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pmid: "33319819"
title: "A luz UVC modula a biossíntese de vitamina C e compostos fenólicos em frutos de acerola: papel do aumento da atividade mitocondrial e da produção de EROs."
authors: "Rabelo MC, Bang WY, Nair V, Alves RE, Jacobo-Velázquez DA, Sreedharan S, de Miranda MRA, Cisneros-Zevallos L"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2020 Dec 15"
doi: "10.1038/s41598-020-78948-1"
source: "PMC Full Text"

A luz UVC modula a biossíntese de vitamina C e compostos fenólicos em frutos de acerola: papel do aumento da atividade mitocondrial e da produção de EROs.

Autores

Rabelo MC, Bang WY, Nair V, Alves RE, Jacobo-Velázquez DA, Sreedharan S, de Miranda MRA, Cisneros-Zevallos L

Periodico

Scientific reports (2020 Dec 15)

Conteudo

A luz UVC modula a biossíntese de vitamina C e compostos fenólicos em acerola: papel do aumento da atividade mitocondrial e da produção de ROS
Os efeitos da luz ultravioleta-C (UVC) sobre a vitamina C e compostos fenólicos em acerola durante o armazenamento pós-colheita foram investigados para elucidar o mecanismo que induz os sistemas antioxidantes. Os frutos, armazenados a 10 °C por 7 dias após uma irradiação UVC hormética (dois pulsos de 0,3 J/cm²), apresentaram degradação significativamente menor de vitamina C e compostos fenólicos do que o controle sem o desafio UVC. A UVC ativou a L-galactono-1,4-lactona desidrogenase (GalDH), uma enzima chave para a biossíntese de vitamina C, e alterou a composição de compostos fenólicos, por meio da biossíntese fenólica, em acerola durante o armazenamento pós-colheita. A UVC também induziu produções de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tempos imediato (dia 0) e tardio (dia 7) durante o armazenamento pós-colheita através da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e da NADPH oxidase, respectivamente. Os resultados sugerem que a UVC ajuda na retenção do teor de vitamina C e fenólicos em acerola ao alterar o metabolismo do ácido ascórbico e fenólico por meio de um aumento na atividade mitocondrial e um mecanismo mediado por ROS. Os dados mostraram os efeitos benéficos da UVC na manutenção da qualidade nutracêutica da acerola durante o armazenamento pós-colheita e forneceram novos insights para a compreensão do mecanismo pelo qual a irradiação UVC melhora o sistema antioxidante em frutas.

Introdução
O consumo de frutas tropicais aumentou significativamente nos últimos anos devido ao seu sabor atraente e valor nutricional, que inclui antioxidantes como vitaminas e compostos fenólicos. No entanto, essas frutas são altamente perecíveis com vida útil limitada devido à deterioração qualitativa e quantitativa durante o armazenamento pós-colheita, que é mediada por um processo rápido de maturação e senescência. Para preservar sua qualidade durante o armazenamento, várias técnicas pós-colheita foram desenvolvidas para retardar a senescência, entre as quais a irradiação ultravioleta (UV) tem recebido muita atenção devido aos seus efeitos no crescimento microbiano superficial, extensão da vida útil do produto e indução da biossíntese de antioxidantes fenólicos.
Os principais antioxidantes hidrossolúveis presentes nas frutas são a vitamina C (ácido L-ascórbico) e os compostos fenólicos. A vitamina C (ácido L-ascórbico) é sintetizada a partir de D-glicose em plantas por enzimas incluindo GDP-D-manose pirofosforilase (GMP), GDP-manose 3′,5′-epimerase (GME), GDP-L-galactose fosforilase (GGP), L-galactose desidrogenase (GDH) e L-galactono-1,4-lactona desidrogenase (GalDH). Por outro lado, os compostos fenólicos são sintetizados via metabolismo fenilpropanoide, cuja enzima chave é a fenilalanina amônia liase (PAL).
A acerola (Malpighia emarginata D.C.) é uma fruta tropical, bem conhecida como uma fruta saudável devido ao seu alto teor de compostos nutracêuticos como fenólicos e vitamina C, tornando a acerola um bom modelo para estudar o metabolismo desses compostos. Além disso, a acerola é uma fruta altamente perecível com rápida perda da qualidade nutracêutica durante sua vida pós-colheita. Há necessidade do uso de técnicas pós-colheita como UVC que possam preservar a qualidade e prolongar sua vida útil pós-colheita.

A luz UVC (200–280 nm), que faz parte da região UV (100–400 nm), é um estresse abiótico com efeito germicida sobre microrganismos como bactérias, leveduras, fungos e vírus. É considerada uma tecnologia emergente não térmica de baixo custo e estudos recentes mostram potencial para garantir a segurança microbiológica de produtos vegetais e manter suas características nutricionais. Como tratamento pós-colheita, a irradiação UVC em baixas doses prolonga a vida pós-colheita e preserva a qualidade de frutas tropicais, retardando o amadurecimento e a senescência dos frutos, enquanto a irradiação em altas doses induz efeitos prejudiciais. A irradiação UVC aumenta a atividade antioxidante e o teor nutracêutico das frutas, associado a um aumento de fenóis e flavonoides em goiaba e banana durante o armazenamento após uma exposição UVC de 30 min. A UVC reduziu significativamente a deterioração em morango armazenado a 10 °C, aumentando a atividade de enzimas antioxidantes e antioxidantes não enzimáticos glutationa (GSH) e compostos fenólicos. A radiação UVC também reduziu a deterioração devido ao amadurecimento excessivo em mirtilos, aumentando os níveis antioxidantes. Aumentos significativos nos teores de flavonoides e fenólicos totais foram encontrados em frutas de tangerina tratadas com 1,5 e 3,0 kJ/m2 de UVC e armazenadas por 3 dias, resultados semelhantes foram relatados para mamão. Esses dados sugerem que doses subletais de UVC medeiam a indução de sistemas antioxidantes como resposta secundária ao estresse ambiental, resultando na extensão da vida pós-colheita e qualidade de uma variedade de frutas. No entanto, o mecanismo pelo qual a irradiação UVC aumenta o nível antioxidante nas frutas permanece desconhecido.

Foi hipotetizado que a produção de ROS induzida por UVC pode mediar o aumento do potencial antioxidante. O radical superóxido (O2·−) como uma ROS primária desencadeia uma cascata de reações químicas levando à formação de várias ROS e induz compostos antioxidantes como polifenóis através de fatores de transcrição MYB. No entanto, permanece desconhecido se a UVC aumenta as enzimas antioxidantes como SOD, CAT, POD, APX e GR através de um mecanismo mediado por ROS em frutas.
Foi relatado que um aumento súbito no nível intracelular de ROS é atribuído a distúrbios no equilíbrio entre a produção e a eliminação de ROS, afetado por diversos estresses abióticos, incluindo ferimentos, salinidade, radiação UV, seca, metais pesados, temperaturas extremas, deficiência de nutrientes e poluição do ar. Para a adaptação das células vegetais aos estresses abióticos, as mitocôndrias desempenham um papel central no controle da geração de ROS por meio de sistemas dissipadores de energia. A cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) possui elétrons com energia livre suficiente para reduzir diretamente o O2, o que é considerado uma fonte primária de geração de ROS mitocondrial, e especialmente os complexos I e III da ETC mitocondrial são os locais mais conhecidos de produção de O2·−. Se a ETC estiver sob excesso de energia devido à irradiação UVC, que contém fótons de alta energia conforme descrito acima, isso pode levar à geração súbita de ROS através dos complexos I e III da ETC. Uma geração súbita de ROS pode reduzir as chances de produção de ROS em larga escala em um momento posterior após o desafio de estresse, dissipando o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ), conforme demonstrado em estudos anteriores com mitocôndrias de trigo.

Aqui investigamos o uso de UVC aplicado a frutos de acerola e seus efeitos na vitamina C e genes biossintéticos associados, metabólitos fenólicos e enzimas relacionadas ao seu metabolismo. Aqui propomos o modo de ação pelo qual o UVC modula os níveis de vitamina C e polifenóis em frutos de acerola através do aumento da atividade mitocondrial e da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Nossos dados fornecem novos insights para a compreensão do mecanismo pelo qual a irradiação UVC aumenta o conteúdo de antioxidantes em frutos.

Resultados

Efeito do UVC no conteúdo de vitamina C e na síntese enzimática

Efeito do UVC no metabolismo da vitamina C. Frutos de acerola sem (UV−) ou com tratamento UVC (UV+), foram armazenados a 10 °C por 0 dia (Dia 0) ou 7 dias (Dia 7) e submetidos à quantificação de vitamina C total (A), AsA (C), DHA (D) e ensaio de atividade da GalDH (B). Os dados, obtidos de pelo menos três repetições biológicas, são apresentados como valores de média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo teste ANOVA/Tukey-HSD (p < 0,05), enquanto os asteriscos em (A) e (C) representam diferenças significativas entre as amostras tratadas com UVC (UV−) e não tratadas (UV+) apenas no Dia 7, usando o teste t de Student (p < 0,05).
O teor inicial de vitamina C (~ 15.000 mg/100 g de peso seco) diminuiu durante o armazenamento da acerola. No entanto, os efeitos da irradiação UVC no metabolismo da vitamina C mostraram que a vitamina C total foi significativamente maior após 7 dias de armazenamento (~ 54%), quando comparada ao controle (Fig. 1a). Como a vitamina C existe predominantemente em sua forma reduzida, ascorbato (AsA), as acerolas foram avaliadas quanto à sua forma reduzida e oxidada, desidroascorbato (DHA) (Fig. 1c,d). Após o armazenamento, as amostras tratadas com UVC apresentaram um teor de AsA significativamente maior (~ 37%) do que o controle (Fig. 1c), no entanto, tanto as amostras controle quanto as tratadas com UVC não apresentaram diferença significativa no teor de DHA (Fig. 1d). Esses resultados indicam que o UVC ajuda na retenção da vitamina C, especialmente do AsA reduzido, da degradação durante o armazenamento pós-colheita da acerola.

A L-galactono-1,4-lactona desidrogenase (GalDH), uma enzima chave na produção de vitamina C, catalisa a oxidação da L-galactono-1,4-lactona em ácido ascórbico, a última etapa da síntese de ácido ascórbico. Conforme mostrado na Fig. 1b, a atividade da GalDH diminuiu drasticamente após 7 dias de armazenamento nos frutos controle, no entanto, o tratamento com UVC induziu a atividade da GalDH imediatamente no dia 0 após a irradiação, que se manteve mesmo 7 dias após o tratamento acima dos níveis do controle. Estudos anteriores mostraram o aumento de AsA por outros estresses, incluindo metil jasmonato e ativação da GalDH por ferimento.

Efeitos do UVC na expressão de genes da biossíntese de vitamina C

Efeitos do UVC na expressão de genes relacionados ao metabolismo da vitamina C. Frutos de acerola sem (UV−) ou com tratamento UVC (UV+), foram armazenados a 10 °C por 0 dia (Dia 0) ou 7 dias (Dia 7). Não detectável (ND), provavelmente causado pela oxidação dos RNAs dos frutos. Dados, obtidos de repetições em triplicata, são apresentados como valores de média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo ANOVA/Tukey-HSD (p < 0,05).

Conforme mostrado na Fig. 2, a irradiação UVC não apresentou efeitos significativos nas expressões gênicas responsáveis pelas enzimas GDP-D-manose pirofosforilase (GMP), GDP-manose 3′,5′-epimerase (GME), GDP-L-galactose fosforilase (GGP), L-galactose desidrogenase (GDH) e GalDH, envolvidas no metabolismo da vitamina C. Particularmente, a solução de RNA, preparada a partir de frutos 7 dias após o tratamento UVC, apresentou coloração marrom, resultando em que quaisquer sinais fluorescentes, correspondentes à amplificação por PCR, por todos os conjuntos de primers utilizados não foram detectáveis (N.D.), o que se presume ser causado pela oxidação dos RNAs dos frutos (Fig. 2).

Efeito do UVC no teor e composição de fenólicos

Efeito do UVC no teor de compostos fenólicos totais. Frutos de acerola sem (UV−) ou com tratamento UVC (UV+), foram armazenados a 10 °C por 0 dia (Dia 0) ou 7 dias (Dia 7) e submetidos à quantificação de compostos fenólicos totais por análise de LC–MS (Tabela 1). Dados, obtidos de pelo menos três repetições biológicas, são apresentados como valores de média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo ANOVA/Tukey-HSD (p < 0,05).
Os efeitos da UVC no conteúdo de fenólicos totais em acerolas durante o armazenamento pós-colheita foram investigados (Fig. 3). Os resultados mostraram que o conteúdo de fenólicos totais diminuiu nos frutos de acerola logo após o tratamento com UVC em ~44%. No entanto, o conteúdo de fenólicos totais diminuiu significativamente menos nas amostras tratadas com UVC em comparação com os frutos controle após 7 dias (Fig. 3), apresentando ~82% mais fenólicos do que os controles. Esses resultados indicam que a UVC melhora a retenção de fenólicos em acerolas durante o armazenamento pós-colheita.
Efeito dos tratamentos com luz UVC no conteúdo de ácidos fenólicos e flavonoides do fruto da acerola determinado por LC-MS. Os valores representam a concentração (mg fenólicos/100 g de acerola liofilizada).
Pico Tempo de retenção (min) Identificação Dia 0 Dia 7 UV− UV+ UV− UV+ 1c 19,5–20,5 Ácido gálico 2,9 a 1,3 d 2,3 b 1,5 c 1d 21,3–22,5 Ácido cumaroil quínico 4,0 c 5,3 b 3,9 c 8,1 a 1e 30,25 Cianidina 3-ramnosídeo 1152 a 416 b 47 d 276 c 2 33,03 Pelargonidina 3-ramnosídeo 155 a 60 b 25 c 52 b 3 37,37 Pelargonidina 4 b 7 a 0,37 d 1,6 c 4 41,32 Peonidina-3-xilopiranosídeo 28 b 156 a ND 6 c 5 46,19 Cianidina 3-rutinosídeo 12 c 67 a ND 19 b 6 47,04 Kaempferol 3-O-robinobiosídeo-7-O-arabinofuranosídeo 3 c 1,47 d 5,5 a 3 b 7 53,18 Isorhamnetina 3-O-galactosídeo 3 a 3 a ND 2,7 b 8 56,06 Isorhamnetina 3-O-glucosídeo 17 d 21 c 37 b 43 a 9 57,16 Isorhamnetina 1,2 b 1,1 c 1,3 a ND 10 60,4 Kaempferol 7-O-neohesperidosídeo 5 b 3,3 c 3,1 d 7 a 11 65,88 Kaempferol 3-O-arabinofuranosídeo 10,5 d 13,8 c 17,6 b 18,1 a 12 67,19 Quercetina 3-O-glucosídeo 2,8 b 2,8 b 0,5 c 4,7 a 13 70,38 Quercitrina-2″-O-galato 1,1 b 0,8 d 1,9 a 1,0 c 14 73,88 Miricetina-3-O-glucuronídeo 0,1 b 14,3 a ND ND 15 74,36 Miricetina-3-O-glucosídeo 16,1 b 0,1 c 0,25 c 25,1 a 16 76–77,85 Miricetina ramnosídeo 107 c 74 d 196 a 167 b
Os valores representam a média de três réplicas. Valores com letras diferentes dentro do mesmo composto representam diferença estatística (p < 0,05) pelo teste HSD de Tukey. Os valores de concentração para cada tipo de composto foram determinados a partir das áreas dos picos do cromatograma e dos padrões (Tabela S1). As áreas dos picos 1e a 5 foram quantificadas a 520 nm (Fração F4) e as áreas dos picos 1c, 1d, 6–16 foram quantificadas a 330 nm (Fração F3).
ND não detectado.
Extratos brutos foram separados em quatro frações e cromatogramas líquidos revelaram que amostras tratadas com UV e controle apresentaram vários picos nas frações F3 e F4 com cromatogramas semelhantes (Fig. S1). Os picos foram identificados por espectrometria de massa em F3 como ácidos fenólicos (picos 1c, 1d), derivados de kaempferol (picos 6, 10, 11), isorhamnetina e derivados (picos 7, 8, 9), glicosídeos de quercetina (picos 12, 13) e derivados de miricetina (picos 14–16), enquanto em F4 os picos foram identificados como glicosídeos de cianidina (picos 1e, 5), derivados de pelargonidina (picos 2, 3) e glicosídeo de peonidina (pico 4) (Fig. S1, Tabela S1). A quantidade total de fenólicos no dia 0 foi de ~1526 mg/100 g de peso seco nas amostras controle, contendo ~0,45, 10,9 e 88,6% de ácidos fenólicos, flavonóis e antocianinas, respectivamente. Os flavonóis mais abundantes foram os picos 8, 11, 15, 16 e, para as antocianinas, os picos 1e e 2 (Fig. S1, Tabela 1). Detalhes das identificações dos picos são apresentados como informações suplementares.

Com base nos cromatogramas, houve uma diminuição na maioria dos flavonóis no dia 0 após o tratamento com UVC em comparação com os controles (p < 0,05), no entanto, no dia 7 houve um aumento na maioria dos picos, incluindo os picos mais abundantes 8, 11 e 16 (31–125%, p < 0,05) tanto para as amostras tratadas com UVC quanto para os controles, provavelmente associado ao processo normal de amadurecimento e ao efeito adicional do tratamento com UVC, enquanto os picos de flavonóis 10, 12, 15 foram apenas aumentados pelo UVC no dia 7 (67–125%, p < 0,05) (Fig. S1, Tabela 1). Por outro lado, para as antocianinas no dia 0, houve uma diminuição nos picos 1e e 2 (61–63%, p < 0,05) e um aumento nos picos 3, 4 e 5 (75–458%, p < 0,05) para as amostras tratadas com UVC em comparação com os controles, enquanto no dia 7 houve uma diminuição drástica em todos os picos para as amostras controle, mas essa diminuição foi menor para as amostras tratadas com UVC (p < 0,05) (Fig. S1, Tabela 1). Para os ácidos fenólicos picos 1c e 1d, as alterações foram menos evidentes, com apenas o ácido cumaroilquínico mostrando um aumento maior no dia 7 para os frutos tratados com UV em comparação com os controles (~52%). Dessa forma, o UVC levou à biossíntese de polifenóis e induziu alterações nos perfis fenólicos da acerola.

Efeito do UVC nas atividades enzimáticas da fenilalanina amônia-liase (PAL) e polifenol oxidase (PPO)

Efeito do UVC na atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL) e polifenol oxidase (PPO). Frutos de acerola sem (UV−) ou com tratamento UVC (UV+) foram armazenados a 10 °C por 0 dia (Dia 0) ou 7 dias (Dia 7) e submetidos ao ensaio de PAL (A) e ao ensaio de PPO (B). Os dados, obtidos de pelo menos três repetições biológicas, são apresentados como valores de média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo ANOVA/Tukey-HSD (p < 0,05).
UVC induziu um aumento na atividade da PAL em comparação com os controles no dia 0 (Fig. 4a) e esse aumento na atividade da PAL devido à UVC foi maior no dia 7 (Fig. 4a), confirmando que a UVC induziu a biossíntese de polifenóis em acerola. O efeito da UVC na atividade da PPO também foi investigado (Fig. 4b). A atividade da PPO aumentou significativamente apenas após 7 dias de irradiação com UVC, quando comparada ao controle. Isso sugere que o aumento na atividade da PPO observado durante o armazenamento das amostras tratadas com UVC potencializou a conversão de fenóis em o-quinonas, que eventualmente polimerizarão em pigmentos marrons. No entanto, isso aparentemente contradiz resultados anteriores mostrados (Fig. 3) onde as amostras tratadas com UVC apresentaram conteúdo fenólico total significativamente maior do que o controle no dia 7. Esse fenômeno observado pode ser explicado com base na cinética da PAL e da PPO, conforme descrito na seção "Discussão".

Produção de ROS, atividades da NADPH oxidase e da desidrogenase mitocondrial

Efeito da UVC na produção de ROS e na atividade da NADPH oxidase (NOX). Frutos de acerola sem (UV−) ou com tratamento com UVC (UV+) foram armazenados a 10 °C por 0 dia (Dia 0) ou 7 dias (Dia 7) e submetidos à medição de ROS (A) e ao ensaio de NOX (B). O DPI 350 µM em (B) foi utilizado como inibidor de NOX para confirmar que o superóxido foi gerado a partir da NOX. Os dados, obtidos de pelo menos três repetições biológicas, são apresentados como valores de média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo ANOVA/Tukey-HSD (p < 0,05).

Os efeitos da UVC no nível de ROS em acerola durante o armazenamento pós-colheita foram investigados. Conforme mostrado na Fig. 5a, a UVC aumentou significativamente os níveis de ROS em 30% e 70% no dia 0 e no dia 7, respectivamente, em comparação com os controles.

Efeito da UVC na atividade da desidrogenase mitocondrial. Frutos de acerola, sem (UV−) ou com o tratamento com UVC (UV+) foram armazenados a 10 °C por 0 dia (Dia 0) ou 7 dias (Dia 7) e submetidos ao ensaio de MTS. Os dados, obtidos de pelo menos três repetições biológicas, são apresentados como valores de média ± EP. Letras diferentes indicam diferenças significativas pelo ANOVA/Tukey-HSD (p < 0,05).

A NADPH oxidase (NOX) localizada na membrana plasmática e a cadeia de transporte de elétrons (ETC) respiratória das mitocôndrias foram relatadas como principais fontes de produção de ROS devido a estresses ambientais. Assim, as atividades da NOX e da desidrogenase mitocondrial, um componente da ETC, foram avaliadas. Tanto a desidrogenase mitocondrial quanto as atividades da NOX foram estimuladas pela UVC. O tratamento aumentou a atividade da NOX (Fig. 5b) apenas após 7 dias de armazenamento, enquanto a desidrogenase mitocondrial aumentou imediatamente após o tratamento com UVC, no dia 0 (Fig. 6). Os resultados sugerem que as produções de ROS podem ser induzidas em tempos imediatos e tardios após a irradiação com UVC através da ETC mitocondrial e da NOX, respectivamente.
É importante ressaltar que o aumento observado no ensaio de redução do MTS, que mede indiretamente a atividade da desidrogenase, deve-se a um aumento nos níveis de NADH, que também pode estar associado à maior atividade da glicólise, além da atividade mitocondrial, sendo ambas uma resposta associada a um aumento da atividade respiratória.

Discussão

A UVC altera os metabolismos dos compostos fenólicos e da vitamina C em acerola durante o armazenamento pós-colheita

Os compostos fenólicos foram significativamente mais retidos nas amostras de acerola tratadas com UVC em comparação aos controles após 7 dias de armazenamento (Fig. 3). Em estudos anteriores, foi proposto que as quantidades reais de compostos fenólicos medidas resultam de um equilíbrio entre a taxa de síntese fenólica (ks) e sua taxa de diminuição ou utilização (kd). A diminuição dos compostos fenólicos em ambas as amostras tratadas com UVC e não tratadas durante 7 dias de armazenamento pós-colheita (Fig. 3) pode estar associada a um kd > ks, e o maior teor de compostos fenólicos na amostra tratada com UV após 7 dias de armazenamento pós-colheita em comparação aos controles (Fig. 3) pode estar associado a um ks (UV+) > ks (UV−). O kd, associado a uma diminuição dos compostos fenólicos durante o armazenamento pós-colheita, pode ser atribuído parcialmente à oxidação fenólica pela PPO. No presente estudo, a atividade da PPO aumentou significativamente aos 7 dias após a irradiação com UVC (Fig. 4b), o que está associado a um kd (UV+) > kd (UV−) e pode ser causado pela indução de um sistema de defesa vegetal, por exemplo, um aumento da expressão da PPO responsiva ao estresse. Simultaneamente, com o aumento da atividade da PPO devido à UVC, houve um aumento na atividade da PAL no dia 0 e um aumento significativamente maior no dia 7, confirmando a biossíntese de polifenóis em acerola com o tratamento com UVC (Fig. 4a). Esse aumento na atividade da PAL, juntamente com a atividade da PPO, alterou os perfis de ácidos fenólicos, flavonóis e antocianinas, favorecendo sua retenção nas amostras tratadas com UVC em comparação aos controles no dia 7 (Fig. S1, Tabela 1). Assim, a UVC pode alterar o equilíbrio entre o ks e o kd, resultando na retenção parcial da quantidade total de fenólicos e na alteração de seu perfil.
No dia 0, houve uma diminuição significativa nas duas principais antocianinas e nos derivados de mirecetina em frutos de acerola tratados com UV (Tabela 1), provavelmente devido à interação das ERO geradas pelo UVC e desses fenólicos pré-existentes presentes na casca (por exemplo, antocianinas em células epidérmicas adjacentes à cutícula cerosa da casca). Curiosamente, também houve um aumento no conteúdo de alguns flavonóis e antocianinas minoritários, o que pode estar associado ao aumento da atividade da PAL observado no dia 0 nas amostras tratadas com UVC (Fig. 4b, Tabela 1). Estudos anteriores relataram formas inativas de PAL, que podem ser ativadas, sugerindo que, no presente estudo, o UVC pode reverter a forma inativa da PAL no dia 0 e induzir a síntese de novo de PAL no dia 7. Mais trabalhos são necessários para elucidar a hipótese de reversão da PAL inativa proposta aqui no dia 0 e para confirmar a regulação positiva das expressões de PAL e PPO durante o armazenamento. Seria importante considerar outros elementos em estudos futuros, como compartimentalização, isoformas, glicosilação, para entender seu possível papel na alteração do metabolismo fenólico induzida por UVC.

Identificamos que a vitamina C total, especialmente o AsA, foi significativamente mais retida nas amostras tratadas com UVC após 7 dias de armazenamento pós-colheita do que nas não tratadas (Fig. 1a,c,d). Isso também sugere que o UVC pode alterar o equilíbrio entre a taxa de síntese de vitamina C (ks) e sua taxa de diminuição ou utilização (kd), conforme mostrado na relação entre ks e kd dos compostos fenólicos. A diminuição observada na vitamina C total e no AsA tanto nas amostras tratadas com UVC quanto nas controle após 7 dias (Fig. 1a,c) pode estar associada a um kd > ks, mas a maior retenção de vitamina C total e AsA na amostra tratada com UV após 7 dias de armazenamento em comparação com os controles (Fig. 1a,c) estaria associada a um ks (UV+) > ks (UV-), indicando que a biossíntese de vitamina C é aumentada pela irradiação UVC.
A GalDH é uma enzima chave na produção de vitamina C através da oxidação da L-galactono-1,4 lactona na etapa final da biossíntese de vitamina C. No presente estudo, a atividade da GalDH foi aumentada imediatamente no dia 0 após a irradiação UVC e diminuiu significativamente menos na amostra tratada com UV após 7 dias de armazenamento pós-colheita do que nos controles (Fig. 1b), apesar de a atividade da GalDH ter diminuído drasticamente tanto nas amostras tratadas com UVC quanto nas não tratadas após 7 dias de armazenamento pós-colheita (Fig. 1b). Isso prova que o UVC altera o equilíbrio entre ks e kd ao aumentar a biossíntese de vitamina C, pois ks (UV+) > ks (UV-).
O aumento observado na atividade da GalDH pode ser devido a duas possibilidades: primeiro, a UVC pode mediar a mudança conformacional para uma estrutura da GalDH (isto é, fosforilação) para ter a atividade enzimática aumentada e, segundo, pode desencadear a expressão da GalDH por meio de vias de sinalização desconhecidas, resultando no aumento do nível de proteínas GalDH. No entanto, a UVC não mostrou efeitos significativos nas expressões dos genes GMP, GME, GGP, GDH e GalDH (Fig. 2). Assim, neste caso, a atividade da GalDH foi altamente aumentada no momento imediato após a irradiação com UVC pela mudança estrutural induzida por UVC, em vez da produção de enzimas.
A UVC desencadeia produções de ROS através do ETC mitocondrial e NOX para as vias de sinalização primária e secundária
Neste estudo, a medição de ROS usando DCFDA mostrou que a produção de ROS foi induzida nos tempos imediato (dia 0) e tardio (dia 7) após a irradiação com UVC (Fig. 5a).
Como ocorre a ROS em frutas após a irradiação com UVC? Aqui sugerimos três respostas possíveis. Primeiro, a UVC pode produzir diretamente radicais livres, responsáveis pela geração de ROS, através de reação fotoquímica porque seus fótons têm energia suficiente para destruir ligações químicas. No entanto, neste estudo, esse efeito direto pode ter pouca contribuição para a produção de ROS devido ao curto pulso de irradiação com UVC em uma dose baixa (0,6 J/cm2).
Segundo, o O2·− pode ser produzido a partir das mitocôndrias após a irradiação UVC e desempenhar um papel importante em uma resposta primária para ativar respostas secundárias para a defesa da planta. Isso é apoiado pelo nosso resultado em que a atividade da desidrogenase mitocondrial, bem como a produção de ROS, foi aumentada imediatamente após a irradiação UVC (Figs. 5a, 6), enquanto a atividade da NOX, um dos sistemas de defesa vegetal representativos, foi aumentada apenas no período tardio após o tratamento de irradiação (Fig. 5b). O aumento repentino de ROS causado por UVC também foi observado nas mitocôndrias de protoplastos de Arabidopsis por microscopia de fluorescência. O complexo I da ETC mitocondrial inclui desidrogenases, cujas atividades podem refletir a atividade respiratória das mitocôndrias. Na Fig. 6, a atividade da desidrogenase mitocondrial aumentou significativamente mais nos controles de 7 dias do que nos frutos controle de 0 dia, indicando que a atividade respiratória aumentou na acerola durante o armazenamento pós-colheita. Sabe-se que o desenvolvimento de deterioração e senescência de produtos colhidos é geralmente proporcional à taxa de respiração e esse fenômeno tem sido descrito em diferentes culturas, como batata e pêssego. Em contraste, a atividade da desidrogenase mitocondrial foi significativamente menor na acerola tratada com UVC aos 7 dias após o armazenamento em comparação com o fruto irradiado com UVC no dia 0 (Fig. 6), o que pode ser causado pelos sistemas dissipadores de energia, conforme descrito anteriormente. O complexo I mitocondrial também inclui a GalDH responsável pela biossíntese de vitamina C, que foi ativada imediatamente após a irradiação UVC (Fig. 1b), presumivelmente por meio de modificação pós-traducional de proteínas. Assim, o excesso de energia mediado por UVC no complexo I da ETC pode contribuir para a mudança estrutural da GalDH para o aumento da atividade enzimática no início, bem como para a produção repentina de ROS, conforme descrito acima.
Finalmente, o radical superóxido também é gerado pela NADPH oxidase (NOX) localizada na membrana plasmática, como uma resposta da planta a um estresse ambiental, como UVC, o que é claramente comprovado pelos nossos resultados de que a atividade da NOX foi ativada apenas no período tardio após a irradiação UVC (Fig. 5b), resultando em aumento da produção de ROS nesse período tardio (Fig. 5a). Além disso, sugere-se que o aumento da atividade da NOX no período tardio após a irradiação UVC pode ser atribuído a um aumento da sinalização mediada por Ca2+ e possivelmente à expressão gênica da NOX. O destino do O2·−, desencadeado no período tardio, seria o seguinte: o O2·− gerado pela NOX é convertido em H2O2 pela SOD, que pode funcionar como uma via de sinalização chave mediada por ROS para induzir a expressão de genes como PAL e CHS responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários com capacidade antioxidante.
Modelo mecanicista das vias de sinalização de estresse por UVC em acerola. Na resposta imediata ao UVC, ocorre uma explosão inicial de ROS mediada principalmente por um sistema dissipador de energia mitocondrial e, em segundo lugar, por uma ionização parcial da água. Este último mecanismo pode contribuir para o pool total de ROS gerado, enquanto o primeiro mecanismo gera um aumento na glicólise e na atividade mitocondrial (atividade desidrogenase) produzindo altos níveis de NADH e ROS. Simultaneamente, a GalDH é ativada promovendo a síntese de ácido ascórbico (ks). As ROS mitocondriais geradas desencadeiam uma resposta precoce de aumento dos níveis de [Ca2+]cit, que ativa a NADPH oxidase gerando uma segunda explosão de ROS em tempo tardio. Isso, por sua vez, desencadeia um aumento na expressão gênica e proteica e na atividade de PAL e PPO. O conteúdo final de fenólicos sob UVC em tempo tardio depende da cinética relativa da síntese de fenólicos (ks) e da diminuição (kd) associada a PAL e PPO. Os níveis imediatamente aumentados de ROS mitocondriais também induzem uma degradação parcial de fenólicos pré-existentes e uma ativação precoce de PAL inativa, enquanto o ácido ascórbico gerado desempenha um papel na modulação dos níveis de ROS de fontes de NADPH oxidase em tempo tardio, causando degradação da vitamina C (kd) e contribuindo, em última análise, para a quantidade total de fenólicos sintetizados na resposta tardia. Espécies reativas de oxigênio (ROS); superóxido dismutase (SOD); fenilalanina-amônia-liase (PAL); polifenol oxidase (PPO); L-galactono-1,4-lactona desidrogenase (GalDH); ks (taxa de síntese); kd (taxa de diminuição ou utilização).
Em conclusão, os resultados mostraram que doses horméticas de irradiação UVC ajudam na retenção de vitamina C e conteúdo fenólico em acerola, alterando o metabolismo da vitamina C e dos fenólicos através de um aumento na atividade mitocondrial e um modo de ação mediado por ROS. Além disso, os resultados também forneceram novos insights para entender o mecanismo pelo qual a irradiação UVC melhora o sistema antioxidante em frutas, conforme descrito no modelo proposto na Fig. 7. Neste modelo, a UVC induz excesso de energia na ETC mitocondrial, levando a um aumento de ROS e atividade aumentada de GalDH imediatamente após o tratamento. As ROS iniciais funcionam como uma molécula sinal primária (explosão inicial de ROS) para ativar respostas da planta, como sistemas de defesa vegetal, incluindo indução da atividade de NOX e PAL, e a ativação precoce de GalDH pode aumentar a biossíntese de vitamina C, prevenindo diminuições em sua concentração ao alterar o equilíbrio entre ks e kd do metabolismo da vitamina C em acerola durante o armazenamento pós-colheita. Além disso, as ROS geradas por NOX em tempo tardio após a irradiação UVC (segunda explosão de ROS) podem desempenhar um papel importante como molécula sinal secundária para induzir a expressão de genes como PAL e PPO responsáveis pela biossíntese de compostos fenólicos e sua utilização, alterando o equilíbrio entre ks e kd do metabolismo fenólico em acerola durante o armazenamento pós-colheita. Em conjunto, nosso estudo pode contribuir para o desenvolvimento de técnicas avançadas de pós-colheita baseadas em dose hormética de UVC para prolongar a vida pós-colheita de frutas comerciais.

Materiais e métodos

Material vegetal

Frutos de acerola (Malpighia emarginata DC) foram obtidos em 2013 de um mercado local (Fortaleza, Estado do Ceará, Brasil), onde todos os frutos são vendidos um dia após a colheita na maturidade fisiológica (quando a cor do fruto é metade verde e metade laranja-avermelhada). Antes dos tratamentos com UVC, os frutos foram selecionados por cor e tamanho, e então lavados com água destilada, secos e divididos em dois grupos incluindo controle e tratamento com UVC, respectivamente. Os frutos selecionados apresentaram teor de umidade de ~ 90%, ~ 10 sólidos solúveis e valores médios de cor de Hue = 25°, L = 70 e Chroma = 25.

Tratamento com UVC e armazenamento
O tratamento com UVC foi realizado na EMBRAPA Agroindústria Tropical (Fortaleza, Brasil) utilizando um Sistema XeMaticA–2LXL (SteriBeam Systems GmbH, Alemanha). Os frutos foram tratados duas vezes com pulsos de UVC de 0,3 J cm−2 (dose total de 0,6 J cm−2). Após o tratamento, os frutos tratados com UVC e os frutos controle não tratados foram imediatamente processados, consistindo em amostras no dia 0, e a outra metade das amostras foi armazenada em refrigerador a 10 °C por 7 dias, quando foram processadas. O processamento consistiu em homogeneização usando um liquidificador seguida de liofilização a −55 °C em um liofilizador L202 (Liotop, São Carlos, Brasil). As amostras liofilizadas foram trituradas em N2 líquido para obter pós finos, que foram utilizados para todas as análises realizadas na Texas A&M University. A dose de UV selecionada e as datas de armazenamento foram definidas em estudos preliminares com base em grandes diferenças nas EROs, atividades enzimáticas, síntese de vitamina C e polifenóis.
Quantificação da vitamina C total (ácido ascórbico), AsA e DHA
As medições de vitamina C total, ácido ascórbico reduzido (AsA) e ácido desidroascórbico (DHA) foram adaptadas do método descrito anteriormente por Gillespie e Ainsworth. Uma quantidade de 50 mg de pó de amostra foi homogeneizada com 2 ml de ácido tricloroacético (TCA) a 5% (p/v), filtrada através de quatro camadas de gaze e então centrifugada a 16.000×g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi utilizado para as medições de vitamina C total e AsA.
Para a quantificação de AsA, uma mistura reacional contendo 50 µL de sobrenadante, 25 µL de tampão fosfato 100 mM (pH 7,7), 50 µL de TCA a 10% (p/v), 50 µL de ácido fosfórico a 44% (p/v), 50 µL de 2,2′-bipiridila a 4% (p/v) e 25 µL de FeCl3 a 3% (p/v) foi incubada a 37 °C por 60 min e então a absorbância foi lida a 525 nm. A vitamina C total foi medida incubando uma mistura reacional contendo 50 µL de sobrenadante, 12,5 µL de tampão fosfato 100 mM (pH 7,7) e 12,5 µL de DTT 0,2 mM, à temperatura ambiente por 10 min. Após a incubação, 50 µL de TCA a 10% (p/v), 50 µL de ácido fosfórico a 44% (p/v), 50 µL de 2,2′-bipiridila a 4% (p/v) e 25 µL de FeCl3 a 3% (p/v) foram adicionados à mistura reacional final, que foi incubada a 37 °C por 60 min. A absorbância foi monitorada a 525 nm. O DHA foi quantificado a partir da diferença entre AsA e vitamina C total. O ascorbato foi utilizado para obter uma curva padrão e os resultados foram expressos como mg de vitamina C total⋅100 g−1 DW, mg de AsA⋅100 g−1 DW e mg de DHA⋅100 g−1 DW.
Ensaio da L-galactono-1,4-lactona desidrogenase (GalDH)
A atividade da GalDH foi determinada conforme relatado por Ôba et al.. Primeiramente, como está localizada na membrana mitocondrial, as frações mitocondriais foram preparadas homogeneizando 300 mg de pó da amostra em 4 mL de solução de extração gelada, contendo 0,1 M de Tris–HCl (pH 7,4), 0,4 M de sacarose, 2% (p/v) de PVP e 50 mM de β-mercaptoetanol, por 2 min. A solução final foi filtrada através de quatro camadas de gaze e então centrifugada a 500 g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante coletado foi centrifugado novamente a 10.000×g por 10 min a 4 °C para precipitar os pellets mitocondriais, que foram ressuspensos em uma solução de lavagem contendo 0,1 M de tampão Tris–HCl (pH 7,4) e 0,4 M de sacarose e então centrifugados a 10.000×g por 10 min a 4 °C. Esta etapa de lavagem foi realizada duas vezes. O pellet final foi utilizado como fração mitocondrial. Para o ensaio enzimático da GalDH, um extrato proteico foi preparado a partir da fração mitocondrial, que foi ressuspensa em 0,1 M de tampão Tris–HCl (pH 7,4) contendo 0,4 M de sacarose, 1 mM de EDTA e 0,1% (v/v) de Triton X-100, incubada por 1 h a 4 °C e então centrifugada a 10.000×g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi utilizado como extrato de proteínas mitocondriais para o ensaio enzimático da GalDH. A mistura reacional foi inicialmente composta por 10 µL de extrato proteico e 80 mM de citocromo c. Após sua incubação à temperatura ambiente por 10 min, o substrato 4,6 mM de l-galactono-1,4-lactona foi adicionado para iniciar a reação. O aumento da absorbância a 550 nm, causado pela redução do Cyt c (ε = 21,6 mM−1 cm−1), foi monitorado a cada 1 min por 30 min. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 nmol de l-galactono-1,4-lactona (equivalente à formação de 2 nmol de Cyt c reduzido) por min.
Preparação de RNA total e análise de qRT-PCR em tempo real
Após a moagem das amostras de acerola em nitrogênio líquido, 100 mg de pós finos foram submetidos à preparação de RNA total, que foi realizada utilizando o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Mississauga, ON) de acordo com as instruções do fabricante. Os RNAs totais foram tratados com DNase I para evitar contaminação por DNA e, em seguida, a qualidade e a quantidade do RNA foram examinadas tanto por eletroforese em gel de agarose quanto por um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Willmington, DE). Para a síntese de cDNA, 200 ng de RNAs foram retrotranscritos em cDNA utilizando o SuperScript III first-strand synthesis supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguindo o protocolo do fabricante. Os cDNAs foram utilizados para as análises de qRT-PCR em tempo real, que foram realizadas utilizando Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), seguindo as instruções do fabricante. A amplificação do cDNA foi realizada utilizando o Sistema de Detecção de Sequência 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os conjuntos de primers estão listados na Tabela S2 e foram fornecidos pela Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). A expressão relativa de cada gene foi normalizada pela actina (primer direto 5′-GGGCATCGGAAACGTTCAGCACCG-3′, primer reverso 5′-CGTTCACCACTACTGCTGAACGAG-3′); e foi calculada seguindo o método do Ct comparativo (ΔΔCt), também conhecido como o método 2− ΔΔCt.
Perfil de fenólicos por LC–MS e quantificação de fenólicos individuais e totais
Para obter o perfil fenólico das amostras, 1,5 g do pó da amostra liofilizada foi homogeneizado durante a noite a 4 °C com 50 mL de metanol 85% para obter o extrato bruto. Este extrato foi fracionado em ácidos fenólicos (F1), antocianinas (F2), flavonóis (F3) e procianidinas/antocianinas poliméricas (F4) por extração em fase sólida usando cartuchos C18, conforme relatado anteriormente. Inicialmente, o extrato metanólico foi evaporado e o extrato aquoso recuperado foi ajustado para pH 7,0 com NaOH 5 N. Um total de 10 mL de extrato foi carregado em um cartucho SEP Pack C18 (55–105 μm, Waters Corp., Milford, MA) previamente condicionado a pH 7,0 com 25 mL de metanol 100% e 25 mL de água nanopura (pH 7,0). Os fenóis neutros foram absorvidos no cartucho, enquanto os ácidos fenólicos não foram. O cartucho foi então lavado com 25 mL de água (pH 7,0), que foi combinada com as frações fenólicas não absorvidas e teve seu pH ajustado para pH 2,0. Esta mistura de compostos foi carregada em um segundo cartucho previamente condicionado a pH 2,0 com 25 mL de metanol 100% e 25 mL de água nanopura a pH 2,0. Os ácidos fenólicos ligados à matriz do segundo cartucho (F1) foram posteriormente eluídos com 25 mL de metanol 100%. Após o pH ser ajustado para 2,0 no primeiro cartucho, a eluição das antocianinas foi realizada passando 25 mL de acetonitrila 16% a pH 2,0 (F2). Os flavonóis foram eluídos usando 25 mL de acetato de etila 100% (F3) e os polímeros de antocianina usando 25 mL de metanol 100% (F4). As frações foram completamente evaporadas a 45 °C usando um speed vac (Savant SC100, MN, EUA) e recuperadas em metanol 85% na concentração final de 5 mg/mL para o trabalho de LC-MS. Os rendimentos das frações foram: F1—9,9 mg; F2—18,3 mg; F3—105,5 mg e F4—199,9 mg.
Compostos individuais foram identificados com base no tempo de retenção, espectros UV e sua relação massa-carga usando LC–MS/MS, injetando 10 µL de amostra. As separações cromatográficas foram realizadas em um sistema LCQ Deca XP Max MSn (Thermo Finnigan, San Jose, CA, EUA) equipado com um amostrador automático, uma bomba quaternária Surveyor 2000 e um detector PDA Surveyor UV 2000, utilizando uma fase Hydro-RP18 (150 mm × 4,6 mm × 3 mm, Phenomenex, Torrance, CA, EUA, tamanhos de partícula (4 µm) e tamanho de poro de 100 Å) e uma coluna de guarda da mesma química. Os gradientes de eluição foram realizados com solvente A, composto por acetonitrila e metanol (1:1 contendo 0,5% de ácido fórmico) e solvente B (água contendo 0,5% de ácido fórmico). As condições de eluição aplicadas foram: 0–2 min, 2% A, 98% B; 3–5 min, 5% A, 95% B; 5–30 min, 20% A, 80% B; 30–72 min, 35% A, 65% B; 72–83 min, 100% A, 0% B; 83–85 min foi mantido isocrático, 100% A; 87–90 min 2% A, 98% até a condição inicial. Os cromatogramas foram monitorados a 520, 330, 280 e 210 nm, e os dados espectrais completos foram registrados na faixa de 200–600 nm. Nitrogênio foi usado como gás de dessolvatação a 275 °C e uma vazão de 60 L/h, e gás He foi usado como gás de amortecimento. Os espectros de massa foram obtidos em um espectrômetro de massa MS Finnigan LCQ Deca XP Max, do tipo ion trap, acoplado à saída do detector de arranjo de diodos e equipado com uma fonte ESI Z-spray, e operado pelo software Xcalibur versão 1.3 (Thermofinnigan-Surveyor, San José, EUA). Um potencial de 6,8 V foi usado no capilar para o modo de íons positivos. Tensão do spray de 4,57 kV e a temperatura do bloco da fonte foi mantida a 255 °C.

Fenólicos individuais foram quantificados a partir das áreas dos cromatogramas (Tabela S1) usando curvas padrão preparadas na faixa de 0,1–100 µg/mL de ácido gálico (para ácido gálico), ácido clorogênico (para ácido cumaroilquínico), cianidina (para antocianinas), kaempferol (para derivados de kaempferol), quercetina (para isorhamnetina e derivados de quercetina) e mirecetina (para derivados de mirecetina). O conteúdo fenólico individual foi expresso como mg do equivalente fenólico correspondente/100 g de peso seco (PS). Os valores fenólicos totais foram determinados pela soma da concentração dos fenólicos individuais e expressos como mg de fenólicos/100 g PS.

Medição de espécies reativas de oxigênio (ERO)

As ERO foram medidas usando o método do diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFDA), conforme descrito anteriormente. 100 mg de pó fino das amostras foram homogeneizados com 700 µL de Tris–HCl 10 mM (pH 7,2) e centrifugados a 12.000× g por 20 min a 4 °C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi usado para a medição de ERO; a mistura contendo amostra diluída 10× e DCFDA 10 µM foi incubada no escuro por 10 min e a fluorescência foi imediatamente lida a 485 nm para excitação e 528 nm para emissão em um leitor de microplacas de 96 poços (Synergy HT, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). O resultado foi representado como intensidade fluorescente relativa por grama (g⁻¹ PS) entre as amostras controle e tratamento.

Ensaio de NADPH oxidase (NOX)
A preparação de proteínas de membrana e o ensaio de atividade de NOX foram realizados conforme descrito em um relatório anterior de Agarwal et al.. Para a preparação de proteínas de membrana, 500 mg de pó fino foram homogeneizados com o tampão de extração contendo 50 mM de Tris–HCl (pH 7.2), 0.25 M de sacarose, 3 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 3.6 mM de L-cisteína, 0.1 mM de MgCl2, 0.6% de PVP e 0.5 mM de PMSF, filtrados através de quatro camadas de gazes e, em seguida, centrifugados a 10.000×g por 45 min a 4 °C. Para a precipitação das proteínas de membrana, os sobrenadantes foram centrifugados a 65.000×g por 30 min a 4 °C e, em seguida, os pellets incluindo as proteínas de membrana foram recuperados no tampão de suspensão contendo 10 mM de Tris–HCl (pH 7.2), 0.25 M de sacarose e 0.5 mM de PMSF. A quantidade de proteína da suspensão foi quantificada e usada para o ensaio de NOX.

O ensaio de NOX foi realizado com 50 mM de tampão Tris–HCl (pH 7.2), 100 µM de NADPH, 0.5 mM de citocromo c e 10 µL de proteínas de membrana com ou sem 350 µM de DPI. A taxa de geração de superóxido (nmole/µg de extrato por min) foi calculada pela taxa de redução do ferricitocromo c a ferrocitocromo c induzida por superóxido (coeficiente de extinção = 21.6 mM−1 cm−1), monitorada espectrofotometricamente a 550 nm a cada 2 min por 1 h. A reação sem as proteínas de membrana ou NADPH foi usada como controle negativo. Os resultados foram representados como taxa de redução de citocromo c (cit c) min−1 µg de proteína−1.

Fenilalanina amônia-liase (PAL) ensaio

O ensaio de PAL foi realizado medindo o ácido trans-cinâmico por LC–MS com base no protocolo de Kim et al. com algumas modificações. A 0.4 g de amostra de acerola liofilizada, 0.4 g de polivinilpirrolidona (PVP) foram adicionados, seguido por 16 mL de tampão borato 50 mM pH 8.5, contendo 5 mM de β-mercaptoetanol. A mistura foi homogeneizada por 30 s e filtrada através de 4 camadas de gaze, seguida de centrifugação a 12.000 × g a 4 °C por 20 min e, em seguida, 500 µL do sobrenadante foram filtrados através de um filtro centrífugo Microcon (Millipore, 10.000 MWCO, Alemanha). Este filtrado foi usado para determinações da atividade de PAL. Para cada tratamento, a mistura de reação consistiu em 235 µL de tampão, 80 µL de extrato bruto do filtrado de acerola e 35 µL de 100 mM de L-fenilalanina (L-fen), enquanto para os controles, água foi usada no lugar de L-fen. A reação foi incubada a 37 °C por 60 min e interrompida adicionando 35 µL de ácido acético glacial. O produto da reação (ácido trans-cinâmico) foi extraído adicionando e misturando bem 750 µL de acetato de etila. Em seguida, 500 µL foram removidos e secos em um speedvac (Labconco, Kansas City, MO), e redissolvidos em 50 µL de metanol 50% e analisados para quantificação de ácido trans-cinâmico por LC–MS.
O ácido trans-cinâmico foi determinado injetando o extrato metanólico acima (10 µL) no sistema HPLC/MS. Os compostos foram separados em uma coluna 4µ Hydro-RP-80A° 150 mm × 2 mm, em uma coluna de fase reversa (Luna, Phenomenex, Torrance, CA, EUA) com uma coluna de guarda e mantida a 25 °C. As fases móveis consistiram em água (fase A) e metanol:acetonitrila (60:40, v:v, fase B), ambas ajustadas para pH 4,5 com ácido fórmico. O sistema de gradiente de solvente foi 0/100, 3/90, 10–15/75, 16/70, 25/25, 30/10, 32–34/0, 35–40/100 (min/% fase A) a uma vazão constante de 0,2 mL/min. Os espectros de massa foram obtidos em um espectrômetro de massas com armadilha de íons Thermo-Finnigan LCQ Deca XP Max acoplado à saída do PDA e equipado com uma fonte ESI Z-spray, e operado pelo software Xcalibur versão 1.3 (ThermoFinnigan Surveyor, San José, CA, EUA). As separações foram realizadas usando a coluna Phenomenex (Torrance, CA, EUA) Synergi 4 μm Hydro-RP 80A (2 mm × 150 mm) com uma coluna de guarda C18, e um fluxo de 200 µL/min do eluente do PDA foi direcionado para a interface ESI usando um divisor de fluxo. Os cromatogramas foram monitorados a 330, 280 e 210 nm; e dados espectrais completos foram registrados na faixa de 200–600 nm. Nitrogênio foi usado como gás de dessolvatação, a 275 °C e uma vazão de 60 L/h, e gás He foi usado como gás de amortecimento. Um potencial de 6,8 V e uma voltagem de spray de 4,5 kV foram usados no capilar para o modo positivo. Uma curva padrão foi construída com ácido trans-cinâmico e os resultados foram relatados como µmol de ácido t-cinâmico/h g PS.
Ensaio da polifenol oxidase (PPO)
O ensaio de preparação de extratos de PPO foi realizado conforme descrito por Sojo et al.. 100 mg dos pós finos foram homogeneizados em 2 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 2% de PVPP e 4% de Triton X-100 com Ultraturrax (IKA, Staufen, Alemanha), seguido de 30 min de incubação a 4 °C. A solução final foi centrifugada a 10.000×g por 15 min a 4 °C e o sobrenadante foi o extrato bruto para o ensaio enzimático.
A atividade foi medida monitorando a degradação fenólica a 395 nm, conforme descrito por Wissemann & Lee. A mistura de reação consistiu no extrato preparado acima, tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) e catequina 0,03 M. Uma unidade de atividade enzimática foi representada como ΔO.D min−1 mg de proteína−1.
Medição da atividade da desidrogenase mitocondrial pelo ensaio MTS
Para a medição, o ensaio de tetrazólio MTS foi realizado usando o kit Cell Titer 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A fração contendo mitocôndrias nativas foi preparada conforme descrito na medição da atividade da GalDH acima e foi ressuspensa em um tampão composto por 50 mM Tris–HCl (pH 7,4) e 0,4 M de sacarose. 30 µL da fração mitocondrial foram incubados com tampão de fosfato de potássio 20 mM (pH 7,4) contendo 20 mM de succinato e 50 µL de solução MTS a 37 °C por 2 h, e então a produção de formazana foi medida pela absorbância a 490 nm, que foi diretamente proporcional à atividade da desidrogenase mitocondrial. O conteúdo de proteína foi quantificado e usado para normalizar a quantidade de mitocôndrias extraídas das amostras controle e tratadas. Os resultados foram expressos como atividade relativa da desidrogenase mitocondrial (%) por quantidade de proteína (µg).

Quantificação de proteínas
A proteína total foi quantificada pelo método colorimétrico com solução de ácido bicinconínico usando o kit Pierce® BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante, com absorbância monitorada a 562 nm.

Análises estatísticas
Três réplicas biológicas foram realizadas. Cada réplica biológica foi composta por 20 frutos, totalizando 60 frutos por tratamento. Os dados foram analisados usando o teste t de Student ou análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey-HSD, utilizando o software JMP pro v10.0. Os resultados foram expressos como médias ± erros padrão (EP). Letras diferentes indicam diferenças significativas (p < 0,05).

Informações suplementares
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Marcela Cristina Rabelo, Woo Young Bang e Vimal Nair.
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41598-020-78948-1.

Contribuições dos autores
M.C.R., W.Y.B., R.E.A., M.R.A.M., L.C.Z., desenharam os experimentos. M.C.R., W.Y.B., V.N., S.S., realizaram os experimentos. W.Y.B., V.N., D.A.J.-V., L.C.Z., processaram os dados. W.Y.B., V.N., D.A.J.-V., L.C.Z., analisaram os dados e escreveram o texto principal do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Referências
Comportamento nutracêutico pós-colheita durante o amadurecimento e senescência de 8 espécies de frutas altamente perecíveis da região norte da Amazônia brasileira
Correlações da atividade antioxidante contra o conteúdo fenólico revisitadas: uma nova abordagem na análise de dados para plantas alimentícias e medicinais
Biossíntese de ascorbato: uma diversidade de vias
Fisiologia e biologia molecular do metabolismo dos fenilpropanoides
Um uso alternativo de culturas hortícolas: plantas estressadas como biofábricas de compostos fenólicos bioativos
Qualidade, teor de compostos bioativos e atividade antioxidante em frutos de clones de acerola brasileira
Fisiologia pós-colheita de acerola (Malpighia emarginata D.C.): mudanças na maturação, atividade respiratória e armazenamento refrigerado em atmosferas ambiente e modificada
Avanços na tecnologia de luz ultravioleta para processamento não térmico de alimentos líquidos
Efeito da luz UV-C no teor de antocianinas e outros parâmetros de qualidade do suco de romã
Efeitos de UV-C e UV-B na citomorfologia e permeabilidade à água de células epidérmicas internas de Allium cepa
Melhoria da qualidade pós-colheita da manga 'Haden' pelo tratamento com UV-C
Efeitos do processamento por radiação em fitoquímicos e antioxidantes em produtos vegetais
Mudanças induzidas por radiação UV na capacidade antioxidante de frutas tropicais minimamente processadas
Efeito do tratamento com UV na capacidade antioxidante, atividade de enzimas antioxidantes e deterioração em morangos
Resposta do mirtilo à aplicação pós-colheita de radiação ultravioleta
Efeito de tratamentos com UV-C em compostos fenólicos e capacidade antioxidante de tangerina Satsuma minimamente processada durante armazenamento refrigerado
Efeito da irradiação UV-C e armazenamento em baixa temperatura em compostos bioativos, enzimas antioxidantes e atividade sequestradora de radicais livres do mamão
Morte celular programada induzida por estresse abiótico mediado por ROS em plantas
Moléculas sinalizadoras envolvidas na resposta ao estresse pós-colheita de plantas: mudanças na qualidade e síntese de metabólitos secundários
Repressão transcricional por AtMYB4 controla a produção de protetores solares contra UV em Arabidopsis
O papel e modo de ação da hormese UV-C na redução do estresse oxidativo celular e consequente dano por frio na casca da banana
Efeito combinado da perda de água e estresse por ferimento na ativação gênica de vias metabólicas associadas à biossíntese de fenólicos em cenoura
Plantas como biofábricas: papel fisiológico das espécies reativas de oxigênio no acúmulo de antioxidantes fenólicos em tecido de cenoura sob estresse por ferimento e hiperóxia
Espécies reativas de oxigênio e maquinaria antioxidante na tolerância ao estresse abiótico em plantas cultivadas
Biologia redox mitocondrial e homeostase em plantas
Espécies reativas de oxigênio inibem a geração de potencial de membrana suportada pela oxidação do succinato em mitocôndrias de trigo
Possível envolvimento das mitocôndrias vegetais na adaptação celular ao estresse hídrico: um estudo de caso em mitocôndrias de trigo duro
Explorando o impacto do ferimento e jasmonatos no metabolismo do ascorbato
Atividade da L-galactono-γ-lactona desidrogenase e teor de vitamina C em batatas minimamente processadas armazenadas sob atmosferas controladas
Oxidação do RNA mensageiro ocorre precocemente na patogênese da doença e promove degeneração de neurônios motores na ELA
Dano oxidativo ao RNA: mecanismos, consequências e doenças
Isolamento de RNA total de tecidos ricos em polifenóis e polissacarídeos de plantas de mangue
Cinética de mudanças de qualidade associadas a batatas armazenadas em diferentes temperaturas
Produção de espécies reativas de oxigênio por NADPH oxidases de plantas
O aumento da capacidade antioxidante após ferimento depende do tipo de fruta ou tecido vegetal
Compostos fenólicos e enzimas relacionadas como determinantes da qualidade em frutas e hortaliças
Polifenol oxidases em plantas e fungos: Indo a lugares? Uma revisão
Evidência para formas ativas e inativas de L-fenilalanina amônia-liase em cotilédones de rabanete etiolados e cultivados sob luz
Sobre o mecanismo das mudanças na atividade da fenilalanina amônia-liase induzidas por luz ultravioleta e azul em hipocótilos de pepino
Evidência de marcação por densidade para a ativação mediada por luz azul da fenilalanina amônia-liase em plântulas de Cucumis sativus
Evidência de marcação por densidade para a ativação mediada por fitocromo da fenilalanina amônia-liase em cotilédones de mostarda
Efeito da radiação gama e UV-B/C em células vegetais
Implicação das espécies reativas de oxigênio e disfunção mitocondrial nos estágios iniciais da morte celular programada em plantas induzida por exposição excessiva à radiação ultravioleta-C
Atividade respiratória e membrana mitocondrial associadas à senescência de frutos em pêssegos pós-colheita em resposta ao tratamento com UV-C
Complexo mitocondrial I de Arabidopsis e arroz: ortólogos de componentes de mamíferos e fungos acoplados a subunidades específicas de plantas
Controle da síntese de ascorbato pela respiração e suas implicações para as respostas ao estresse
Sinalização de ATP extracelular em plantas pela NADPH oxidase da membrana plasmática e canais de Ca2+
Uma explosão de NADPH oxidases em plantas
Transdução de sinal de UV e luz azul em Arabidopsis
Respostas diferenciais ao estresse foliar em plantas jovens e senescentes
Diálogo cruzado entre vias de sinalização: a ligação entre a produção de metabólitos secundários vegetais e a resposta ao estresse por ferimento
O peróxido de hidrogênio atua como segundo mensageiro para a indução de genes de defesa em tomateiros em resposta a ferimento, sistemina e metil jasmonato
Medição dos teores de ascorbato reduzido, oxidado e total em plantas
L-Galactono-γ-lactona desidrogenase: caracterização parcial, indução de atividade e papel na síntese de ácido ascórbico em tecido de tubérculo de batata ferido
Expressão gênica de enzimas relacionadas à biossíntese de ácido ascórbico da via de Smirnoff-Wheeler em acerola (Malpighia glabra)
Análise de dados de PCR em tempo real pelo método Ct comparativo
Fracionamento de compostos fenólicos em vinho tinto
Determinação e detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica e vazamento de eletrólitos em plantas
Papel do ABA, ácido salicílico, cálcio e peróxido de hidrogênio na indução de enzimas antioxidantes em plântulas de trigo
A biossíntese de glucosinolatos indólicos limita o acúmulo de fenilpropanoides em Arabidopsis thaliana
Atividade monofenolase da polifenol oxidase latente de polpa de banana
Atividade da polifenoloxidase durante a maturação da uva e produção de vinho