pmid: "38225717"
title: "Via de Sinalização de Nodulação 1 e 2 Modulam o Acúmulo e Tolerância ao Vanádio em Leguminosas."
authors: "Liu P, Zhang X, Lin L, Cao Y, Lin X, Ye L, Yan J, Gao H, Wen J, Mysore KS, Liu J"
journal: "Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany)"
pubdate: "2024 Mar"
doi: "10.1002/advs.202306389"
source: "PMC Full Text"

Via de Sinalização de Nodulação 1 e 2 Modulam o Acúmulo e Tolerância ao Vanádio em Leguminosas.

Autores

Liu P, Zhang X, Lin L, Cao Y, Lin X, Ye L, Yan J, Gao H, Wen J, Mysore KS, Liu J

Periodico

Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) (2024 Mar)

Conteudo

Nodulation Signaling Pathway 1 e 2 Modulam o Acúmulo e a Tolerância de Leguminosas ao Vanádio

Resumo
A poluição por vanádio (V) potencialmente ameaça a saúde humana. Aqui, constata-se que nsp1 e nsp2, mutantes defeituosos na simbiose com Rhizobium de Medicago truncatula, são sensíveis ao V. As concentrações de fósforo (P), ferro (Fe) e enxofre (S) com V estão negativamente correlacionadas na parte aérea do tipo selvagem R108, mas não nos brotos dos mutantes nsp1 e nsp2. Mutações nos transportadores de P das famílias PHT1, PHO1 e VPT, no transportador de Fe IRT1 e na família de transportadores de S SULTR1/3/4 conferem diferentes graus de tolerância ao V nas plantas. Entre essas famílias gênicas, MtPT1, MtZIP6, MtZIP9 e MtSULTR1;1 nas raízes de R108 são significativamente inibidos pelo estresse de V, enquanto MtPHO1;2, MtVPT2 e MtVPT3 são significativamente induzidos. A superexpressão de VPT1 de Arabidopsis thaliana ou MtVPT3 de M. truncatula aumenta a tolerância das plantas ao V. No entanto, a resposta desses genes ao V é enfraquecida em nsp1 ou nsp2 e influenciada por microrganismos do solo. Mutações nos NSPs reduzem a diversidade rizobacteriana sob estresse de V e simplificam os módulos de unidades taxonômicas operacionais responsivas ao V em redes de co-ocorrência. Além disso, R108 recruta mais rizobactérias benéficas relacionadas a V, P, Fe e S do que nsp1 ou nsp2. Assim, os NSPs podem modular o acúmulo e a tolerância de leguminosas ao V por meio de transportadores de P, Fe e S, homeostase iônica e respostas da comunidade rizobacteriana.
A poluição por vanádio (V) potencialmente ameaça a saúde humana por meio da cadeia alimentar. Este estudo revela os mecanismos pelos quais a Via de Sinalização de Nodulação 1 (NSP1) e a NSP2 regulam o acúmulo de V e a tolerância de leguminosas ao V, regulando a expressão de genes transportadores de P, S e Fe de maneira dependente da simbiose com Rhizobium e do microbioma rizosférico.

Introdução
O vanádio (V) é um metal estratégico, amplamente utilizado como matéria-prima e aditivo em indústrias como a aeroespacial e de defesa.[ ] Nos últimos anos, devido à extensa mineração de V e à extração e combustão de combustíveis fósseis, a quantidade de V emitida no ambiente pelos humanos excedeu em muito os níveis naturais de fundo. Isso levou ao aumento da poluição por V.[ ] O V possui vários estados de valência, de -1 a +5, dos quais o pentavalente é a forma mais comum no ambiente, mas também a mais móvel e tóxica.[ ] O V é facilmente absorvido e acumulado pelas plantas, causando retardo no crescimento, deformação radicular, amarelecimento e murcha.[ ] Além disso, pode facilmente ameaçar a saúde humana por meio da cadeia alimentar, pois a absorção excessiva dele pode aumentar a probabilidade de uremia e câncer de pulmão.[ ] Portanto, mais atenção deve ser dada à redução da absorção e acúmulo de V nas plantas.
Como o V é semelhante em estrutura e carga elétrica ao fosfato (P), especula-se que o V possa ser absorvido pelas plantas através do sistema de absorção de P em competição com o P.[ ]
Aihemaiti, et al. descobriram que a absorção de P pelo capim-bristle foi significativamente reduzida sob exposição a altos níveis de V.[ ]
Nawaz, et al. também encontraram resultados semelhantes em melancia.[ ]
Além disso, estudos anteriores descobriram que o acúmulo de V também está relacionado ao acúmulo de ferro (Fe), enxofre (S) e cálcio (Ca).[ ]
O P é principalmente adquirido, translocado e armazenado pelos membros das famílias PHOSPHATE‐TRANSPORTER1 (PHT1), PHOSPHATE 1 (PHO1) e VACUOLAR PHOSPHATE TRANSPORTER (VPT), respectivamente.[ ]
A proteína da família ZINC‐IRON PERMEASE (ZIP) denominada IRON‐REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) é essencial para a absorção de Fe do solo pelas plantas.[ ]
Membros da família SULFATE TRANSPORTER (SULTR) medeiam a absorção e translocação de sulfato (SO4 2−) em plantas superiores.[ ]
No entanto, até o momento, faltam evidências genéticas que apoiem que esses transportadores possam regular a absorção, o acúmulo e a tolerância ao V nas plantas.
Rizobactérias podem desintoxicar o V e reduzir seu acúmulo por meio de mudança de valência, quelação e promoção dos nutrientes que as plantas absorvem.[ ]
Pesquisas anteriores mostraram que a inoculação com Arthrobacter sp. 5k4‐8‐1 pode converter V pentavalente em V tetravalente, reduzindo significativamente a biodisponibilidade e migração do V, diminuindo assim a toxicidade e o acúmulo de V na alfafa.[ ]
Outro estudo mostrou que a inoculação com Serratia PRE01 ou Arthrobacter PRE05 pode melhorar a tolerância ao V em Brassica juncea ao aumentar a síntese de antioxidantes.[ ]
No ambiente natural, no entanto, os microrganismos existem como comunidades, e a abundância e a função de microrganismos individuais são influenciadas por outros microrganismos, espécies de plantas e seus genótipos.
No entanto, a resposta, a função e a regulação genética das comunidades rizobacterianas sob exposição ao V ainda estão sendo exploradas.
Legumes são fontes importantes de proteína para humanos e animais. Reduzir a absorção e o acúmulo de V em leguminosas é, portanto, importante para a segurança alimentar global. A simbiose com Rhizobium pode não apenas fixar nitrogênio, mas também regular a tolerância e o acúmulo de metais pesados em leguminosas.[ ] Liu et al. mostraram que a simbiose com Rhizobium poderia melhorar significativamente a tolerância ao arsênio (As) de Medicago truncatula e reduzir o acúmulo de As na parte aérea.[ ] A simbiose com Rhizobium também foi relatada por melhorar a tolerância da alfafa e da soja ao cádmio, chumbo, zinco e cobre.[ ] No entanto, seu papel na absorção e acúmulo de V em leguminosas ainda não está claro. Na ausência ou limitação de molibdênio (Mo), o uso de V em vez de Mo no sítio ativo da nitrogenase pode desempenhar um papel mais proeminente na fixação de nitrogênio.[ ] Portanto, a simbiose Rhizobium–leguminosa tem o potencial de absorver e utilizar V como um elemento benéfico, mas, ao mesmo tempo, é possível que V cause danos a outros órgãos. Assim, a simbiose com Rhizobium pode melhorar a tolerância ao V em leguminosas e regular a distribuição e o acúmulo de V nas plantas para minimizar a toxicidade do V. Até o momento, muitos genes que regulam a simbiose com Rhizobium foram identificados, incluindo NODULATION SIGNALING PATHWAY 1 (NSP1), NSP2, NODULE INCEPTION (NIN) e AURORA KINASE 1 (AUR1), mas se eles podem regular a absorção e tolerância ao V em leguminosas permanece desconhecido.[ ]
Considerando as questões acima, analisamos as diferenças na tolerância e acúmulo de V entre M. truncatula tipo selvagem R108 e os mutantes defectivos na simbiose com Rhizobium nsp1 e nsp2. Além disso, a relação entre V e o acúmulo de P, Fe, S e Ca foi analisada. Em seguida, focando nos elementos nutricionais mais associados ao acúmulo de V, o papel de vários nutrientes na regulação da tolerância ao V foi confirmado geneticamente através da triagem de uma série de mutantes relacionados e da medição da expressão de genes relacionados. Finalmente, analisamos a diversidade de rizobactérias, inferimos redes de co-ocorrência e realizamos uma análise de correlação entre rizobactérias e concentrações de elementos nas plantas. O objetivo foi elucidar o mecanismo molecular pelo qual NSP1 e NSP2 medeiam a simbiose com Rhizobium regulando a tolerância ao V em leguminosas, a partir dos níveis de regulação genética e microbiana da rizosfera, e fornecer novas ideias para o manejo ambientalmente sustentável da poluição por V e da saúde humana.
Resultados
Mutações de NSP1 e NSP2 Afetam a Tolerância e o Acúmulo de V nas Plantas
Para investigar os efeitos da simbiose com Rhizobium mediada por mutações em NSP1 e NSP2 no acúmulo e tolerância ao V em leguminosas, foi aplicado um gradiente de tratamentos com V (0, 20, 200 e 2000 mg L−1) em plantas de M. truncatula do tipo selvagem R108 e mutantes nsp1 e nsp2, utilizando solo natural como substrato e um experimento controle em vaso (Figura 1; Figura S1, Informações de Suporte). Uma alta concentração de V (2000 mg L−1) resultou na morte das plantas. No entanto, a condição da parte aérea e das raízes de R108 foi significativamente melhor do que a de nsp1 e nsp2 (Figura 1a,b). Não houve diferença significativa na biomassa entre R108, nsp1 e nsp2 sob tratamento com baixo teor de V (Figura 1c). Entretanto, a biomassa da parte aérea e das raízes de nsp1 e nsp2 foi significativamente menor do que a de R108 quando a concentração do tratamento com V foi superior a 200 mg L−1. Além disso, detectamos espécies reativas de oxigênio (ROS) nos tecidos por microscopia confocal usando H2DCFDA (diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína). Os resultados mostraram que o estresse de curto prazo com 100 mg L−1 de V foi mais propenso a causar acúmulo de ROS em nsp1 e nsp2 do que no tipo selvagem R108 (Figura 1d,e). Adicionalmente, analisamos os efeitos do estresse por V na fotossíntese através dos parâmetros de fluorescência da clorofila F0, Fm e das razões Fv/Fm (Figura S2, Informações de Suporte). Os resultados das razões Fv/Fm mostraram que o estresse de curto prazo por V não teve efeito significativo na eficiência fotossintética (Figura S2c,f, Informações de Suporte). No entanto, diferentemente de R108, a Fm em nsp1 e nsp2 diminuiu significativamente sob estresse por V, indicando que o transporte de elétrons no fotossistema II (PS II) de nsp1 e nsp2 foi significativamente prejudicado (Figura S2b,e, Informações de Suporte). Esses resultados indicaram plenamente que mutações em NSP1 e NSP2 reduzem a tolerância das plantas ao V.

Mutações em NSP1 e NSP2 aumentam a sensibilidade ao vanádio (V). a,b) Fenótipos da parte aérea (a) e das raízes (b) de plantas de Medicago truncatula do tipo selvagem (R108) e mutantes nsp1 e nsp2 sob diferentes condições de V. Mudas com quatro semanas de idade foram tratadas com as concentrações indicadas de V por uma semana. Barras, 2 cm. c) Biomassa de plantas R108, nsp1 e nsp2 sob diferentes condições de V. As plantas foram tratadas conforme descrito em (a) e (b). As concentrações de tratamento com V foram 0 mg L−1 (V0), 20 mg L−1 (V20), 200 mg L−1 (V200) e 2000 mg L−1 (V2000). Os dados são expressos como valores de média ± DP (n = 6). Letras diferentes acima das barras indicam diferenças significativas a P < 0,05 (teste de Duncan). d,e) ROS intracelular nas folhas (d) e raízes (e) de plantas R108, nsp1 e nsp2 detectadas usando diacetato de 2′−7′ diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA). Mudas com três semanas de idade foram cultivadas com solução nutritiva de Hoagland em meia-concentração preparada com extrato de solo. Após a nodulação de R108, as plantas foram tratadas com (+V) ou sem (−V) 100 mg L−1 de V por 2 dias. Em seguida, folhas e raízes foram obtidas para detecção de ROS. As setas indicam onde as ROS se acumularam nos tecidos.
Devido à morte de algumas plantas tratadas com 2000 mg L−1 de V e à impossibilidade de medir com precisão os indicadores físicos e químicos, medimos as concentrações de V em plantas tratadas com 0, 20 e 200 mg L−1 de Na3VO4 (Figura 2). Não houve diferença significativa nas concentrações de V entre as raízes de R108, nsp1 e nsp2 quando a concentração do tratamento foi de 20 mg L−1 (Figura 2a). No entanto, a concentração de V nos brotos de R108 aumentou significativamente e foi significativamente maior do que nos brotos de nsp1 e nsp2. Além disso, nsp1 e nsp2 ambos apresentaram um fenótipo mais pronunciado de sensibilidade ao V do que R108, pois as concentrações de V nos brotos e raízes foram significativamente maiores do que em R108 quando a concentração de tratamento de V atingiu 200 mg L−1 (Figuras 1 e 2a). O coeficiente de transporte mostrou que a eficiência do transporte de V da raiz para o broto em nsp1 e nsp2 foi menor do que em R108, especialmente em nsp2 (Figura 2b). Esses resultados indicaram que a absorção e o acúmulo de V em M. truncatula podem ser afetados por mutações em NSP1 e NSP2.

As mutações NSP1 e NSP2 alteram o acúmulo de vanádio (V) e as correlações da concentração de V com as concentrações de fósforo (P), ferro (Fe), enxofre (S) e cálcio (Ca). a) A concentração de V nos brotos e raízes de plantas de Medicago truncatula do tipo selvagem (R108), nsp1 e nsp2 com 5 semanas de idade, tratadas com diferentes concentrações de V por uma semana. As concentrações de tratamento de V foram 0 mg L−1 (V0), 20 mg L−1 (V20) e 200 mg L−1 (V200). b) O fator de translocação de V das raízes para os brotos das plantas R108, nsp1 e nsp2. Os dados foram calculados a partir das razões broto‐raiz das concentrações de V em (a). c–f) Concentrações de P, Fe, S e Ca nos brotos e raízes de plantas do tipo selvagem (R108) e mutantes nsp1 e nsp2 descritas em (a). Os dados em (a–f) são expressos como valor médio ± DP (n = 4). A significância estatística é indicada por asteriscos com base em testes t de amostras independentes (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001). g–i) Análise de correlação da concentração de V com P, Fe, S e Ca nos brotos do tipo selvagem (R108) (g), nsp1 (h) e nsp2 (i) e raízes de j) R108, k) nsp1 e l) nsp2 usando os dados em (a) e (c–f).
As Mutações NSP1 e NSP2 Enfraquecem ou Alteram as Concentrações Correlacionadas de P, Fe e S com V
O acúmulo e a tolerância de V nas plantas estão intimamente relacionados com P, Fe, S e Ca. Para investigar a mudança na absorção e no acúmulo de V causada por NSP1 e NSP2, os níveis de P, Fe, S e Ca também foram determinados. No geral, sob estresse de V, as diferenças nas concentrações de P e Fe entre R108, nsp1 e nsp2 foram mais significativas, seguidas pelas diferenças em S e Ca (Figura 2c–f). Além disso, as diferenças entre esses elementos foram refletidas principalmente nos brotos. Em condições normais, os níveis de P, Fe e S nos brotos foram maiores em R108 do que em nsp1 e nsp2, especialmente P e S (Figura 2c–e). No entanto, o tratamento com V a 20 mg L−1 resultou em uma diminuição significativa nas concentrações de P, Fe, S e Ca nos brotos de R108, mas os efeitos sobre nsp1 e nsp2 foram relativamente fracos ou até mesmo opostos (Figura 2c–f). Portanto, as concentrações de P, Fe, S e Ca nos brotos de R108 foram significativamente menores do que nas dos brotos de nsp1 e nsp2. Embora as concentrações de P, Fe, S e Ca nos brotos de R108 tenham aumentado sob tratamento com V a 200 mg L−1, as concentrações de P e Fe nos brotos de R108 ainda foram significativamente menores do que nas dos brotos de nsp1 e nsp2. Em comparação com o tratamento com V a 20 mg L−1, o tratamento com V a 200 mg L−1 aumentou significativamente a razão P/V, razão Fe/V, razão S/V e razão Ca/V em R108 (Figura S3, Informações de Apoio). No entanto, essa tendência foi invertida em nsp1 e nsp2. As razões P/V, S/V e Ca/V em R108 foram maiores do que em nsp1 e nsp2 sob tratamento com V a 200 mg L−1. A análise de correlação mostrou que as concentrações de V nos brotos de R108 foram significativamente correlacionadas negativamente com as concentrações de P, Fe e S, mas não significativamente correlacionadas com a concentração de Ca (Figura 2g). Mutações em NSP1 e NSP2 atenuaram essas associações e até mesmo foram ligadas ao resultado oposto ao observado em R108 (Figura 2g–i). No entanto, não houve correlação significativa nas raízes de R108 entre as concentrações de V e as concentrações de P, Fe, S e Ca (Figura 2j). Embora a correlação nas raízes de nsp2 também não tenha sido significativa, a mutação de NSP1 aumentou significativamente as correlações da concentração de V com as concentrações de P e S nas raízes (Figura 2k,l). No entanto, a tendência foi oposta à observada em R108 (Figura 2j,k). Assim, as mutações de NSP1 e NSP2 interrompem a resposta de P, Fe e S ao acúmulo de V nas plantas.
A Sensibilidade ao V e o Acúmulo de Elementos dos Mutantes nsp1 e nsp2 são Afetados por P, Fe e Ca.
Para esclarecer os efeitos regulatórios de P, Fe e S no acúmulo de V e na tolerância ao V em plantas, investigamos os efeitos de diversas condições de P, Fe e S na sensibilidade ao V e no acúmulo de elementos em R108, nsp1 e nsp2. A análise de fluorescência da clorofila foi realizada nas folhas das plantas após 16 horas de tratamento de curta duração com V sob baixo P, Fe ou S (Figura 3). Os resultados mostraram que o Fm do tipo selvagem R108 sob estresse por V foi significativamente reduzido pelo tratamento com baixo P, Fe ou S, indicando que o transporte de elétrons do PS II foi significativamente prejudicado (Figura 3b,e). Importante, a deficiência de Fe ou S exacerbou ainda mais a inibição do Fm em nsp1 e nsp2 pelo estresse por V. Os tratamentos com baixo P, Fe ou S tiveram pouco efeito nas relações Fv/Fm em R108 (Figura 3c,f). No entanto, as relações Fv/Fm em nsp1 e nsp2 sob estresse por V foram reduzidas em graus variados pelo tratamento com baixo Fe ou baixo S, indicando uma diminuição na eficiência fotossintética. Esses resultados indicam que a deficiência de P, Fe ou S pode aumentar a sensibilidade do aparato fotossintético das plantas ao estresse por V, enquanto nsp1 e nsp2 são mais sensíveis à deficiência de Fe ou S.
A deficiência de fósforo (P), ferro (Fe) ou enxofre (S) aumenta a sensibilidade das plantas ao estresse por vanádio (V). a–c) Imagens de F0 (a), Fm (b) e relações Fv/Fm (c) nas folhas de plantas do tipo selvagem (R108) e dos mutantes nsp1 e nsp2 de Medicago truncatula. Mudas de três semanas de idade foram cultivadas com solução nutritiva de Hoagland a meia força preparada com extrato de solo. Após a nodulação de R108, as plantas foram tratadas com 100 mg L−1 de V (+V) sob condições de baixo P (LP, 1 µm PO4
3−), baixo Fe (L-Fe, 1 µm Fe2+) ou baixo S (LS, 1 µm SO4
2−) por 16 h. Em seguida, as folhas foram obtidas para imageamento da fluorescência da clorofila. d–f) Análise estatística de F0 (d), Fm (e) e relações Fv/Fm (f) em (a-c). Os dados são expressos como média ± DP (n = 4). Letras diferentes acima das barras indicam diferenças significativas a P < 0,05 (teste de Duncan).
Além disso, analisamos os efeitos do tratamento de longo prazo com diferentes concentrações de P, S ou Fe na sensibilidade ao V de R108, nsp1 e nsp2. Além disso, a coloração com DAB (3,3‐diaminobenzidina) foi realizada para analisar a produção de ROS. De acordo com o caso de morte foliar e acúmulo de ROS nos tecidos, a redução da concentração de P no ambiente aumentou significativamente a sensibilidade das plantas ao estresse por V, especialmente o tipo selvagem R108 (Figuras S4a e S5, Informações de Suporte). Ao contrário, a tolerância ao V das plantas foi mais forte em condições de alto P. Os fenótipos de nsp1 e nsp2, que eram mais sensíveis ao V do que R108, tenderam a aparecer mais em condições de alto P. No entanto, o estado de crescimento de nsp1 e nsp2 não foi pior do que o de R108 sob condição de alto P sem V (Figura S6, Informações de Suporte). A concentração de V nos brotos de nsp1 e nsp2 foi maior do que a de R108 tanto em condições de alto quanto de baixo P (Figura S4b, Informações de Suporte). Curiosamente, a mudança no nível total de P foi muito consistente com a do V (Figura S4b,c, Informações de Suporte). Condições de alto P aumentaram significativamente a razão P/V do tipo selvagem R108, mas não tiveram efeito significativo sobre nsp1 e nsp2 (Figura S4d, Informações de Suporte). Assim, a razão P/V pode explicar melhor as mudanças na tolerância das plantas do que apenas o P ou o V.
Semelhante à deficiência de P, a deficiência de Fe também aumentou o grau de estresse por V nas plantas (Figura S7a, Informações de Apoio).
De acordo com o caso de morte foliar e acúmulo de ERO nos tecidos, os fenótipos sensíveis a V de nsp1 e nsp2 foram mais proeminentes sob condições de baixo Fe do que sob condições de alto Fe (Figuras S7a e S8, Informações de Apoio).
No entanto, o grau de amarelecimento foliar de nsp1 e nsp2 não foi mais grave do que o de R108 sob condição de baixo Fe sem V (Figura S9, Informações de Apoio).
O fator de translocação de V da raiz para a parte aérea aumentou significativamente em condições de baixo Fe, e o nível de V na parte aérea aumentou, agravando assim os sintomas de toxicidade por V (Figura S7b,c, Informações de Apoio).
Isso foi mais proeminente em nsp1 e nsp2 do que em R108.
Sob condições de alto Fe, V era mais propenso a se acumular na raiz, reduzindo assim seu transporte para a parte aérea.
Exceto na parte aérea de nsp2, a tendência de variação da concentração de P nas plantas foi muito semelhante à de V (Figura S7b,d, Informações de Apoio).
Curiosamente, sob condições de deficiência de Fe, embora o nível de Fe na raiz tenha diminuído significativamente, o nível de Fe na parte aérea aumentou significativamente (Figura S7e, Informações de Apoio).
Comparado com nsp1 e nsp2, a razão Fe/V nas partes aéreas de R108 foi maior e aumentou ainda mais sob a condição de baixo Fe (Figura S7f, Informações de Apoio).
No entanto, a razão Fe/V em nsp1 e nsp2 não respondeu significativamente à condição de baixo Fe.
Além disso, sob condições de baixo Fe, a razão P/V na parte aérea das plantas do tipo selvagem não mudou significativamente, mas diminuiu significativamente na de nsp1 e nsp2.
Portanto, os defeitos de resposta da razão Fe/V e P/V podem ser razões importantes para o aumento da sensibilidade de nsp1 e nsp2 a V causado por baixo Fe.
Condições de baixo S também aumentaram significativamente a sensibilidade das plantas ao estresse por V, especialmente nos mutantes nsp1 (Figura S10a, Informações de Suporte). Sob condição de baixo S, embora o status da parte aérea de nsp2 não tenha mudado significativamente após 5 dias de tratamento com V, uma grande quantidade de ROS realmente se acumulou nos tecidos (Figuras S10a e S11, Informações de Suporte). Os fenótipos sensíveis ao V de nsp1 e nsp2 foram mais propensos a aparecer sob condições de baixo S. No entanto, o status de crescimento da parte aérea de nsp1 e nsp2 não foi significativamente diferente do de R108 sob condição de baixo S sem V (Figura S12, Informações de Suporte). A concentração de V na parte aérea de nsp1 e nsp2 foi maior do que a de R108 sob ambas as condições de baixo e alto S (Figura S10b, Informações de Suporte). No entanto, essa diferença foi significativamente reduzida sob condições de alto S. Além disso, o nível de S em nsp1 e nsp2 foi significativamente maior do que em R108 sob condições de alto S (Figura S10c, Informações de Suporte). Além disso, embora a razão S/V em R108 aumente significativamente sob condições de alto S, o aumento foi ainda maior em nsp1 e nsp2 (Figura S10d, Informações de Suporte). Portanto, condições de alto S podem melhorar a tolerância das plantas ao V, mas reduzem a diferença entre R108 e nsp1 e nsp2.

Tolerância das Plantas ao V é Regulada por Transportadores de P, Fe e S
Investigamos os efeitos regulatórios dos transportadores de P, Fe e S na tolerância das plantas ao V a partir de uma perspectiva genética, usando uma série de mutantes de M. truncatula e A. thaliana (Figura 4). Sob o estresse de alto V (1000 mg L−1), o tipo selvagem R108 de M. truncatula apresentou fenótipos severos de murcha foliar mais cedo do que o mutante do transportador de fosfato vacuolar mtvpt3-1 (Figura 4a). Além disso, com base no grau de amarelamento e arroxeadamento das folhas, os mutantes de transportadores de P de A. thaliana pht1;1, pht1;9, vpt1 e pho1, o mutante do transportador de Fe irt1 e os mutantes de transportadores de S sultr1;1, sultr1;2, sultr3;3/3;4/3;5, sultr3;1/3;2/3;3/3;5, sultr3;1/3;2/3;3/3;4/3;5, sultr4;1 e sultr4;2 todos exibiram graus variados de fenótipos de tolerância ao V em comparação com as plantas do tipo selvagem (Figura 4b–e). Entre eles, pht1;9, vpt1, irt1 e sultr1;2 foram os mais evidentes. Notavelmente, a superexpressão de VPT1 (A. thaliana) e MtVPT3 (M. truncatula) também pode melhorar a tolerância das plantas ao V, assim como suas mutações (Figura 4b,c). No entanto, sob condições normais, não houve diferença significativa no amarelamento foliar em Col-0, mutantes e plantas superexpressas (Figura S13, Informações de Suporte).
Mutação ou superexpressão de genes transportadores de fosfato (P), ferro (Fe) e sulfato (S) pode aumentar a tolerância das plantas ao vanádio (V). a) Fenótipos de crescimento de plantas de Medicago truncatula do tipo selvagem (R108) e do mutante do transportador vacuolar de fosfato mtvpt3‐1 sob estresse por V. Plântulas com cinco semanas de idade foram tratadas com 1000 mg L−1 de V por cinco dias. b) Fenótipos de crescimento de plantas de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col‐0), mutantes do transportador de P (pht1;1, pht1;9, vpt1 e pho1) e plantas superexpressando VPT1 (VPT1‐OE) sob estresse por V. Plântulas com três semanas de idade foram tratadas com 1000 mg L−1 de V por 10 dias. c) Fenótipos de crescimento de plantas do tipo selvagem (Col‐0) e plantas superexpressando MtVPT3 (MtVPT3‐OE) sob estresse por V. Plântulas com três semanas de idade foram tratadas com 1000 mg L−1 de V por 10 dias. d) Fenótipos de crescimento de plantas do tipo selvagem (Col‐0) e do mutante do transportador de Fe irt1 sob estresse por V. Plântulas com três semanas de idade foram tratadas com 1000 mg L−1 de V por 10 dias. e) Fenótipos de crescimento de plantas do tipo selvagem (Col‐0) e de mutantes do transportador de S (sultr1;1, sultr1;2, sultr3;3/3;4/3;5, sultr3;1/3;2/3;3/3;5, sultr3;1/3;2/3;3/3;4/3;5, sultr4;1 e sultr4;2) sob estresse por V. Plântulas com três semanas de idade foram tratadas com 1000 mg L−1 de V por uma semana.
Além disso, analisamos o acúmulo de íons no mutante mtvpt3 e em plantas superexpressando MtVPT3 sob estresse por V. Os resultados mostraram que mtvpt3 foi mais tolerante ao V do que o tipo selvagem R108, mas apresentou maior concentração de V acumulado na parte aérea (Figura S14a–c, Informações de Apoio). No entanto, as concentrações de P total e fosfato inorgânico (Pi) na parte aérea de mtvpt3 foram menores do que as de R108 (Figura S14d,e, Informações de Apoio). Inesperadamente, os níveis totais de S e Ca na parte aérea de mtvpt3 foram significativamente mais altos do que nas plantas do tipo selvagem, o que pode estar relacionado à tolerância ao V de mtvpt3 (Figura S14d, Informações de Apoio). As concentrações de V e P na raiz de mtvpt3 foram ambas significativamente menores do que as do tipo selvagem R108 (Figura S14f,g, Informações de Apoio). No entanto, mtvpt3 apresentou uma razão P/V significativamente maior do que o tipo selvagem (Figura S14h, Informações de Apoio). Além disso, os níveis de S, Fe e Ca na raiz de mtvpt3 foram significativamente maiores do que em R108 tipo selvagem (Figura S14g, Informações de Apoio). Isso também pode conferir a mtvpt3 maior tolerância ao V. Curiosamente, a superexpressão de MtVPT3 também aumentou significativamente os níveis de V nas partes aéreas das plantas (Figura S14i,j, Informações de Apoio). Diferentemente do mutante mtvpt3, o nível total de P nas partes aéreas das plantas superexpressando MtVPT3 foi significativamente maior do que o do tipo selvagem (Figura S14k, Informações de Apoio). Isso indicou que o mecanismo de aumento do nível de V nas partes aéreas das plantas superexpressando MtVPT3 e dos mutantes mtvpt3 pode ser diferente. Curiosamente, as mudanças nos níveis de S, Fe e Ca nas partes aéreas das plantas superexpressando MtVPT3 foram muito semelhantes às dos mutantes mtvpt3 (Figura S14d,k, Informações de Apoio). Isso indicou que as plantas superexpressando MtVPT3 e as plantas mutantes mtvpt3 podem ter mecanismos semelhantes para lidar com a toxicidade do V após acumular mais V. O Fe nas plantas afeta a mobilidade do Pi, e a tolerância de irt1 pode estar relacionada a mudanças na mobilidade do Pi. Nossos resultados mostraram que, em condições normais, a concentração de Pi de irt1 foi significativamente maior do que a de Col‐0, mas sob tratamento com V, a concentração de Pi de irt1 foi significativamente menor do que a de Col‐0 (Figura S15, Informações de Apoio).
Devido à incapacidade de observar as raízes em cultura de vermiculita em vasos, analisamos o efeito do estresse por V nas raízes de plantas cultivadas em meio ágar com solução nutritiva de Arabidopsis (ANS).[ ] Inesperadamente, os fenótipos radiculares da maioria dos mutantes sob estresse por V não foram significativamente diferentes dos de Col‐0 (Figuras S16–S19, Informações de Apoio). No entanto, as raízes de vpt1 e sultr4;2 foram mais sensíveis ao V do que as de Col‐0 (Figuras S16 e S19a,b, Informações de Apoio). A redução da concentração de P no meio de cultura aumentou significativamente a sensibilidade de A. thaliana ao V, mas também reduziu a diferença de sensibilidade entre vpt1 e Col‐0 (Figura S17, Informações de Apoio). O aumento da concentração de Fe no meio de cultura foi capaz de atenuar significativamente a toxicidade do V para Col‐0, mas teve pouco efeito sobre irt1 (Figura S18, Informações de Apoio). A toxicidade do V para A. thaliana também pôde ser atenuada aumentando a concentração de SO4 2− no meio. As raízes de sultr1;2 apresentaram um fenótipo significativamente mais tolerante ao V do que Col‐0 sob baixa concentração de SO4 2− de 50 µm, mas foram mais sensíveis que as raízes de Col‐0 sob alta concentração de SO4 2− de 5000 µm (Figura S19c,d, Informações de Apoio). Esses resultados indicaram que a tolerância das plantas ao V é regulada por transportadores de P, Fe e S, e os níveis de P e Fe no ambiente determinam a tolerância das plantas ao V.

Mutações em NSP1 e NSP2 Enfraquecem ou Alteram a Resposta dos Genes Transportadores de P, Fe e S ao Estresse por V

Para investigar a relação entre as diferenças de tolerância ao V e as respostas de expressão gênica em R108, nsp1 e nsp2, bem como sua dependência de microrganismos do solo, realizamos experimentos utilizando solo esterilizado. Inesperadamente, algumas plantas R108 apresentaram maior tolerância ao V do que as plantas nsp1 e nsp2, enquanto algumas plantas R108, como todas as plantas nsp1 e nsp2, morreram sob estresse por V (Figura S20a, Informações de Apoio). Após suas raízes serem separadas do solo, as plantas R108 com alta tolerância ao V ainda sobreviveram devido à sua nodulação induzida pela simbiose com Rhizobium (Figura S20b, Informações de Apoio). Assim, é difícil inativar completamente os microrganismos no solo. Além disso, utilizamos um dispositivo hidropônico com rampa absorvente (HDAS) para cultivar plantas com extrato de solo esterilizado ou não esterilizado contendo solução nutritiva de Hoagland à meia‐força,[ ] de modo a melhor controlar e observar a simbiose com Rhizobium (Figura 5 ; Figura S21, Informações de Apoio). O estado de crescimento de R108 nessas condições foi significativamente melhor do que o de nsp1 e nsp2 sem esterilização (Figura 5a). No entanto, não houve diferença significativa entre eles após a esterilização, indicando que a diferença na tolerância ao V entre R108 e nsp1 ou nsp2 depende de Rhizobium e microrganismos da rizosfera.
NSP1 e NSP2 são necessários tanto para a tolerância das plantas ao vanádio (V) quanto para a resposta dos genes transportadores de fosfato (P), ferro (Fe) e sulfato (S), e também dependem da existência de microrganismos do solo. a) Fenótipos de crescimento de plantas de Medicago truncatula do tipo selvagem (R108) e mutantes nsp1 e nsp2 sob estresse por V na presença e ausência de microrganismos do solo. Plântulas de três semanas foram cultivadas com solução nutritiva de Hoagland de meia força preparada com extrato de solo não estéril (Natural) ou extrato de solo estéril (Solução Nutritiva com Extrato de Solo Esterilizado). Após a nodulação de R108, as plantas foram tratadas com (+V) ou sem (-V) 30 mg L⁻¹ de V por 1 semana. Barras, 2 cm. b,c) Mapa de calor dos níveis de expressão relativos dos genes transportadores de P, Fe e S nas partes aéreas e raízes de plantas do tipo selvagem (R108), nsp1 e nsp2 sob estresse por V na presença (b) e ausência (c) de microrganismos do solo. As plantas foram tratadas como em (a). Os códigos de cores indicam as mudanças de dobra na expressão gênica após o tratamento com V, expressas como log2[(expressão com V (+V))/(expressão sem V (-V))]. Os dados foram calculados com base nos valores das Figuras S10–S14 (Informações de Apoio). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas com base em testes t de amostras independentes (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001).

Com base nos resultados fenotípicos dos mutantes quanto à tolerância ao V (Figura 4), analisamos a expressão gênica de vários membros das famílias PHT1, VPT, PHO1, ZIP e SULTR1 em M. truncatula (Figuras S22–S26, Informações de Apoio). Sem esterilização, os níveis de expressão de MtPT1, MtZIP6, MtZIP9 e MtSULTR1;1 foram significativamente reduzidos nas raízes de R108, mas sob condições esterilizadas, a expressão desses genes permaneceu inalterada ou até mesmo aumentou (Figura 5b,c). Nas raízes de nsp1 e nsp2, essa tendência foi enfraquecida ou até mesmo ocorreu a tendência oposta, especialmente para MtZIP9. Além disso, MtPHO1;2, MtVPT2 e MtVPT3 foram regulados positivamente nas raízes de R108, mas não apresentaram alteração nas raízes de nsp1 e nsp2. Entre esses genes, as respostas de MtVPT2 e MtVPT3 ao estresse por V se enfraqueceram após a esterilização.

Nas partes aéreas, apenas a expressão de MtPT7 foi significativamente inibida pelo estresse por V em R108, enquanto sua inibição não foi significativa nas partes aéreas de nsp1 e nsp2 (Figura 5b,c). MtPT1, MtPT2, MtPHO1;2, MtZIP6 e MtSULTR1;2 foram significativamente regulados positivamente pelo estresse por V nas raízes de R108, mas a maioria desses genes não foi significativamente afetada pelo estresse por V, ou sua expressão até diminuiu, nas raízes de nsp1 e nsp2. Entre esses genes, MtPT1, MtPHO1;2 e MtSULTR1;2 também foram significativamente induzidos pelo estresse por V nas partes aéreas de R108 após a esterilização, e a mudança não foi significativa nas partes aéreas de nsp1. Esses resultados indicam que mutações em NSP1 e NSP2 podem enfraquecer significativamente ou alterar a resposta de expressão dos genes transportadores de P, Fe e S ao estresse por V, e sua resposta de expressão nas raízes é mais dependente de Rhizobium ou microrganismos do solo do que nas partes aéreas.
Mutações em NSP1 e NSP2 Alteram a Diversidade de Rizobactérias sob Estresse por V
Realizamos o sequenciamento do gene 16S rRNA de rizobactérias. Os índices de Simpson, Chao1, ACE e Shannon foram utilizados para avaliar a diversidade α das rizobactérias (Figura S27, Informações de Suporte). O tratamento com alta concentração de V (2000 mg L−1) aumentou significativamente o índice de Simpson de nsp1, indicando uma diminuição significativa na diversidade da comunidade (Figura S27a, Informações de Suporte). Em segundo lugar, o tratamento com V reduziu significativamente os índices Chao1 e ACE de nsp1, indicando uma diminuição significativa na riqueza da comunidade (Figura S27b,c, Informações de Suporte). Sob tratamento com 200 mg L−1 de V, o índice de Shannon de nsp2 aumentou significativamente, mas os índices Chao1 e ACE não mudaram significativamente, sugerindo que a uniformidade da comunidade aumentou significativamente (Figura S27b–d, Informações de Suporte). No entanto, o tratamento com V não teve efeito significativo em nenhum dos índices de diversidade para o tipo selvagem R108 (Figura S27, Informações de Suporte). Isso sugere que a mutação NSP1 não é favorável para manter a diversidade α das rizobactérias sob estresse por V (especialmente em termos de riqueza), enquanto a mutação NSP2 tem um efeito relativamente pequeno sobre ela.
Além disso, a diversidade β pode refletir a resposta da estrutura da comunidade rizobacteriana de R108, nsp1 e nsp2 ao tratamento com V. Usamos a análise de coordenadas principais (PCoA) e a análise de variância permutacional multivariada (PERMANOVA) para visualizar e quantificar as diferenças entre as comunidades microbianas (diversidade β) usando a distância de Bray-Curtis (Figura 6). A diversidade β das comunidades rizobacterianas associadas a R108, nsp1 e nsp2 foi significativamente afetada pelo estresse por V (Figura 6a–c). No entanto, a distribuição intergrupo associada a R108 foi mais concentrada do que a de nsp1 e nsp2, indicando que a estrutura da comunidade rizobacteriana de nsp1 e nsp2 foi mais afetada pelo tratamento com V do que a de R108. Em seguida, analisamos a diversidade β das comunidades rizobacterianas entre plantas R108, nsp1 e nsp2 na mesma concentração de V. Os resultados mostraram que houve diferenças significativas entre R108, nsp1 e nsp2 em todas as condições (Figura 6d–g). No entanto, sem a adição de V, as rizobactérias associadas a R108 se sobrepuseram às de nsp1 e nsp2, mas elas se separaram gradualmente ao longo do eixo 2 da coordenada principal à medida que a concentração do tratamento com V aumentava. Isso indicou que o tratamento com V aumentou a diferença na estrutura da comunidade rizobacteriana entre R108 e ambos nsp1 e nsp2.
Mutações em NSP1 e NSP2 alteram a β‐diversidade e a abundância relativa de rizobactérias sob estresse por vanádio (V). a–c) Análise de coordenadas principais (PCoA) representando a β‐diversidade de rizobactérias em plantas de Medicago truncatula do tipo selvagem (R108) (a), nsp1 (b) e nsp2 (c) tratadas com diferentes concentrações de V. Na legenda, R, P1 e P2 representam R108, nsp1 e nsp2, respectivamente, enquanto 0, 20, 200 e 2000 representam as concentrações de tratamento com V em mg L−1. A tabela apresenta os valores de P correspondentes para comparações entre diferentes concentrações dentro do mesmo material vegetal. d–g) Análise de coordenadas principais (PCoA) da β‐diversidade de rizobactérias entre R108, nsp1 e nsp2 tratados com 0 (d), 20 (e), 200 (f) ou 2000 (g) mg L−1 de V. O significado da legenda e o conteúdo mostrado na tabela são consistentes com (a–c). A análise de variância multivariada permutacional (PERMANOVA) (a–g) foi conduzida com base nas distâncias de Bray–Curtis com um intervalo de confiança de 90%. h) Abundância relativa das dez principais famílias de rizobactérias em plantas do tipo selvagem (R108), nsp1 e nsp2. R, P1 e P2 representam R108, nsp1 e nsp2, respectivamente. Os números após os pontos de R, P1 e P2 indicam a concentração de tratamento com V em mg L−1.

Mutações em NSP1 e NSP2 Alteram a Abundância e as Redes de Co‐Ocorrência de Rizobactérias sob Estresse por V

Para investigar os efeitos do tratamento com V nas bactérias rizosféricas dominantes associadas a R108, nsp1 e nsp2, determinamos as famílias mais abundantes. Comamonadaceae foi a família mais abundante em todas as amostras e diminuiu à medida que a concentração de tratamento com V aumentou (Figura 6h; Figura S28a, Informações de Suporte). No entanto, sua abundância foi significativamente maior em associação com R108 do que com nsp1 e nsp2 sob vários tratamentos com V. Em segundo lugar, a abundância de Burkholderiaceae no solo rizosférico de nsp1 foi significativamente maior do que no solo rizosférico de R108 (Figura S28b, Informações de Suporte). Em seguida, a abundância de Pseudomonadaceae foi significativamente aumentada pelos tratamentos com 20 e 200 mg L−1 de V para R108, mas não mudou significativamente para nsp1 e nsp2 (Figura S28c, Informações de Suporte). Por último, a abundância de Rhodocyclaceae permaneceu em um nível relativamente alto e estável para R108, mas foi facilmente perturbada pelo estresse por V para nsp1 e nsp2 (Figura S28d, Informações de Suporte).
Usamos redes de co‐ocorrência para explorar diferenças nos padrões de resposta das rizobactérias R108, nsp1 e nsp2 ao tratamento com V (Figura 7). Utilizando os métodos edgeR e de espécies indicadoras, unidades taxonômicas operacionais responsivas a V (VrOTUs) foram identificadas e mapeadas nas redes de co‐ocorrência, e suas características de distribuição foram então analisadas. As redes de co‐ocorrência de rizobactérias impulsionadas pelo estresse de V foram significativamente mais simples para nsp2 do que aquelas associadas a R108 e nsp1 (Figura 7a–c). Em R108, dois grandes módulos de rede de co‐ocorrência foram formados, enquanto houve apenas um em nsp1 e quase nenhum em nsp2. Além disso, sob tratamento com V, R108 formou mais módulos contendo VrOTUs do que nsp1 e nsp2, e a maioria das VrOTUs veio principalmente de dois tratamentos com V, 0 e 200 mg L⁻¹ (Figura S29, Informações de Suporte). Assim, em comparação com R108, sob tratamento com V houve menos simbiose com rizobactérias para nsp1 e especialmente nsp2.

Mutações NSP1 e NSP2 alteram as redes de co‐ocorrência de rizobactérias. a–c) Redes de co‐ocorrência de rizobactérias em plantas de Medicago truncatula do tipo selvagem (R108) (a), nsp1 (b) e nsp2 (c). Unidades taxonômicas operacionais (UTOs) de baixa frequência, com frequências inferiores a 92%, foram removidas de todas as amostras. UTOs responsivas a V (VrOTUs) são destacadas e codificadas por cores. As arestas da rede de co‐ocorrência foram selecionadas com base nos critérios de rho de Spearman > 0,7 e valor de P < 0,001. d–f) Teste de Mantel das concentrações de elementos nas plantas e módulos de VrOTUs em R108 (d), nsp1 (e) e nsp2 (f). Os dados de concentração de elementos nas plantas foram obtidos da Figura 2. As linhas com correlações significativas são indicadas em cores.

Também construímos redes de co‐ocorrência de rizobactérias de plantas R108, nsp1 e nsp2 na mesma concentração de V e usamos os métodos edgeR e de espécies indicadoras para identificar as unidades taxonômicas operacionais diferenciadas por espécie (SdOTUs). No geral, o número de módulos contendo SdOTUs diminuiu sob tratamento com V em comparação com condições normais (Figura S30, Informações de Suporte). No entanto, houve um aumento na complexidade da rede bacteriana na rizosfera sob o tratamento com V de 200 mg L⁻¹ em comparação com o tratamento de 20 mg L⁻¹ (Figura S30b,c, Informações de Suporte). Em condições normais, as SdOTUs na rede estavam principalmente associadas a R108, mas sob tratamento com V, estavam principalmente associadas a nsp2 (Figura S30, Informações de Suporte). Além disso, módulos em todas as redes que continham principalmente SdOTUs de R108 foram separados dos módulos que continham principalmente SdOTUs de nsp1 e nsp2. Esses resultados sugerem que as mutações NSP1 e NSP2 remodelam as comunidades de rizobactérias e alteram a capacidade das interações entre rizobactérias de lidar com o estresse de V.
Mutações NSP1 e NSP2 Alteram a Associação entre Rizobactérias e o Acúmulo de Elementos nas Plantas
Pode existir uma relação intrínseca entre microrganismos da rizosfera e o acúmulo de metais pesados e nutrientes em plantas. Para investigar isso, realizamos uma análise de correlação entre os módulos e as concentrações de elementos nas redes de coocorrência rizobacterianas. Houve uma correlação mais significativa entre os módulos VrOTU e as concentrações de elementos no solo da rizosfera de R108 em comparação com os solos da rizosfera de nsp1 e nsp2 (Figura 7d–f). Em R108, quatro dos cinco módulos VrOTU correlacionaram-se significativamente com elementos nas plantas. Entre estes, o módulo 3 e o módulo 5 correlacionaram-se significativamente com as concentrações de V nas raízes, e o módulo 1, módulo 2 e módulo 3 correlacionaram-se significativamente com as concentrações de P, Fe e S nas partes aéreas ou raízes. No entanto, nenhum módulo foi associado às concentrações de V nas partes aéreas e às concentrações de Ca nas plantas (Figura 7d). Em nsp1, três dos quatro módulos VrOTU foram significativamente associados às concentrações elementares nas plantas. Entre eles, o módulo 1 correlacionou-se significativamente com as concentrações de V tanto nas partes aéreas quanto nas raízes e com as concentrações de S nas partes aéreas. O módulo 2 e o módulo 4 correlacionaram-se significativamente com as concentrações de Fe e Ca, respectivamente, nas raízes. No entanto, nenhum módulo foi significativamente associado ao P (Figura 7e). Em nsp2, dos dois módulos, apenas o módulo 1 correlacionou-se significativamente com a concentração de qualquer elemento, e correlacionou-se significativamente com as concentrações de V nas partes aéreas e raízes, mas não com as concentrações de outros elementos (Figura 7f).

Bactérias fora dos módulos também podem ser importantes. Portanto, exploramos ainda mais os biomarcadores nas rizobactérias e investigamos a correlação entre eles e a concentração de elementos nas plantas (Figura 8). Identificamos os 20 biomarcadores mais importantes em R108, nsp1 e nsp2 e analisamos sua associação com as concentrações elementares nas plantas. O biomarcador com maior pontuação para R108 foi classificado no filo Verrucomicrobiota, enquanto o biomarcador com maior pontuação para nsp1 e nsp2 foi classificado no filo Proteobacteriota (Figura 8; e Tabela S1, Informações de Suporte). Proteobacteriota, Acidobacteriota, Gemmatimonadota e Bacteroidota foram os biomarcadores bacterianos comuns das rizosferas das plantas R108, nsp1 e nsp2 (Figura 8; Figura S31, Informações de Suporte). Além disso, Proteobacteria apresentou alta abundância relativa entre os biomarcadores rizobacterianos dos três materiais vegetais; no entanto, em comparação com nsp1 e nsp2, sua abundância relativa foi mais estável em R108 (Figura S31, Informações de Suporte). Adicionalmente, Verrucomicrobiota, Nitrospirota e Bdellovibrionota foram exclusivos como biomarcadores de R108. Esses resultados indicam que as mutações NSP1 e NSP2 alteram os biomarcadores das rizobactérias associadas a M. truncatula tratada com V.
Mutações NSP1 e NSP2 alteram os biomarcadores rizobacterianos e a associação entre biomarcadores e concentrações de elementos nas plantas. a–c) Avaliação da abundância e importância dos biomarcadores rizobacterianos em plantas de Medicago truncatula R108 (a), nsp1 (b) e nsp2 (c), juntamente com a correlação de Spearman com as concentrações de elementos nas plantas. O gráfico de bolhas exibe a frequência dos 20 principais biomarcadores. O gráfico de barras mostra a importância dos 20 principais biomarcadores. A matriz de correlação ilustra as relações entre os 20 principais biomarcadores e as concentrações de elementos nas plantas. Os dados de concentração de elementos nas plantas foram obtidos da Figura 2. Os coeficientes de correlação de Spearman foram calculados com significância estatística indicada da seguinte forma: * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P < 0,001. d,e) Um modelo proposto ilustrando o mecanismo de resposta de Medicago truncatula ao estresse por vanádio (V) e o efeito das mutações NSP1 e NSP2 sobre ele. Em (d), o V pode compartilhar transportadores com fosfato (P) e sulfato (S). Sob estresse por V, a planta do tipo selvagem (R108) regula negativamente a expressão dos genes transportadores de P e S (MtPT1 e MtSULTR1;1) nas raízes para reduzir a absorção de V. Além disso, a regulação positiva de MtVPT2, MtVPT3 e MtPHO1;2 acelera a compartimentalização vacuolar de V e seu carregamento para outros tecidos, a fim de reduzir a toxicidade de V para as raízes. A regulação negativa dos genes transportadores de Fe MtZIP6 e MtZIP9 garante a resposta dos genes transportadores de P ao V por meio da regulação do equilíbrio Fe-P. A expressão regulada positivamente de MtZIP6, MtPT1, MtPT2, MtSULTR1;1 e MtSULTR1;2 nas brotações pode aumentar a capacidade de Fe, P e S de resistir à toxicidade do V. No entanto, a tolerância de R108 ao V e a resposta de expressão dos genes nas raízes dependem amplamente da presença de micróbios do solo. R108 pode manter a diversidade da comunidade rizobacteriana sob estresse por V e regular ativamente as rizobactérias para coordenar a resposta ao estresse por V. Em (e), tanto os mutantes nsp1 quanto nsp2 não podem formar nódulos. Consequentemente, os genes transportadores de P, S e Fe são incapazes de responder positivamente ou adequadamente ao estresse por V. Além disso, as rizobactérias tornam-se frágeis e desordenadas. Portanto, nsp1 e nsp2 exibem um fenótipo de estresse por V mais sensível em comparação com R108.
Análise de correlação dos biomarcadores selecionados com as concentrações de elementos nas plantas mostrou que o número de correlações significativas foi significativamente maior em R108 do que em nsp1 e nsp2 (Figura 8). Em R108, mais da metade dos biomarcadores foram significativamente correlacionados com as concentrações de V nas raízes, e a maioria deles apresentou correlação significativamente positiva (Figura 8a). Entre eles, OTU3058 e OTU1908 foram positivamente correlacionados com as concentrações de V na parte aérea e nas raízes. Além disso, um grande número de biomarcadores foi significativamente correlacionado com as concentrações de P, Fe e S na parte aérea. Entre eles, OTU1228 e OTU3606, pertencentes a Acidobacteriota e Bdellovibrionota, respectivamente, foram significativamente correlacionados negativamente com as concentrações de V na parte aérea e nas raízes, mas também significativamente correlacionados positivamente com as concentrações de P, Fe e S na parte aérea. OTU1514 e OTU4166, pertencentes a Chloroflexota e Gemmatimonadota, respectivamente, foram correlacionados negativamente com as concentrações de V na parte aérea e nas raízes e positivamente correlacionados com as concentrações de S. Além disso, OTU1819, que pertence a Bacteroidota, apresentou correlação positiva significativa com a concentração de V na parte aérea e correlação negativa significativa com as concentrações de P e S na parte aérea. Em comparação com R108, o número de biomarcadores significativamente correlacionados com as concentrações de V em nsp1 foi significativamente reduzido, e as correlações foram principalmente negativas (Figura 8b). Enquanto isso, o número de biomarcadores significativamente correlacionados com outros elementos nutrientes foi significativamente menor, e não houve correlação significativa com P. Em nsp2, menos biomarcadores foram significativamente correlacionados com as concentrações de V, e nenhuma correlação significativa foi encontrada entre eles e outros elementos nutrientes (Figura 8c). Esses resultados sugeriram que mutações em NSP1 e NSP2 enfraquecem ou alteram a associação de rizobactérias com elementos nas plantas, o que pode ter causado sua tolerância reduzida ao V.
Discussão
Estudos anteriores mostraram que a simbiose com Rhizobium desempenha um papel regulador importante na absorção e acúmulo de metais pesados em leguminosas.[ ] NSP1 e NSP2 são reguladores transcricionais chave da sinalização da simbiose com Rhizobium.[ ] Neste estudo, descobrimos que os níveis de tolerância ao V dos mutantes nsp1 e nsp2 com defeitos na simbiose com Rhizobium foram significativamente menores do que os da linhagem selvagem R108. Além disso, foi confirmado a partir de perspectivas fisiológicas e genéticas que a absorção e o acúmulo de V estão intimamente relacionados à absorção, acúmulo e homeostase de P, Fe e S. Além disso, microrganismos rizosféricos também desempenham um papel importante na tolerância ao V em plantas. Finalmente, sob a perspectiva da regulação de P, Fe e S e da resposta das rizobactérias, revelamos o mecanismo pelo qual a absorção e o acúmulo de V são regulados por NSP1 e NSP2.
NSP1 e NSP2 Modulam o Acúmulo e a Tolerância ao V em Plantas por meio de P, Fe, S e seus Transportadores
Devido à sua estrutura e carga semelhantes, o V é considerado um análogo do P e é absorvido pelas plantas através da via de transporte do P. Quando as condições de P foram alteradas sob um determinado estresse de V, a mudança no nível total de P nas plantas foi muito consistente com a do V, o que confirmou ainda mais a possibilidade de compartilhamento do sistema de transporte entre V e P (Figura S4b,c, Informações de Apoio). No entanto, tem faltado evidências genéticas que sustentem essa conclusão.[ ] O mutante mtvpt3 de Medicago truncatula VPTs e os mutantes do transportador de P de A. thaliana pht1;1, pht1;9, vpt1 e pho1 exibem graus variados de fenótipos de maior tolerância ao V em relação a Col‐0 na parte aérea. Até onde sabemos, este é o primeiro suporte genético para inferências anteriores sobre a via de transporte compartilhada de V e P (Figura 4a–c). No entanto, as raízes de vpt1 exibiram um fenótipo sensível (Figura S16, Informações de Apoio). Recentemente, nossa pesquisa mostrou que mutações em MtVPT2 podem reduzir a eficiência do transporte de P das raízes para a parte aérea.[ ] O VPT1 de Arabidopsis thaliana está intimamente relacionado ao MtVPT2, e mutações nele podem reduzir a eficiência do transporte de V das raízes para a parte aérea. Portanto, vpt1 apresentou um fenótipo de tolerância na parte aérea e sensibilidade nas raízes sob estresse de V. Além disso, o VPT1 é um dos transportadores mais importantes em A. thaliana que transporta P do citoplasma para os vacúolos.[ ] Mutações no VPT1 podem levar a que o V não seja transportado efetivamente para os vacúolos radiculares para desintoxicação. MtVPT2 e MtVPT3 nas raízes de R108 foram significativamente induzidos pelo estresse de V, o que pode favorecer a desintoxicação por compartimentalização vacuolar. Portanto, a superexpressão de VPT1 e MtVPT3 pode melhorar significativamente a tolerância das plantas ao V. Além disso, plantas com superexpressão de MtVPT3 apresentaram maiores concentrações de P e V na parte aérea do que o tipo selvagem (Figura S14j,k, Informações de Apoio).
Entretanto, mutações no MtVPT3 também podem conferir tolerância ao V nas plantas, mas o mecanismo do efeito pode ser diferente daquele do vpt1. A mutação do MtVPT3 pode aumentar a eficiência do transporte de P das raízes para a parte aérea,[ ] mas isso também significa que inevitavelmente aumentará a absorção e o transporte de V. Conforme esperado, as concentrações de V na parte aérea de mtvpt3 foram maiores do que no tipo selvagem R108 sob estresse de V (Figura S14c, Informações de Suporte). Inesperadamente, as concentrações de P total e Pi na parte aérea de mtvpt3 foram menores do que em R108 (Figura S14d, Informações de Suporte), o que difere dos resultados previamente relatados sob condições normais.[ ] No entanto, a diminuição na concentração de Pi significa que menos Pi provavelmente será armazenado no vacúolo, o que favorece mais P no citoplasma para combater a toxicidade do V. Níveis mais elevados de P no ambiente são mais propícios à sobrevivência das plantas sob estresse de V, o que reflete, até certo ponto, o papel do P na resistência à toxicidade do V (Figuras S4 e S17, Informações de Suporte). Na raiz de mtvpt3, além da concentração de V significativamente menor do que no tipo selvagem, a maior razão P/V também pode ser favorável à tolerância ao V (Figura S14f,h, Informações de Suporte). Além disso, os níveis de S e Ca na parte aérea e de S, Fe e Ca nas raízes de mtvpt3 foram significativamente maiores do que os do tipo selvagem (Figura S14d,g, Informações de Suporte). Semelhante ao alto P, altos níveis de S e alto Fe também podem antagonizar a toxicidade do V (Figura 3; Figuras S7, S8, S10 e S11, Informações de Suporte). Curiosamente, plantas superexpressando MtVPT3 e mutantes mtvpt3 apresentaram alterações muito semelhantes nas concentrações de S, Fe e Ca na parte aérea (Figura S14d,k, Informações de Suporte). Isso sugere que, embora aumentem os níveis de V na parte aérea por meio de mecanismos diferentes, eles possuem mecanismos semelhantes para combater a toxicidade do V. No entanto, como o MtVPT3 regula os níveis de S, Fe e Ca precisa ser melhor explorado no futuro. O PHT1 e o PHO1 determinam o processo de absorção, carregamento ou redistribuição de P nas plantas.[ ] Os fenótipos de tolerância ao V na parte aérea de seus mutantes podem ser devidos à obstrução da absorção de V e do transporte de P. Correspondentemente, o MtPT1 nas raízes de R108 foi significativamente regulado negativamente pelo estresse de V, o que pode ser benéfico para reduzir a absorção e o transporte de V. Além disso, o MtPHO1;2 foi significativamente induzido pelo estresse de V nas raízes de R108, o que pode ser resultado de uma diminuição de P. É claro que a regulação positiva de sua expressão também pode ser um processo ativo pelo qual as plantas resistem ao estresse de V, por exemplo, reduzindo o nível de V no citoplasma da raiz. No entanto, esses genes nos mutantes nsp1 e nsp2 apresentaram pouca resposta ao estresse de V ou uma resposta oposta à de R108, de modo que foram sensíveis ao estresse de V (Figura 5b).
Até o momento, nenhuma pesquisa mostrou que a absorção de V em plantas está relacionada ao transporte de S. No entanto, S e P possuem certas semelhanças em sua estrutura química, de modo que alguns membros da família de transportadores de S SULTR também têm afinidade por P.[ ] Como análogo do P, o V também pode compartilhar vias de transporte com o S. Descobrimos que mutantes da família SULTR de A. thaliana apresentam diferentes fenótipos de tolerância ao V, especialmente mutantes de genes da subfamília SULTR1. Além disso, o aumento da concentração de SO4 2− no meio de crescimento pode inibir competitivamente a absorção e o transporte de V, aliviando assim a toxicidade do V para as plantas (Figura S19c, Informações de Apoio). SULTR1;2 não é apenas um transportador de S de alta afinidade mais importante que SULTR1;1, mas também é provavelmente um receptor de S que regula a resposta de outros genes ao S.[ ] Sob condições de baixo S, mutações em SULTR1;2 podem ser capazes de limitar a absorção de V e, assim, conferir um fenótipo tolerante ao V às plantas (Figura S19c,d, Informações de Apoio). No entanto, sob condições de alto S, mutações em SULTR1;2 também podem reduzir a sensibilidade ao V enquanto reduzem a sensibilidade ao S, diminuindo assim a capacidade de lidar com o estresse de V e, consequentemente, fazendo com que as raízes apresentem um fenótipo sensível. A expressão de MtSULTR1;1 nas raízes foi significativamente inibida pelo estresse de V, o que pode favorecer a redução da absorção de V pelas raízes de M. truncatula. No entanto, MtSULTR1;1 não mostrou resposta ao estresse de V nas raízes de nsp1. P e S são necessários para a simbiose com Rhizobium.[ ] R108, que formou simbioses com sucesso com Rhizobium, pode ter uma maior capacidade de absorção de P e S do que tanto nsp1 quanto nsp2. No entanto, o V também é provavelmente mais absorvido durante a captação de P e S. É bem conhecido que o V pode inibir a atividade da ATPase, o que por sua vez afeta a atividade dos transportadores. Neste caso, R108 ainda inibe ativamente as vias de absorção e transporte de elementos nutrientes por meio da regulação da expressão gênica. Portanto, o V transportado para a parte aérea sob a baixa concentração de V (20 mg L−1) foi maior em R108 do que em nsp1 e nsp2, enquanto vários níveis de elementos nutrientes caíram drasticamente em R108 (Figura 2a). No entanto, R108 é mais eficaz que nsp1 e nsp2 em limitar a absorção, transporte e desintoxicação de V por meio da expressão e regulação dos transportadores de P e S. Portanto, sob estresse de V em alta concentração (200 mg L−1), R108 acumulou níveis mais baixos de V do que tanto nsp1 quanto nsp2 e mostrou maior tolerância ao V (Figuras 1 e 2a).
Além desses resultados baseados em mutantes de transportadores de P e S, também descobrimos que a tolerância ao V na parte aérea do mutante irt1 de A. thaliana foi maior do que a das plantas do tipo selvagem. Devido à formação de complexos insolúveis, existe uma interação antagônica entre Fe e P nas plantas.[ ] Para a mutação IRT1, o P na parte aérea de uma planta aumenta em condições normais (Figura S15, Informações de Apoio). No entanto, a deficiência de Fe nas plantas ocorre por meio da degradação do fator central de sinalização de P, PHRs, para evitar a sobrecarga de P. Quando o V entra nas plantas, ele pode ser identificado incorretamente pelos sistemas vegetais como P e afetar o acúmulo de Fe. Portanto, Fe, P e V podem formar uma relação mutuamente equilibrada e antagônica nas plantas. O fator de translocação de V da raiz para a parte aérea aumentou significativamente em condição de baixo Fe (Figura S7c, Informações de Apoio). Para antagonizar a toxicidade do V, os níveis de P na parte aérea também aumentaram (Figura S7d, Informações de Apoio). Surpreendentemente, o aumento de V também estimulou um aumento significativo nos níveis de Fe na parte aérea em condições de baixo Fe (Figura S7e, Informações de Apoio). Sob a condição de deficiência de Fe, a concentração de Fe na raiz diminuiu significativamente e, correspondentemente, a concentração de P e V também diminuiu significativamente (Figura S7b,d,e, Informações de Apoio). Para o irt1 deficiente em Fe, o V pode inibir a absorção e o carregamento de P mais fortemente do que para Col-0. É claro que esse efeito também inibirá o transporte de V; assim, irt1 apresenta um fenótipo tolerante ao V, e o nível de P é menor do que o do tipo selvagem sob estresse de V. Estudos anteriores mostraram que MtZIP6, que está intimamente relacionado ao IRT1 em M. truncatula, possui atividade de transporte de Fe.[ ] Embora a expressão de MtZIP6 tenha sido inibida pelo estresse de V nas raízes do tipo selvagem R108, a resposta de seu gene homólogo MtZIP9 ao estresse de V foi mais proeminente (Figura S25a,b, Informações de Apoio). A regulação negativa significativa de MtZIP6 e MtZIP9 nas raízes de R108 pode ser propícia para inibir o transporte de V através da regulação de P, mas suas respostas em nsp1 ou nsp2 não foram óbvias ou foram significativamente reguladas positivamente. Portanto, nsp1 e nsp2 têm concentrações de Fe mais altas do que R108, mas exibem fenótipos mais sensíveis ao V do que R108 (Figura 5a). Além disso, há frequentemente retenção entre V e Fe no ambiente, o que também pode existir nas plantas.[ ] Quando as concentrações de Fe no ambiente aumentam, as raízes das plantas do tipo selvagem podem absorver efetivamente o Fe para reter o V e exibir um fenótipo de toxicidade reduzida, mas o desempenho de irt1 não foi óbvio (Figura S18, Informações de Apoio).
A resposta dos genes transportadores mencionados limita a absorção e o transporte de V pelas raízes, mas também levou a uma diminuição significativa nos níveis de P, Fe e S na parte aérea de R108 (Figura 2c–e). No entanto, isso não foi evidente nos mutantes nsp1 e nsp2. Essa descoberta também implica que R108 adota preferencialmente uma estratégia de limitar o transporte de íons tóxicos às custas do acúmulo de nutrientes, em vez de resistir à toxicidade iônica, para se adaptar ao estresse por V. Com o aumento da concentração de V no ambiente, é inevitável que a concentração de V na parte aérea das plantas aumente. Portanto, as concentrações de V na parte aérea de R108 foram significativamente correlacionadas negativamente com as concentrações de P, Fe e S (Figura 2g–i). No entanto, esse padrão foi significativamente reduzido ou até mesmo oposto nos mutantes nsp1 e nsp2. Em contraste com o padrão observado nas raízes, os genes transportadores de P, S e Fe na parte aérea de R108 foram significativamente regulados positivamente sob estresse por V, mas a maioria deles não teve efeito significativo ou sua expressão foi diminuída em nsp1 e especialmente em nsp2 (Figura 5b,c). A regulação positiva desses genes transportadores pode ser induzida pela diminuição dos níveis de P, Fe e S, ou pode ser um processo de resposta ativa ao estresse por V. Em comparação com a baixa concentração de V (20 mg L−1), o estresse por alta concentração de V (200 mg L−1) aumentou significativamente os níveis de P, Fe e S na parte aérea de R108 (Figura 2c–e). O aumento dos níveis de P, Fe e S é favorável para combater a toxicidade do V, o que pode ser uma estratégia que é iniciada gradualmente à medida que a concentração de V aumenta. Embora os níveis de P e Fe na parte aérea dos mutantes nsp1 e nsp2 ainda fossem maiores do que em R108 sob estresse por V de 200 mg L−1, eles não foram capazes de lidar com a toxicidade causada pelo aumento significativo de V (Figura 2a,c,d). Se P, S e Fe são antagonistas do V, então as razões P/V, S/V e Fe/V podem ser mais importantes para a tolerância ao V do que simples mudanças no teor de elementos. Em comparação com o estresse por V de 20 mg L−1, o estresse por V de 200 mg L−1 aumentou significativamente as razões P/V, S/V e Fe/V na parte aérea de R108 (Figura S3, Informações de Suporte). No entanto, essa tendência foi revertida em nsp1 e nsp2. O aumento dos níveis de P, S e Fe no ambiente melhorou significativamente a tolerância ao V nas plantas (Figuras S4, S7 e S10, Informações de Suporte). No entanto, as mudanças na tolerância ao V de nsp1 e nsp2 diferiram das de R108 em resposta às condições de P, S e Fe.
A razão P/V foi significativamente aumentada em R108, mas não em nsp1 e nsp2 sob condições de alto P (Figura S4d, Informações de Suporte). Portanto, fenótipos sensíveis a V de nsp1 e nsp2 são mais propensos a aparecer sob condições de alto P. A razão S/V em nsp1 e nsp2 foi significativamente menor do que em R108 sob condições de baixo S (Figura S10d, Informações de Suporte). No entanto, condições de alto S aumentaram significativamente a razão S/V nas plantas, especialmente em nsp1 e nsp2. Portanto, fenótipos sensíveis a V de nsp1 e nsp2 são mais propensos a aparecer sob condições de baixo S. Sob condições de baixo Fe, a razão Fe/V foi significativamente aumentada em R108, mas não em nsp1 e nsp2 (Figura S7f, Informações de Suporte). Além disso, a razão P/V não mudou significativamente em R108, mas diminuiu significativamente em nsp1 e nsp2. Portanto, fenótipos sensíveis a V de nsp1 e nsp2 são mais propensos a aparecer sob condições de baixo Fe. Além dos efeitos de P, Fe e S, pode haver outros mecanismos que conferem tolerância a V em R108. Além disso, seja sob condições de baixo ou alto V, R108 tem um coeficiente de transferência de V da raiz para a parte aérea significativamente maior do que nsp2 (Figura 2b). Isso é difícil de explicar através de padrões de expressão gênica nas raízes ou partes aéreas, e merece maior investigação. Comparado com a resposta de expressão dos genes transportadores de P, Fe e S nas partes aéreas, as respostas desses genes nas raízes de R108 foram mais dependentes de Rhizobium e micro-organismos do solo. Portanto, os micro-organismos do solo também podem desempenhar um papel importante na regulação da tolerância das plantas ao V.
NSP1 e NSP2 são Essenciais para Manter a Diversidade Rizobacteriana e a Capacidade de Resposta Cooperativa sob Estresse de V
Estudos anteriores mostraram que a diversidade das comunidades microbianas da rizosfera responde fortemente ao estresse de V, e que a colonização de alguns microrganismos-chave desempenha um papel fundamental na melhoria da tolerância ao V em plantas.[ ] A simbiose rizóbio-leguminosa pode levar a mudanças nas comunidades microbianas da rizosfera. No entanto, não está claro se isso afeta a tolerância ao V. Nosso estudo mostra que a tolerância ao V de M. truncatula depende da presença de microrganismos da rizosfera. A mutação do NSP1 tornou o Rhizobium incapaz de formar simbioses com raízes de plantas, e também não foi propícia para manter a α-diversidade de rizobactérias sob estresse de V (Figuras S1 e S27, Informações de Apoio). Além disso, a análise de β-diversidade mostrou que as estruturas da comunidade rizobacteriana dos mutantes nsp1 e nsp2 foram mais afetadas pelo tratamento com V do que a de R108 (Figura 6a–c). Portanto, a simbiose com Rhizobium pode afetar a sensibilidade da comunidade microbiana da rizosfera de leguminosas ao estresse de V. O enriquecimento de microrganismos benéficos é uma possível maneira das plantas resistirem ao estresse de V. Eles podem promover o crescimento de plantas sob estresse de metais pesados produzindo substâncias promotoras de crescimento vegetal, hormônios vegetais, enzimas, etc., ou podem quelar metais pesados ou alterar a valência de metais pesados para reduzir os danos causados por metais pesados às plantas.[ ] Estudos anteriores mostraram que Comamonadaceae, Pseudomonadaceae e Rhodocyclaceae podem compreender bactérias com capacidade de redução de V em solo contaminado com V, e sua abundância aumenta em baixas concentrações de V. No entanto, seu crescimento também pode ser inibido por altos níveis de estresse de V.[ ] Nosso estudo mostrou que a abundância de Comamonadaceae na rizosfera de R108 sob estresse de V foi significativamente maior do que a de nsp1 e nsp2 (Figura S28a, Informações de Apoio). Pseudomonadaceae teve uma resposta positiva ao estresse de V para R108, mas não teve mudança significativa para os mutantes nsp1 e nsp2 (Figura S28c, Informações de Apoio). A abundância de Rhodocyclaceae diminuiu rapidamente para os mutantes nsp1 e nsp2 sob alto estresse de V, mas foi relativamente estável para R108 (Figura S28d, Informações de Apoio). Portanto, a resposta desses táxons pode ser a razão pela qual os mutantes nsp1 e nsp2 foram mais sensíveis ao estresse de V do que o tipo selvagem R108. Outros estudos mostraram que algumas bactérias da Burkholderiaceae podem dissolver P inorgânico insolúvel em solos, promovendo assim a absorção de P pelas plantas.[ ] Talvez, devido à semelhança do V com o P, essas bactérias também promovam a absorção de V pelas plantas. Em nosso estudo, a abundância de Burkholderiaceae em nsp1 foi maior do que em R108, o que pode ser uma razão pela qual a concentração de V em nsp1 foi maior do que em R108 quando tratado com alta concentração de V (≥200 mg L−1) (Figura S28b, Informações de Apoio).
Mudanças na diversidade rizobacteriana afetam as interações da comunidade.[ ] Redes de co‐ocorrência podem fornecer uma nova perspectiva para a análise de interações microbianas devido às suas fortes propriedades emergentes.[ ] Descobrimos que mutações de NSP1 e NSP2 enfraqueceram a complexidade da rede de rizobactérias sob tratamento com V e alteraram as interações entre as bactérias (Figura 7a–c). Estudos anteriores mostraram que comunidades microbianas diversas e complexas tendem a ser mais estáveis e resilientes sob estresse ambiental externo em comparação com comunidades simples.[ ] A complexa rede bacteriana na rizosfera de R108 pode dotá-la de maior estabilidade e resistência ao estresse por V, aumentando assim o limiar de concentração de V de R108 (Figura 7a–c). Mutações em NSP1 e NSP2 enfraqueceram as relações cooperativas entre as rizobactérias, e as rizobactérias apresentaram maior probabilidade de exibir homeostase perturbada quando expostas ao estresse por V. Portanto, nsp1 e nsp2 foram mais severamente estressados por V do que R108. Além disso, mapeamos VrOTUs que responderam a V nas redes de co‐ocorrência, e eles formaram mais módulos de sub‐rede em R108 do que ambos nsp1 e nsp2 (Figura 7a–c). Essa descoberta implica que R108 pode ter uma capacidade mais forte de conduzir as rizobactérias a combater o estresse por V do que ambos nsp1 e nsp2. Mutações de NSP1 e NSP2 remodelaram as comunidades rizobacterianas (Figura S30, Informações de Suporte), o que pode afetar as respostas sinérgicas planta–micróbio e micróbio–micróbio ao estresse por V.
NSP1 e NSP2 são Necessários para o Estabelecimento de Associações entre Rizobactérias e Acumulações de Elementos sob Estresse por V
Foi demonstrado que rizobactérias aumentam a tolerância a metais pesados promovendo a absorção de nutrientes em plantas.[ ] No entanto, a montagem e a função das rizobactérias são estritamente reguladas pelo hospedeiro.[ ] A análise de associação dos módulos da rede rizobacteriana com as concentrações de elementos nas plantas mostrou que mais módulos em R108 estavam significativamente correlacionados com as concentrações de V, P, Fe e S em comparação com nsp1 e nsp2. Em nsp1 e nsp2, apenas um módulo apresentou associação significativa com as concentrações de V nas plantas, e as associações com as concentrações de P, Fe e S foram significativamente mais fracas em comparação com R108 (Figura 7d–f). Essas descobertas indicam que as rizobactérias, além de participar diretamente nas respostas ao estresse por V, parecem mobilizar ativamente outros elementos envolvidos nas defesas das plantas contra o estresse por V, mas essa função é defeituosa em nsp1 e nsp2. Portanto, investigamos mais a fundo a relação entre rizobactérias e tolerância ao V em diferentes materiais vegetais por meio do desenvolvimento de biomarcadores. O biomarcador mais importante de R108 foi classificado em Verrucomicrobiota, enquanto os de nsp1 e nsp2 foram classificados em Proteobacteria (Figura 8; e Tabela S1, Informações de Apoio). Estudos anteriores mostraram que Proteobacteria e Verrucomicrobiota têm alta tolerância ao V e são as principais bactérias encontradas em ambientes contaminados por V.[ ] No entanto, em nsp1 e nsp2, as flutuações na abundância relativa de Proteobacteria foram maiores do que em R108, mas tais flutuações desapareceram quase completamente para Verrucomicrobiota (Figura S31, Informações de Apoio). Além de Bdellovibrionota, R108, ao contrário de nsp1 e nsp2, também foi associado ao biomarcador Nitrospirota, que está envolvido na fixação biológica dos elementos S e N.[ ] Portanto, além das rizobactérias associadas ao estresse por V, também havia bactérias associadas à ciclagem de nutrientes que servem como biomarcador de R108, e essas bactérias também eram abundantes.
Os achados acima mostraram que o acúmulo e a tolerância de V nas plantas estão relacionados a P, Fe e S. A análise de associação mostrou que múltiplos biomarcadores em R108 foram significativamente associados não apenas à concentração de V na parte aérea, mas também às concentrações de P, Fe e S, e esse fenômeno foi significativamente enfraquecido nos mutantes nsp1 e nsp2 com deficiência na simbiose (Figura 8). Esses biomarcadores foram identificados como membros de Acidobacteriota, Bdellovibrionota, Chloroflexota, Bacteroidota e Gemmatimonadota (Tabela S1, Informações de Apoio). Estudos anteriores mostraram que membros de Gemmatimonadota estão envolvidos na ciclagem geoquímica de elementos como P e S.[ ] Mais importante, algumas das bactérias em Acidobacteriota, Chloroflexota e Bacteroidota têm a capacidade de reduzir V pentavalente a V tetravalente, reduzindo assim a toxicidade de V para as plantas.[ ] Em nosso estudo, Gemmatimonadota, Chloroflexota, Acidobacteriota e Bacteroidota tiveram uma associação negativa significativa com as concentrações de V na parte aérea e nas raízes de R108 e uma associação positiva significativa com as concentrações de P, Fe e S (Figura 8a). A presença dessas bactérias pode promover o acúmulo de P, Fe e S enquanto reduz a toxicidade de V para R108. Além disso, houve vários biomarcadores em R108 que foram significativamente correlacionados positivamente com as concentrações de V na parte aérea e nas raízes (Figura 8a). A maioria deles pertence a Proteobacteria, que também parecem ter a capacidade de reduzir a toxicidade de V para as plantas.[ ] Portanto, R108 reduz o efeito tóxico de V sobre si mesma recrutando um grande número de rizobactérias benéficas que podem reduzir a toxicidade de V e promover a circulação de nutrientes, enquanto mutações em NSP1 e NSP2 causam defeitos nessa capacidade das plantas de recrutar rizobactérias.
Um modelo proposto é apresentado na Figura 8d,e. O V pode compartilhar as vias de transporte com P e S. O Fe pode interferir na absorção e acúmulo de V através da regulação do transporte de P. Mutações ou superexpressão dos genes transportadores de P, S e Fe podem aumentar a tolerância ao V em plantas em graus variados. A M. truncatula R108 do tipo selvagem foi capaz de regular ativamente a expressão dos genes transportadores de P, S e Fe para limitar a absorção e acúmulo de V e resistir à toxicidade do V. No entanto, a tolerância de R108 ao V e a resposta de expressão dos genes nas raízes dependeram amplamente da presença de simbiose com Rhizobium e/ou microrganismos do solo. As plantas R108 foram capazes de manter a diversidade da comunidade rizobacteriana sob estresse de V e regular ativamente a resposta cooperativa das rizobactérias ao estresse de V. Essas bactérias estavam significativamente associadas aos níveis de V, P, S e Fe nas plantas e conjuntamente auxiliavam ou regulavam a capacidade das plantas de lidar com o estresse de V. Quando NSP1 e NSP2 sofreram mutação, a simbiose entre raízes e rizóbios foi defeituosa. Subsequentemente, os genes transportadores de P, S e Fe não foram capazes de responder positivamente ou corretamente ao estresse de V, e a comunidade rizobacteriana tornou-se instável e sua capacidade de lidar com o V enfraqueceu. Portanto, a tolerância ao V dos mutantes nsp1 e nsp2 foi significativamente menor do que a de R108. Em termos de acúmulo de V e regulação da tolerância, como NSP1 e NSP2 regulam a expressão dos transportadores de P, S e Fe através da sinalização de nódulos e do microbioma rizosférico é uma questão científica complexa e desafiadora que merece maior exploração no futuro. Este estudo sugere que a simbiose de nódulos radiculares associada a NSP ou as próprias NSPs desempenham um papel importante na regulação do acúmulo e tolerância ao V em leguminosas, o que pode fornecer novas ideias para o manejo sustentável verde da poluição por V e proteção da saúde humana.
Seção Experimental
Materiais e Métodos
Neste estudo, o ecótipo R108 de M. truncatula foi utilizado como material controle para os mutantes de inserção Tnt1 nsp1 (NF9220), nsp2 (NF10950) e mtvpt3-1 (NF3062), obtidos do banco de dados Tnt1 da Noble Foundation (http://medicago‐mutant.noble.org/mutant/database.php). Os mutantes de Arabidopsis thaliana pht1;1, pht1;9, pho1, vpt1, irt1, sultr1;1, sultr1;2, sultr3;3/3;4/3;5, sultr3;1/3;2/3;3/3;5, sultr3;1/3;2/3;3/3;4/3;5, sultr4;1 e sultr4;2 estavam todos no background Columbia-0 (Col-0). A planta de superexpressão VPT1-OE e MtVPT3-OE foram baseadas em Col-0. Consulte as Informações de Apoio para mais detalhes. PCR é usado para triar indivíduos homozigotos com base nos primers listados na Tabela S1 (Informações de Apoio). Na3VO4 foi usado para o tratamento com V neste estudo. As concentrações de tratamento com V de M. truncatula e A. thaliana cultivadas em solo foram 0, 20, 200 e 2000 mg L⁻¹, respectivamente, em cultura de vermiculita foi 1000 mg L⁻¹, para a cultura hidropônica com solução Hoagland ½ força em HDAS foi 30 ou 100 mg L⁻¹, e em meio ágar ANS foi 5 mg L⁻¹.

O solo da rizosfera foi escovado das raízes das plantas, coletado e congelado a −80 °C antes do sequenciamento das rizobactérias. Após coletar a parte aérea e as raízes das plantas, elas foram secas e 30 mg do pó da amostra resultante foi coletado. Após digestão, foram feitas determinações das concentrações de V, P, Fe, S e Ca por espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) (ARCOS, SPECTRO Analytical Instruments GmbH, Alemanha). Brotos frescos de irt1 e Col-0 cultivados em vermiculita foram obtidos, dos quais amostras de 100 mg foram congeladas e moídas com nitrogênio líquido para determinação das concentrações de Pi. O método de ascorbato-molibdato-antimônio foi usado para esta determinação, conforme descrito anteriormente.[ ] O acúmulo de ROS em tecidos vegetais foi detectado por coloração com DAB e H2DCFDA. A fluorescência da clorofila das folhas foi medida usando um sistema de imageamento de fluorescência multiespectral cinético (Imaging-PAM, WALZ GmbH, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, e as razões F0, Fm e Fv/Fm foram analisadas. Brotos e raízes frescas foram coletados de plantas R108, nsp1 e nsp2 cultivadas em plano inclinado para extração de RNA. Após transcrição reversa em cDNA, foi realizada PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR), e MtACTIN (MTR_3g095530) foi usado como gene de controle interno. Os primers usados para qPCR estão listados na Tabela S1 (Informações de Apoio).
Em seguida, genes de rRNA 16S de regiões distintas (V4‐V5) foram amplificados usando primers específicos (515F‐806R) com um código de barras. A biblioteca foi sequenciada em uma plataforma Illumina NovaSeq. A análise de sequências foi realizada usando o software Uparse (Uparse v7.0.1001, http://drive5.com/uparse/). Sequências com ≥97% de similaridade foram atribuídas às mesmas unidades taxonômicas operacionais (UTOs). Uma sequência representativa para cada UTO foi selecionada para anotação adicional. A informação de abundância das UTOs foi normalizada usando o número de sequências correspondente à amostra com o menor número de sequências como padrão. A análise subsequente foi realizada com base nos dados normalizados de saída. Consulte as Informações de Apoio para métodos e procedimentos de teste detalhados.
Análise Estatística
Todos os dados foram expressos como média ± DP e analisados estatisticamente com o software estatístico SPSS 19.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, EUA) usando o teste de múltiplos intervalos de Duncan P < 0,05 e testes t de amostras independentes (* P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001). A β-diversidade foi analisada usando análise de coordenadas principais (PCoA) com base na distância de Bray–Curtis, e a PERMANOVA foi usada para analisar diferenças significativas. A construção de redes de coocorrência rizobacterianas envolveu a filtragem de grupos de baixa frequência com um limiar de triagem definido, padronização usando contagens por milhão e realização de análise de correlação de Spearman entre as UTOs, identificando assim correlações positivas significativas (ρ > 0,7 e p < 0,05). Biomarcadores foram identificados usando o algoritmo de Random Forests.
Conflito de Interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Contribuições dos Autores
J.L. desenhou a pesquisa. P.L., X.Z., L.L., Y.C. e X.L. realizaram a pesquisa, com contribuições de L.Y. e J.Y. J.L., P.L. e X.Z. analisaram os dados. H.G. contribuiu com novos reagentes/ferramentas analíticas. J.W. e K.S.M. construíram os mutantes de inserção Tnt1. J.L. e P.L. escreveram o manuscrito, com contribuições de X.Z. e L.L. J.L. obteve financiamento para este projeto.
Informações de Apoio
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que suportam as descobertas deste estudo estão disponíveis no material suplementar deste artigo.
Metais Pesados em Solos: Metais Traço e Metaloides em Solos e sua Biodisponibilidade