrato, observou-se um aumento de cerca de 16%–26% (* p < 0,05) na atividade do NF-κB.

A importância da ausência de modulação aumentada do NF-κB para a eficácia da terapia contra o câncer foi indicada anteriormente e recentemente apoiada pelo estudo sobre a influência do C-Med100®, uma formulação padronizada de casca de Uncaria tomentosa, no NF-κB e na indução de apoptose em células neoplásicas. Medicamentos anticancerígenos utilizados na prática clínica, incluindo aqueles usados para hepatoma, ou seja, a cisplatina, entre outros, através da ativação do NF-κB podem estimular a resistência das células cancerígenas à quimioterapia. A inibição da ativação do NF-κB deve aumentar a eficácia do tratamento do câncer. Relatos sobre o efeito dos extratos de Uncaria tomentosa em células de leucemia humana (THP-1) indicaram inibição da via clássica de ativação do NF-κB. Tanto os alcaloides oxindólicos quanto as procianidinas foram encontrados com a capacidade de inibir a ativação do NF-κB.

2.7. Efeito da Uncaria tomentosa na Citotoxicidade do CDDP contra Células HepG2
O extrato aquoso de Uncaria tomentosa diminuiu a viabilidade das células cancerígenas (medida pelo ensaio MTT). Portanto, pode-se levantar a hipótese de que pode aumentar o efeito citotóxico de drogas anticancerígenas como a CDDP, comumente utilizada na prática clínica no tratamento do câncer. Para testar essa hipótese, células HepG2 e NHDF foram incubadas por 72 h com o extrato testado e nas últimas 48 h simultaneamente com CDDP (na concentração correspondente à IC50 de 11,25 µM em células HepG2, conforme determinado em nosso laboratório). Os resultados do ensaio MTT (Figura 9) mostram que o extrato aquoso de Uncaria tomentosa aumentou a atividade citotóxica da CDDP contra células HepG2, indicada por uma diminuição de 10%–15% na viabilidade celular.

No entanto, quando células NHDF normais foram tratadas com este extrato (nas concentrações de 72,5 e 145 µg/mL) e CDDP, foi observado um aumento significativo (* p < 0,05) na viabilidade celular de 30% em comparação com células NHDF tratadas apenas com CDDP. Esses dados sugerem que a decocção testada de Uncaria tomentosa pode aumentar a atividade citotóxica da CDDP contra células cancerígenas e, ao mesmo tempo, pode proteger as células normais dos efeitos nocivos da cisplatina. Recentemente, foi relatado o uso de cápsulas de Uncaria tomentosa (300 mg/dia) em pacientes com câncer colorretal. Uncaria tomentosa mostrou efeitos positivos na redução da neutropenia e trombocitopenia, bem como na reparação da resposta imune. Mais estudos são necessários para confirmar essas observações.

3. Materiais e Métodos
   3.1. Material Vegetal e Preparo da Decocção
   Folhas secas de Uncaria tomentosa foram adquiridas de plantações controladas da Laborations Induquinica (Lima, Peru), por meio do Centro de Fitoterapia de Wilcaccora (Łomianki perto de Varsóvia, Polônia). Folhas secas cominuídas de Uncaria tomentosa (4 g) foram extraídas com água morna (200 mL, temperatura abaixo do ponto de ebulição) por 20 min. A decocção foi subsequentemente centrifugada a 4000 rpm por 20 min. Para experimentos de cultura celular, as amostras foram separadas por filtração. Para analisar o teor de alcaloides e fenólicos, o extrato aquoso foi liofilizado e, como resultado da extração, obteve-se uma média de 1,16 g de pó seco.
   3.2. HPLC—Análise de Alcaloides
   Determinação de alcaloides na decocção de folhas de Uncaria tomentosa foi realizada de acordo com Pilarski et al.. A 100 mg do pó seco (decocção liofilizada) foi adicionada solução de ácido sulfúrico a 2% (15 mL) e a mistura foi sonicada por 15 min em banho ultrassônico (Sonorex RK 103H, Bandelin, Berlim, Alemanha). A mistura foi então centrifugada a 3000 rpm por 10 min e extraída três vezes com 10 mL de acetato de etila. A fase aquosa foi separada e ajustada para pH 10 com hidróxido de amônio a 10%, então extraída três vezes com 10 mL de acetato de etila cada. Os extratos orgânicos foram combinados, evaporados até a secura e o resíduo foi dissolvido em 10 mL de metanol. A análise qualitativa e quantitativa dos alcaloides foi realizada por HPLC utilizando uma coluna LiChrospher 100 RP-18 (250 mm × 4 mm, Merck, Darmstadt, Alemanha) e uma pré-coluna LiChrospher 100 RP-18 (4 mm × 4 mm, Merck); solventes: A—solução tampão fosfato (10 mM, pH 6,6), B—metanol:acetonitrila (1:1); gradiente de (60% A e 40% B) para (30% A e 70% B); tempo: 30 min, vazão 1 mL/min; detecção a 245 nm com detector de arranjo de diodos L-7450 (Merck-Hitachi, Darmstadt, Alemanha). As curvas de calibração foram obtidas a partir de soluções padrão dos alcaloides (isopteropodina, pteropodina, isomitrafilina, uncarina F, mitrofilina, especiofilina) em concentrações entre 0,01 e 1,0 mg/mL. Os padrões de alcaloides oxindólicos foram adquiridos da ChromaDex (Santa Ana, CA, EUA). Todos os padrões vieram com dados de RMN, EM e HPLC. Como padrão interno foi utilizada cafeína. Relações lineares entre a área do pico e a concentração do alcaloide foram observadas. Os resultados da determinação quantitativa dos alcaloides no extrato foram apresentados em mg/100 g de peso seco de extrato.
   3.3. Conteúdo de Fenólicos Totais
   O conteúdo de fenólicos totais (CFT) foi realizado em microplacas transparentes de 96 poços (Nunclon, Nunc, Roskilde, Dinamarca) de acordo com o método previamente descrito, utilizando o reagente fenólico de Folin-Ciocalteu. A absorbância foi medida a 680 nm após 20 min de incubação com o leitor Elisa Infinite Pro 200F (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suíça). O CFT foi determinado usando uma curva padrão preparada para ácido gálico. Os resultados foram expressos em mg de ácido gálico (AG) por 1 g de extrato seco.
   3.4. Conteúdo de Flavonoides Totais
   A determinação de flavonoides totais foi realizada de acordo com o método descrito por Lamaison e Carret com algumas modificações. Resumidamente, 20 µL de amostra preparada foram misturados na microplaca com 80 µL de metanol, 20 µL de solução metanólica de AlCl3 a 2% (v/v) e completados com metanol até o volume de 200 µL. A absorbância foi lida a 430 nm após 30 min de incubação, utilizando a solução contendo metanol no lugar da amostra como branco. As medições foram realizadas usando o leitor de microplacas Infinite Pro 200F (Tecan Group Ltd.). Os resultados são expressos em mg de quercetina (Q) por 1 g de extrato seco.
   3.5. Conteúdo de Taninos
   Para determinar o teor de taninos em nosso extrato aquoso (decocção), dois métodos foram utilizados: o ensaio de vanilina e o método de precipitação de proteínas (precipitação de taninos com pó de pele).

3.6. Teor de Taninos Determinado pelo Método de Precipitação de Proteínas
A análise do teor de taninos foi determinada de acordo com o método de pó de pele descrito na Farmacopeia Polonesa 6ª edição. Os taninos foram estimados indiretamente após adsorção e precipitação com pó de pele insolúvel. O resultado foi expresso em miligrama de pirogalol (PGA) por grama de extrato seco.

3.7. Teor de Taninos Determinado pelo Método Vanilina/HCl
A quantidade de taninos condensados foi determinada utilizando o ensaio de vanilina. A absorbância foi medida a 500 nm após 20 min de incubação. Os resultados foram expressos como mg de catequina (Cat) por 1 g de extrato seco.

3.8. Culturas de Células
Hepatoma humano (HepG2) foi adquirido da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA) e cultivado de acordo com procedimentos descritos anteriormente. Os experimentos foram conduzidos em DMEM com 10% de SBF. A cada 24 h, o meio foi trocado por um novo, com ou sem as concentrações investigadas do extrato. Células de fibroblastos de pele humana (NHDFs) foram adquiridas da Lonza (Walkersville, MD, EUA). NHDFs, células (da terceira à sexta passagem) foram semeadas em placas de 24 poços (1,5–2,0 × 104 células por poço) em FGM-2 com suplementos e 2% de SBF.

3.8.1. Avaliação da Viabilidade Celular (Ensaio MTT)
A viabilidade celular foi avaliada pela determinação da conversão do sal MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, Sigma-Aldrich Chemie, Darmstadt, Alemanha) pela desidrogenase mitocondrial de acordo com procedimento descrito anteriormente. Resumidamente, as células foram incubadas por 72 h em placas de 24 poços com várias concentrações do extrato e, subsequentemente, por mais 2 h com 0,5 mg/mL de solução de MTT, que é convertido em células vivas sob o efeito da desidrogenase mitocondrial em formazano insolúvel. O corante convertido foi então solubilizado em HCl 0,04 M em isopropanol absoluto. A absorbância do formazano solubilizado foi medida espectrofotometricamente a 570 nm (leitor de microplacas BioTek Epoch, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA). A viabilidade celular foi calculada como uma porcentagem em relação ao controle (células incubadas em DMEM sem soro sem extratos). A viabilidade celular relativa (%) foi calculada como [A]/[B] × 100, onde [A] é a absorbância da amostra teste e [B] é a absorbância da amostra controle contendo as células não tratadas.

3.8.2. Exame Microscópico
O exame microscópico das alterações na morfologia celular foi avaliado em luz visível conforme descrito anteriormente. A avaliação de células viáveis e mortas por fluorescência foi realizada após coloração com calceína-AM e iodeto de propídio (PI), de acordo com o protocolo da MoBiTec (Gottingen, Alemanha). As imagens digitais das células viáveis foram visualizadas usando o microscópio invertido de contraste de fase Eclipse TS 100F (Nikon, Melville, NY, EUA) equipado com a câmera Nikon Digital Sight DS-U2 utilizando o software NIS-Elements Nikon BR 2.30 (Nikon).
3.8.3. Ensaio de Apoptose por Anexina V-FITC/PI
A apoptose foi avaliada pelo Kit Anexina V-FITC (Becton Dickinson, San Diego, CA, EUA). As células foram incubadas com extrato de Uncaria tomentosa por 72 h em placas de 12 poços. Após a exposição, o meio de cultura foi removido e as células foram coletadas por tripsinização com 0,05% de Tripsina-EDTA e centrifugadas a 2000 rpm por 10 min. A análise por citometria de fluxo foi realizada dentro de 1 h, contando 5000 eventos por amostra. Os dados foram posteriormente analisados usando o software CELL-Quest no citômetro de fluxo FACS Calibur e o software Cell Quest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Os resultados foram apresentados como taxas de células em apoptose inicial (Anexina V-positivas) e apoptose tardia (Anexina V e PI-positivas).
3.8.4. Medição da Produção de ROS
A produção de ROS foi medida pela avaliação da conversão e oxidação de DCFH2-DA a DCF, conforme descrito anteriormente. O DCFH2-DA penetra facilmente nas células, sofrendo conversão por esterase em DCFH2, que na presença de ROS é oxidado a DCF altamente fluorescente. Células cultivadas em placas de 12 poços em DMEM sem soro foram lavadas com PBS e incubadas por 1 h em DMEM com concentrações investigadas do extrato, e subsequentemente por 2 h com 250 µM de DCFH2-DA (diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína) em HBSS (solução salina balanceada de Hank). A medição da fluorescência foi iniciada imediatamente após a adição de DCFH2-DA, utilizando um leitor de microplacas (Synergy 4, BioTek Inc.) equipado com o software Gen5 (BioTech Instruments Inc., Winooski, VT, EUA) em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e emissão de 530 nm, com leituras a cada 15 min.
3.8.5. Medição do Nível de GSH
As células foram incubadas em placas de 24 poços em DMEM sem soro com o extrato testado em várias concentrações) por 4 h. O nível de GSH foi avaliado utilizando o protocolo do kit de ensaio de glutationa (Sigma-Aldrich Chemie, Darmstadt, Alemanha). A medição da absorbância foi realizada a 412 nm usando um leitor de microplacas (Synergy 4, BioTek Inc.). Os resultados foram expressos em relação à quantidade de proteína na amostra usando o protocolo do fabricante do Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA).
3.8.6. Atividade da Caspase-3 e -7
A atividade da caspase-3 e -7 foi medida utilizando o kit de ensaio Caspase-Glo 3/7 (Promega, Madison, WI, EUA). As células foram incubadas em placas de 96 poços em DMEM sem soro e tratadas por 72 h com o extrato. Após a incubação, 100 µl de meio foram removidos e 100 µl de reagente Caspase-Glo foram adicionados. A suspensão final foi misturada por agitação orbital a 300 rpm por 1 min e, em seguida, incubada por 2 h à temperatura ambiente, protegida da luz. A luminescência foi medida usando um leitor de microplacas (Synergy 4, BioTek Inc.). Os resultados foram expressos como unidades relativas de luminescência (RLU) por mg de proteína.
A determinação da atividade da caspase foi realizada com o uso da enzima luciferase de acordo com o protocolo do kit Caspase-Glo 3/7 Assay fornecido pelo fabricante (Promega GmbH, Mannheim, Alemanha). A medição da luminescência foi realizada em lisados celulares preparados a partir de células incubadas em placas de 96 poços por 4 h com o extrato testado. A intensidade da luminescência é proporcional à atividade da caspase.
3.8.7. Medição da forma ativa do NF-κB
A medição quimioluminescente da forma ativa do NF-κB foi realizada de acordo com o protocolo do kit NF-κB p65 ELISA (Enzo Life Sciences, Farmigdale, NY, EUA) em lisados celulares preparados a partir de células incubadas por 4 h com o extrato testado. Os resultados são apresentados em relação aos níveis de proteína nas amostras, medidos pelo método de Bradford.
3.8.8. Análise Estatística
Os resultados são apresentados como médias experimentais e DP. A significância estatística das diferenças observadas foi avaliada por análise de variância (ANOVA) de uma via com o teste post-hoc de Tukey (Statistica ver. 8, StatSoft, Kraków, Polônia) e foi aceito como significativo p < 0.05.
4. Conclusões
Extratos de plantas e substâncias derivadas de plantas, e sua utilidade em pacientes sob terapias anticancerígenas estão agora atraindo grande atenção. Eles mostraram efeitos promissores quando combinados com quimioterapia e podem beneficiar pacientes com carcinoma hepatocelular.
Uncaria tomentosa, também conhecida como “cat’s claw” e “uña de gato”, é uma planta peruana da família Rubiaceae, cuja casca, raízes e folhas são comumente utilizadas pela população local na América do Sul devido à sua ação imunomoduladora, anticancerígena e anti-inflamatória. Relatos anteriores dos efeitos da Uncaria tomentosa em células cancerígenas focam em estudos de extratos de casca e raízes (com alto teor de alcaloides), enquanto suas folhas contêm compostos ativos semelhantes e material apropriado poderia ser coletado sem danos significativos à planta. No entanto, diferenças no conteúdo de polifenóis entre casca e folhas, bem como entre extratos aquosos e alcoólicos, foram relatadas. O extrato utilizado no presente estudo foi preparado de acordo com o procedimento comumente aceito para preparação de decocção. Ele é livre de alcaloides tetracíclicos, enquanto contém alcaloides oxindólicos pentacíclicos e taninos condensados.
Este extrato demonstrou ser citotóxico contra células cancerosas e induzir estresse oxidativo em células cancerosas, mas não em células normais. Em células cancerosas, o extrato ativa as caspases efetoras 3 e 7, que executam a apoptose através da clivagem de substratos proteicos que incluem mediadores e reguladores da apoptose, proteínas estruturais, bem como proteínas relacionadas ao reparo do DNA e ao ciclo celular. Além disso, em células cancerosas, mas não em normais, foi observada uma redução na forma ativa do NF-κB. A inibição da atividade do NF-κB pode prevenir o desenvolvimento de resistência das células cancerosas à quimioterapia. A decocção estudada de Uncaria tomentosa aumenta a citotoxicidade do CDDP contra células HepG2, enquanto a incubação de células NHDF com este extrato previne a redução de sua viabilidade devida ao CDDP. Esses resultados indicam que a decocção das folhas de Uncaria tomentosa modula de forma diferente o metabolismo oxidativo de células cancerosas e normais e aumenta a citotoxicidade do CDDP contra células cancerosas. Todo composto ou combinação de diferentes compostos que seja capaz de ser mais eficaz contra células cancerosas do que contra células não hiperplásicas pode oferecer novas oportunidades terapêuticas. Estudos adicionais são necessários para descrever os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos observados e demonstrar a utilidade potencial do extrato estudado no aumento da sensibilidade das células cancerosas ao tratamento e/ou na prevenção do desenvolvimento de resistência a medicamentos. Em geral, os princípios ativos dos fitofármacos utilizados na etnomedicina são em grande parte desconhecidos, e o extrato vegetal é considerado como princípio ativo. O extrato vegetal é uma mistura de compostos ativos, e sua ação conjunta pode mediar a atividade farmacêutica. No entanto, o isolamento dos compostos ativos deve ser o próximo passo para elucidar a base fitoquímica dos efeitos observados no presente estudo.

Disponibilidade de Amostras: Amostras dos compostos não estão disponíveis junto aos autores.

Contribuições dos Autores
Conceberam e desenharam os experimentos: A.K. e G.N. Realizaram os experimentos: A.K., E.C., M.K., K.G., W.P. e R.N. Analisaram os dados: A.K., K.G., W.P. e R.N. Escreveram o artigo: A.K. e G.N.

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências
Uncaria tomentosa (Willd.) DC. Uso etnomedicinal e novos resultados farmacológicos, toxicológicos e botânicos
Etnobotânica, fitoquímica e farmacologia de Uncaria (Rubiaceae)
Atividade anti-vírus da hepatite B do ácido clorogênico, ácido quínico e ácido cafeico in vivo e in vitro
Um princípio ativo dos extratos aquosos de Unha-de-Gato. Identificação e eficácia do ácido quínico
Atividade protetora dos extratos de Uncaria tomentosa em eritrócitos humanos sob estresse oxidativo induzido por 2,4-diclorofenol (2,4-DCP) e catecol
Indução de apoptose e inibição da proliferação em células tumorais humanas tratadas com extratos de Uncaria tomentosa
Os efeitos antiproliferativos de extratos e frações de Uncaria tomentosa no crescimento da linhagem de células de câncer de mama
Indução de apoptose por Uncaria tomentosa através da produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de citocromo c e ativação de caspases em células de leucemia humana
Atividade antiproliferativa de várias preparações de Uncaria tomentosa em células de leucemia promielocítica HL-60
Atividade anticancerígena de preparações de Uncaria tomentosa (Willd.) DC. com diferentes composições de alcaloides oxindólicos
Alcaloides oxindólicos de Uncaria tomentosa induzem apoptose em células de leucemia linfoblástica aguda em proliferação, paradas em G0/G1 e que expressam bcl-2
Efeitos antiproliferativos da mitrafilina, um alcaloide oxindólico pentacíclico de Uncaria tomentosa, em linhagens celulares de glioma humano e neuroblastoma
Atividades mutagênicas e antimutagênicas de Uncaria tomentosa e seus extratos
Uncaria tomentosa exerce extensos efeitos antineoplásicos contra o tumor Walker-256 modulando o estresse oxidativo e não pela atividade alcaloídica
Tratamento de carcinoma hepatocelular
Extratos metanólicos de Uncaria rhynchophylla induzem citotoxicidade e apoptose em células de carcinoma de cólon humano HT-29
Os alcaloides de Uncaria tomentosa e seu efeito estimulante da fagocitose
Efeito citotóxico do alcaloide oxindólico pentacíclico mitrafilina isolado da casca de Uncaria tomentosa em linhagens celulares de sarcoma de Ewing humano e câncer de mama
Alcaloides oxindólicos pentacíclicos de Uncaria tomentosa induzem células endoteliais humanas a liberar um fator regulador da proliferação de linfócitos
Uncaria tomentosa para redução de efeitos colaterais causados pela quimioterapia em pacientes com CCR: Ensaio clínico
Taninos: Classificação e definição
Avaliação da citotoxicidade de nanopartículas de ferro encapsuladas em carbono em células de carcinoma pulmonar de Lewis
Estresse oxidativo, inflamação e câncer: Como estão interligados?
Unha-de-gato inibe a produção de TNF-alfa e sequestra radicais livres: Papel na citoproteção
O ácido quínico é um componente biologicamente ativo do extrato C-Med 100® de Uncaria tomentosa
Uncaria tomentosa atua como um potente inibidor de TNF-α através do NF-κB
Aspectos toxicológicos das ervas sul-americanas unha-de-gato (Uncaria tomentosa) e Maca (Lepidium meyenii): uma sinopse crítica
Procianidinas de semente de uva atuam como agentes anti-inflamatórios em macrófagos RAW 264.7 estimulados por endotoxina, inibindo a via de sinalização do NF-κB
Atividade biológica e composição de chás e tinturas preparados a partir de Rosa rugosa Thunb
Teores dos principais flavonoides das flores de Crataegus monogyna Jacq e de Crataegus laevigata (Piret DC) em função da vegetação
Efeito do método de extração no teor de fenólicos e na atividade antioxidante de extratos de visco de Viscum album subsp. Abietis
Uma avaliação crítica das reações vanílicas em um ensaio para tanino em grãos de sorgo
Ação pró-oxidativa e pró-apoptótica de sementes desengorduradas de Oenothera paradoxa em células de melanoma de pele humana
Estudos comparativos de citotoxicidade de nanopartículas de ferro encapsuladas em carbono em células de glioma murino
Medicina herbal chinesa e quimioterapia no tratamento do carcinoma hepatocelular: Uma meta-análise de ensaios clínicos randomizados

Análise por HPLC de alcaloides em extrato aquoso de folhas de Uncaria tomentosa.

Viabilidade celular avaliada pela conversão mitocondrial do MTT. Células NHDF e HepG2 foram tratadas com extrato de folhas de Uncaria tomentosa (30–1160 µg/mL) por 72 h a 37 °C. Em seguida, a atividade metabólica mitocondrial das células foi medida pelo ensaio de MTT. Os dados são expressos como média ± DP de três experimentos independentes realizados em triplicata. Diferenças estatisticamente significativas: * p < 0,05 e ** p < 0,001 referem-se ao controle (células não tratadas).

Alterações morfológicas das células NHDF (a–f) e HepG2 (g–l) após tratamento com extrato de Uncaria tomentosa. Células não tratadas (a,g) observadas ao microscópio óptico (100×); (b,h) em fluorescência (200×) após coloração com calceína-AM, (c,i) em fluorescência (200×) após coloração com IP. Células tratadas com 145 µg/mL do extrato observadas em fluorescência após coloração com calceína-AM (e,k) e IP (f,l), respectivamente. A calceína em células viáveis emite fluorescência verde, enquanto o IP emite fluorescência vermelha apenas em células mortas.

O número de células HepG2 em apoptose inicial (An+/IP−) e tardia (An+/IP+) avaliado usando coloração com anexina V-FITC/IP seguida por análise de citometria de fluxo. As células foram tratadas com extrato de folhas de Uncaria tomentosa por 72 h. Os dados são expressos como média ± DP de dois experimentos independentes realizados em triplicata. Diferença estatisticamente significativa * p < 0,05 refere-se às células controle (não tratadas). Histogramas representativos de células controle e células tratadas com o extrato (72,5–580 µg/mL) são mostrados.

Formação de ROS em (a) células NHDF e (b) células HepG2 tratadas com extrato de folhas de Uncaria tomentosa. As células foram expostas ao extrato (30–145 µg/mL) por 1 h a 37 °C e, em seguida, foram tratadas com 250 µM de DCFH-DA. O controle representa células não tratadas. Os resultados são apresentados como médias de três experimentos independentes realizados em triplicata. O nível de significância foi * p < 0,05 em comparação ao controle (células não tratadas).

Influência do extrato de folhas de Uncaria tomentosa sobre os níveis de GSH em células HepG2 e NHDF. As células foram tratadas com o extrato testado (30–145 µg/mL) por 4 h a 37 °C e a concentração intracelular de GSH foi medida conforme descrito na seção Materiais e Métodos. Os dados são expressos como média ± DP de dois experimentos independentes realizados em triplicata. Diferença estatisticamente significativa ** p < 0,001 refere-se ao controle (células não tratadas).

Alterações na atividade da caspase-3 e caspase-7 em células HepG2 e NHDF após 4 h de incubação a 37 °C com extrato de folhas de Uncaria tomentosa (30–145 µg/mL) de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados são apresentados como média ± DP de dois experimentos independentes realizados em triplicata. Diferenças estatisticamente significativas: ** p < 0,001 referem-se ao controle (células não tratadas).
Alterações na atividade de NF-κB em células HepG2 e NHDF tratadas por 4 h a 37 °C com extrato de folhas de Uncaria tomentosa (30–145 µg/mL) de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados são expressos como média ± DP de três experimentos independentes realizados em triplicata. Diferenças estatisticamente significativas: * p < 0,05 em relação ao controle (células não tratadas).

Resultados do ensaio de MTT (viabilidade celular) em NHDF e HepG2 tratadas por 72 h a 37 °C com concentração selecionada do extrato de folhas de Uncaria tomentosa (72,5–145 μg/mL) e nas últimas 48 h também com CDDP (IC50 de 11,25 μM de CDDP para HepG2 determinada em nosso laboratório foi utilizada). Os dados são expressos como média ± DP de três experimentos independentes realizados em triplicata. Diferenças estatisticamente significativas: * p < 0,05 em relação às células tratadas apenas com CDDP.

Conteúdo total de compostos fenólicos (CFT), flavonoides (FT) e tanino condensado (TC) no extrato seco (aquoso) de folhas de Uncaria tomentosa medido por ensaios colorimétricos e expresso como mg de ácido gálico (AG/g de extrato seco), mg de quercetina (Q/g de extrato seco), mg de catequina (Cat/g de extrato seco) e mg de pirogalol (PGA/g de extrato seco), respectivamente. Os dados são média ± DP de três experimentos independentes.

Amostra Compostos Fenólicos Totais CFT (mg AG/g de Extrato Seco) Flavonoides Totais FT (mg Q/g de Extrato Seco) Tanino Condensado TC Método Vanilina/HCl (mg Cat/g de Extrato Seco) Método de Precipitação de Proteínas (mg PGA/g de Extrato Seco) Extrato seco aquoso de folhas de Uncaria tomentosa 242,37 ± 0,36 2,26 ± 0,09 21,81 ± 0,41 110,0 ± 2,0