pmid: "39184583"
title: "Avaliação Comparativa das Propriedades Antioxidantes e Anti-inflamatórias do Nanogel de Prata Mediado por Acerola e do Nanogel de Óxido de Cobre."
authors: "Nalina Kumari Chellathurai B, N A, Shanmugam R, Mahendra J, Sudhakar U"
journal: "Cureus"
pubdate: "2024 Jul"
doi: "10.7759/cureus.65409"
source: "PMC Full Text"

Avaliação Comparativa das Propriedades Antioxidantes e Anti-inflamatórias do Nanogel de Prata Mediado por Acerola e do Nanogel de Óxido de Cobre.

Autores

Nalina Kumari Chellathurai B, N A, Shanmugam R, Mahendra J, Sudhakar U

Periodico

Cureus (2024 Jul)

Conteudo

Avaliação Comparativa das Propriedades Antioxidantes e Anti-inflamatórias do Nanogel de Prata Mediada por Acerola e do Nanogel de Óxido de Cobre
Introdução: A planta tropical acerola do gênero Malpighia inclui arbustos e árvores com frutos ricos em nutrientes e substâncias químicas bioativas. A acerola se destaca por seu teor excepcionalmente alto de ácido ascórbico, variando de 1500 a 4500 mg/100 g. A ingestão de vitamina C influencia grandemente a saúde gengival. A adição de nanopartículas juntamente com a acerola rica em vitamina C exibe altas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, melhorando positivamente a saúde gengival.
Método: As propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias dos extratos aquosos da planta acerola (Malpighia emarginata) foram avaliadas. Nanopartículas de prata (AgNPs) e nanopartículas de óxido de cobre (CuONPs) foram sintetizadas utilizando o extrato aquoso do gel de acerola pelo método de fabricação fitogênica. O potencial antioxidante das nanopartículas de prata e cobre foi avaliado utilizando as atividades de sequestro de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), peróxido de hidrogênio, poder antioxidante redutor do ferro (FRAP), ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS) e óxido nítrico.
Resultados: Concentrações crescentes de nanopartículas mostraram um aumento na atividade de sequestro. No geral, CuONPs e AgNPs exibiram notáveis eficácias de eliminação de radicais. A eficácia anti-inflamatória das CuONPs e AgNPs foi monitorada, mostrando supressão da desnaturação proteica, conforme demonstrado pelos ensaios de albumina sérica bovina (BSA), albumina de ovo (EA) e estabilização de membrana. Os resultados revelaram que o aumento das doses de CuONPs e AgNPs teve um impacto positivo na atividade anti-inflamatória das nanopartículas.
Conclusão: O presente estudo revelou que ambas as nanopartículas proporcionaram melhores atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Este estudo também detalha o potencial farmacológico de ambas as nanopartículas, que pode ser explorado posteriormente para aplicação em todos os setores de saúde.
Introdução
A resposta bioquímica complexa do corpo à infecção patogênica, trauma, toxinas e luz ultravioleta é chamada de inflamação. Ela também serve como um mecanismo de reparo tecidual para tecidos lesionados. Durante a fase de inflamação, os macrófagos liberam substâncias como citocinas, processam antígenos por fagocitose e desempenham um papel crucial na cicatrização. A síntese de vários mediadores inflamatórios, como prostaglandinas, ciclooxigenase-2 (COX-2), óxido nítrico (NO), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-1 beta (IL-1β), é regulada pelos macrófagos durante a fase de inflamação. Essas citocinas são indicadores de reações associadas à inflamação.
Uma ampla gama de medicamentos, incluindo esteroides e anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), é utilizada para tratar a inflamação, que é a causa raiz de muitos distúrbios. Historicamente, o tratamento da inflamação tem sido associado a fitoquímicos como o ácido salicílico e a aspirina. Polifenóis vegetais isolados de ervas e seus derivados também têm sido usados para tratar doenças inflamatórias. Diversas plantas medicinais, como Eucalyptus globulus, Thymus vulgaris, Mentha longifolia, Pycnocycla spinosa, Echium amoenum (borragem) e Mitrephora sirikitiae, são ricas em polifenóis e têm sido utilizadas como tratamentos para doenças inflamatórias nos últimos tempos.
As espécies reativas de oxigênio (EROs) e as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) são subprodutos metabólicos adicionais que exigem oxigênio para o funcionamento adequado nas células vivas. Esses subprodutos são altamente reativos às membranas celulares e mitocondriais e causam danos celulares. As EROs, que incluem oxigênio singleto (1O2), radicais hidroxila (OH•), radicais superóxido (O2•−) e peróxido de hidrogênio (H2O2), são derivados do oxigênio. As ERNs consistem em peroxinitrito (ONOO−) e óxido nítrico (•NO), que são outras substâncias químicas perigosas. A oxidação de biomoléculas e a modificação de proteínas e genes por EROs em excesso podem favorecer distúrbios inflamatórios. Assim, para interromper a inflamação, os antioxidantes devem remover rapidamente as ERNs e as EROs do organismo.
Extratos de plantas são eficientes removedores de radicais livres para a rápida eliminação de estressores oxidativos. Consequentemente, uma variedade de extratos derivados de plantas pode ser utilizada como medicamentos para modular a inflamação crônica causada por infecção viral e outras condições. A Malpighia emarginata (acerola), também conhecida como cereja-das-antilhas, é uma fruta tropical do gênero Malpighia, nativa da América do Sul e Central. Ela é um membro da família Malpighiaceae. Os fitoquímicos na Malpighia incluem ácido ascórbico (AA), carotenoides (CA) e compostos fenólicos (CF), que são ricos em vitamina C. Devido ao seu alto teor de vitamina C, potencial antioxidante e propriedades antibacterianas, as sementes, o bagaço e a biomassa produzidos durante o cultivo comercial da acerola oferecem uma abundância de potencial para uso como aditivos naturais ou suplementos dietéticos. Utilizando subprodutos da acerola, pesquisadores criaram vários novos produtos, incluindo aqueles com atividade antioxidante e antimicrobiana, micro ou nanopartículas (NPs) contendo substâncias ativas, adsorventes e precursores de energia sustentável. A alta relação superfície-volume dos nanomateriais confere a eles propriedades físico-químicas únicas, tornando-os ideais para aplicações biomédicas onde processos biológicos ocorrem em escalas nanométricas. Como transportadores de fármacos, as NPs oferecem alta estabilidade, alta biocompatibilidade, grande capacidade de transporte, incorporação de substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas, e múltiplas vias de administração, incluindo uso oral. Hoje, NPs metálicas podem ser produzidas por extratos de plantas e são aplicadas em muitos campos de alta tecnologia, incluindo medicina para imageamento, diagnóstico mais rápido, liberação de fármacos, regeneração tecidual, tratamentos de câncer, antioxidantes, agentes bactericidas e fungicidas, e criação de novas terapêuticas. Uma área significativa da nanotecnologia é a produção de NPs utilizando fungos, bactérias, algas e plantas.

Embora a cereja de acerola tenha sido objeto de pesquisas substanciais para diversas aplicações, uma investigação aprofundada de suas bioatividades ainda não está totalmente descoberta. Portanto, o presente estudo visa elaborar a síntese verde de nanopartículas de prata (AgNP) e nanopartículas de óxido de cobre (CuONP) em gel usando um extrato aquoso de cereja de acerola e avaliar seu potencial antioxidante e anti-inflamatório para pesquisas biomédicas.

Materiais e métodos
Preparação do extrato aquoso de cereja de acerola
O pó de acerola obtido da Brut Appetit (RMCA Ventures, Bangalore, Índia) é um produto 100% puro liofilizado. Exatamente 2 g do pó foram misturados em 100 mL de água destilada em um béquer de 100 mL e aquecidos em uma placa magnética de um agitador magnético operado a 55°C. A mistura foi aquecida por 15 minutos com agitação constante. O conteúdo foi então filtrado usando papel de filtro Whatman para remover os resíduos. O filtrado claro foi deixado esfriar até a temperatura ambiente. Finalmente, o extrato aquoso foi mantido em um recipiente com tampa de rosca e utilizado para a fabricação fitogênica de NPs.

Desenho fitogênico do gel de CuONP
Uma solução de sulfato de cobre 30 mM foi preparada em 50 mL de água destilada. Em seguida, 10 mL do extrato aquoso de acerola foram amalgamados com 30 mL da solução de sulfato de cobre e colocados em agitação contínua em um agitador orbital por 48 horas a 160-180 rpm. Após a agitação, toda a solução foi centrifugada a 8000 rpm por 15 minutos, e o pellet foi coletado e lavado três vezes com água destilada para remover impurezas. Um mililitro deste pellet foi então misturado com 5 g de gel, consistindo de 2,5 g de carbopol e 2,5 g de carboximetilcelulose, para obter uma forma de gel homogênea. Finalmente, o gel de CuONP mediado por acerola preparado foi armazenado a 4°C e mantido em um frasco para triagem de bioatividade.

Desenho fitogênico do gel de AgNP
Uma solução de nitrato de prata 2 mM foi preparada em 80 mL de água destilada. Vinte mililitros do extrato aquoso de acerola foram misturados com a solução de nitrato de prata em um agitador orbital operado a 160-180 rpm por 48 horas. Após agitação vigorosa, a solução foi centrifugada por 15 minutos a 8000 rpm, e o pellet foi coletado após descartar o sobrenadante. As impurezas aderidas no pellet foram removidas por lavagem repetida com água destilada. Um mililitro deste pellet purificado foi misturado com 2,5 g de carbopol e 2,5 g de carboximetilcelulose para obter uma forma de gel homogênea. Este gel de nanopartículas de prata (AgNP) mediado por acerola preparado foi cuidadosamente armazenado a 4°C para investigações de bioatividade.

Ensaios antioxidantes
Os efeitos antioxidantes foram avaliados usando o ensaio de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), ensaio de radical peróxido de hidrogênio (H2O2), ensaio de poder antioxidante redutor do ferro (FRAP), atividade de sequestro de óxido nítrico e ensaio de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS) para o gel de AgNP e gel de CuONP. Cinco concentrações diferentes usadas para todos os ensaios antioxidantes foram 10 μg/mL, 20 μg/mL, 30 μg/mL, 40 μg/mL e 50 μg/mL.

Ensaio DPPH
O experimento DPPH foi usado para avaliar a capacidade de sequestro do gel de AgNP e do gel de CuONP mediados por acerola individualmente de forma dose-dependente. As respectivas NPs, juntamente com a solução DPPH, foram incubadas por aproximadamente 30 minutos no escuro. Em seguida, a absorbância foi medida a 517 nm. A vitamina C foi usada como padrão, e a % de inibição foi calculada pela equação:
% inibição (DPPH) = [100 - (ABS amostra - ABS controle) × 100)]/ABS controle
onde ABS amostra representa a absorbância da amostra e ABS controle representa a absorbância do controle.

Ensaio do Radical Peróxido de Hidrogênio (H2O2)
O protocolo demonstrado por Halliwell e colaboradores foi aplicado para avaliar a atividade antioxidante do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP em cinco concentrações diferentes (10, 20, 30, 40 e 50 μg/mL). Neste ensaio, a degradação da 2-desoxirribose cria um composto cromogênico (malondialdeído) pelo radical peróxido de hidrogênio. Essa mudança de cor é diretamente proporcional à quantidade de peróxido de hidrogênio. Resumidamente, a mistura de reação (1 mL) consistiu em 2-desoxirribose (100 µL, 1 mL) preparada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4). Ao conteúdo foi adicionada uma faixa diversa (10-50 μg/mL) de gel de AgNP mediado por acerola e gel de CuONP. Em seguida, 200 μL de cloreto férrico (200 mM) e EDTA (1,04 mM) foram adicionados juntamente com 100 μL de peróxido de hidrogênio 1 mM e 100 μL de AA. Toda a mistura de reação foi mantida por 1 hora em condições ambientes, e o dano imposto pelo radical livre (H2O2) ao substrato (desoxirribose) foi verificado medindo a absorbância espectrofotometricamente a 532 nm. AA foi usado para comparação. A porcentagem inibitória (%) da degradação da desoxirribose foi encontrada aplicando a fórmula:
Inibição (%) do radical H2O2 = [Controle (A532) - Amostra (A660)/Amostra (A532)] x 100
onde Controle (A532) é a absorbância do controle e Amostra (A532) é a absorbância das NPs avaliadas. A partir da fórmula, o IC50 foi determinado.

Ensaio FRAP
De acordo com o protocolo padrão, o impacto antioxidante do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP foi realizado. Para este ensaio, 3,1 g de acetato de sódio tri-hidratado 300 mM (C2H3NaO2·3H2O), ácido acético (16 mL) com pH 3,6, 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ, 10 mM), cloreto férrico hexa-hidratado (20 mM) e HCl (40 mM) compuseram a solução estoque. Uma solução de trabalho fresca foi feita diluindo tampão acetato (25 mL), solução de TPTZ (2,5 mL) e solução de cloreto férrico hexa-hidratado (2,5 mL). A isso, doses variadas (10-50 µg/mL) de gel de AgNP mediado por acerola e gel de CuONP, juntamente com a solução FRAP (1,5 mL), foram adicionadas, e todo o conteúdo foi deixado reagir por cinco minutos em ambiente escuro. A intensidade da cor desenvolvida foi medida espectrofotometricamente a 593 nm. AA foi usado como fármaco comparativo padrão. A porcentagem (%) de inibição foi encontrada usando a fórmula:
Inibição (%) do radical FRAP = [Controle (A593) - Amostra (A593)/Amostra (A593)] x 100
onde Controle (A593) é a absorbância do controle e Amostra (A593) é a absorbância das NPs avaliadas. A partir da fórmula mencionada, o IC50 foi determinado.

Atividade de Captação de Óxido Nítrico
A capacidade de sequestro do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP contra radicais de óxido nítrico foi determinada utilizando o método de Ebrahimzadeh. O nitroprussiato de sódio foi usado para produzir óxido nítrico, que foi então quantificado usando a reação de Griess. O padrão utilizado foi a curcumina, um sequestrador direto de óxido nítrico de ocorrência natural que previne a indução da óxido nítrico sintase. Ela reduz a quantidade de nitrito produzido quando o oxigênio e o óxido nítrico do nitroprussiato de sódio se combinam. A seguinte fórmula foi usada para calcular a % de atividade antioxidante após medir a absorbância a 596 nm:
% Antioxidant activity = [100 - (ABS sample - ABS control) × 100]/ABS control
onde ABS sample é a absorbância da amostra e ABS control é a absorbância do controle.
Ensaio ABTS
O procedimento do ensaio de supressão ABTS para géis de AgNPs e CuONP foi realizado por Janani et al. . Uma solução de trabalho foi preparada misturando uma quantidade igual de persulfato de potássio 2,4 mM com uma solução de ABTS 7 mM. A mistura resultante foi subsequentemente mantida à temperatura ambiente por 12 horas em ambiente escuro. Em seguida, 1 mL da solução resultante foi completamente misturado com 1 mL de várias concentrações (10 μg/mL a 50 μg/mL) de AgNPs e CuONPs. A mistura reagente foi determinada por espectroscopia a 734 nm seis minutos depois. A seguinte fórmula foi empregada para calcular a porcentagem (%) da capacidade do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP de suprimir ABTS:
Percentage of inhibition by ABTS = [C(Abs) - S(Abs)]/C(Abs) x 100
onde C(Abs) é a absorbância do controle e S(Abs) é a absorbância da amostra.
Avaliação Anti-inflamatória
Para comprovar a potência anti-inflamatória do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP, foram realizados um ensaio de inibição da desnaturação da albumina, um ensaio de inibição da desnaturação da albumina sérica bovina (BSA) e um método de estabilização de membrana, conforme os protocolos documentados com pequenas alterações.
Ensaio de Inibição da Desnaturação da Albumina do Ovo (EA)
Resumidamente, albumina de clara de ovo de galinha recém-preparada (0,2 mL) e PBS (2,8 mL) de pH 6,4 foram misturadas com diferentes doses (10 μg/mL a 50 μg/mL) de gel de AgNP mediado por acerola e gel de CuONP, individualmente. Os conteúdos dos tubos foram colocados em uma incubadora de demanda biológica de oxigênio (DBO) em condições ambiente por 15 minutos. Em seguida, a desnaturação foi induzida aquecendo os conteúdos da mistura reacional a 65°C por cinco minutos. Todos os tubos foram resfriados e a absorbância foi medida a 660 nm com o auxílio de um espectrofotômetro UV-visível. Diclofenaco sódico, um AINE bem conhecido, foi usado como controle positivo. Água destilada foi usada como branco e dimetilsulfóxido (DMSO) como controle. A inibição da desnaturação proteica foi representada como porcentagem (%) de inibição usando a fórmula:
Inhibition (%) of protein denaturation = [Control (A660) - Sample (A660)/Sample (A660)] x 100
onde Controle (A660) é a absorbância do controle e Amostra (A660) é a absorbância das NPs avaliadas. A partir da fórmula mencionada, a IC50 foi determinada.
Ensaio de Inibição da Desnaturação da BSA
O potencial anti-inflamatório do gel de AgNP e do gel de CuONP mediados por acerola foi avaliado usando um ensaio de desnaturação da proteína BSA com pequenas modificações. Precisamente, 0,5 mL de diferentes doses (10-50 µg/mL) dos géis de CuONP e AgNP foram adicionados separadamente em tubos de ensaio contendo 0,2% de uma solução de BSA a 0,5% (preparada em tampão Tris, pH 6,8). A mistura foi incubada a 37°C por 15 minutos, seguida de imersão em banho-maria a 72°C por cinco minutos. Após a incubação, os conteúdos dos tubos de ensaio foram resfriados, e a turbidez adquirida devido ao precipitado proteico induzido pelo calor foi registrada em um espectrofotômetro UV-visível a 660 nm. Diclofenaco sódico foi usado como controle positivo. A porcentagem de inibição (%) foi calculada usando a seguinte fórmula:
Inibição (%) da desnaturação proteica = [Controle (A660) - Amostra (A660)/Amostra (A660)] x 100
onde Controle (A660) é a absorbância do controle e Amostra (A660) é a absorbância das NPs avaliadas.
Método de Estabilização da Membrana
Para executar este ensaio anti-inflamatório, sangue foi coletado recentemente de indivíduos saudáveis e misturado com anticoagulantes. A centrifugação foi realizada por 10 minutos a 3000 rpm, e as células empacotadas foram separadas e lavadas com solução salina isotônica. Em seguida, uma suspensão a 10% (v/v) foi preparada usando solução salina isotônica. A suspensão de HRBC foi utilizada para avaliar o potencial anti-inflamatório das NPs. Especificamente, uma suspensão de HRBC (0,5 mL), tampão fosfato (1 mL) e solução hipossalina (2 mL) foram misturados com diferentes doses (10-50 µg/mL) de gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola individualmente. Toda a mistura reacional foi deixada reagir por 30 minutos em condições ambiente antes da centrifugação. Os conteúdos foram centrifugados a 3000 rpm por dois minutos. O sobrenadante foi coletado e a absorbância foi verificada para identificar o teor de hemoglobina (Hb) usando um espectrofotômetro UV-visível operando a 560 nm. A porcentagem de inibição (%) da hemólise foi calculada usando a seguinte fórmula:
Inibição da hemólise em % = [Controle (A560) - Amostra (A560)/Amostra (A560)] x 100
onde Controle (A560) é a absorbância do controle e Amostra (A560) é a absorbância das NPs avaliadas.
Execução Estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e os valores foram anotados para plotagem de gráficos. Os dados foram processados usando o GraphPad Prism versão 8.0.1 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Califórnia). Para as investigações in vitro, incluindo avaliações de atividade antioxidante e anti-inflamatória, diferenças significativas entre as médias dos tratamentos foram determinadas usando ANOVA de uma via com teste post-hoc de Tukey (p < 0,05).
Resultados
Ensaio DPPH
Observou-se que, entre as cinco diferentes concentrações de gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola testados, a inibição máxima de 90% e 76%, respectivamente, foi observada a 50 μg/mL. Uma inibição mínima de 62% foi observada na concentração mais baixa de 10 μg/mL, conforme mostrado na Figura 1 A e B. O IC50 para o gel de AgNP e gel de CuONP sintetizados foi de 8,5 μg/mL, indicando sua eficácia em eliminar 50% dos radicais DPPH.
Ensaio DPPH
(A) A % de inibição dos AgNPs e do padrão pelo ensaio DPPH; (B) a % de inibição dos CuONPs e do padrão pelo ensaio DPPH.
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazil, AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Capacidade de eliminação de H2O2
A capacidade de neutralização de H2O2 pelo gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola foi dependente da concentração (10-50 μg/mL), conforme mostrado na Figura 2 A e B (P < 0,05). Os resultados mostraram que a % de inibição do gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola foi de 86% e 85%, respectivamente.
Capacidade de eliminação de peróxido de hidrogênio
(A) A % de inibição dos AgNPs e do padrão (diclofenaco sódico); (B) a % de inibição dos CuONPs e do padrão (diclofenaco sódico).
AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Ensaio FRAP
A capacidade do gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola de converter Fe3+ em Fe2+ no experimento FRAP variou de 65% a 87% e 68% a 87%, respectivamente (Figura 3 A e B). O valor de IC50 foi calculado como 8 μg/mL.
Ensaio FRAP
(A) A conversão de Fe3+ em Fe2+ pelos AgNPs e padrão; (B) A conversão de Fe3+ em Fe2+ pelos CuONPs e padrão.
FRAP: poder antioxidante de redução férrica, AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Ensaio ABTS
O radical ABTS•+ é um composto químico colorido que absorve a 734 nm. Materiais antioxidantes reagem com o radical ABTS•+, que então transfere elétrons para se tornar uma substância ABTS não radical. O estudo empregou medição espectrofotométrica para monitorar o valor decrescente de absorbância a 734 nm e estimou a capacidade de neutralização do radical ABTS•+. A atividade de eliminação de ABTS•+ é comumente usada para avaliar as atividades de eliminação de radicais de misturas líquidas, bebidas e materiais puros. A atividade de eliminação de ABTS•+ do gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola foi comparada com o padrão. A inibição da neutralização do radical ABTS pelo gel de AgNP e gel de CuONP mediados por acerola mostrou uma dependência de concentração. Em concentrações crescentes, houve um aumento evidente na redução dos radicais livres. De acordo com os resultados, a uma concentração de 50 μg/mL, o hidroxianisol butilado (BHA) alcançou 91% de inibição, enquanto o gel de CuONP e o gel de AgNP alcançaram 89,9% e 87,33% de atividade de eliminação do radical ABTS•+, respectivamente (Figura 4 A e B). Descobriu-se neste estudo que os CuONPs eliminam o radical ABTS•+ melhor do que os AgNPs.
Atividade de eliminação de ABTS
(A) A % de inibição dose-dependente dos AgNPs com o padrão BHA; (B) A % de inibição dose-dependente dos CuONPs com o padrão BHA.
ABTS: ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico), AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre, BHA: hidroxianisol butilado.
Capacidade de sequestro de NO
O potencial das nanopartículas de interagir diretamente com óxidos de oxigênio e nitrogênio na mistura de reação para evitar a geração de nitrito permitiu que os cientistas avaliassem sua atividade de sequestro de óxido nítrico. A produção excessiva de NO está associada a uma série de distúrbios. Os achados deste estudo ilustram a capacidade de sequestro de óxido nítrico do gel de AgNP e do gel de CuONP mediados por acerola (Figura 5 A e B). Quando comparados ao AA convencional, a atividade de sequestro das nanopartículas foi reduzida.
Atividade de sequestro de óxido nítrico
(A) A % de inibição dos AgNPs e do ácido ascórbico padrão; (B) A % de inibição dos CuONPs e do ácido ascórbico padrão.
NO: óxido nítrico, AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Atividade anti-inflamatória
Ensaio de EA
Um substituto barato para o uso da técnica de desnaturação para avaliar as propriedades anti-inflamatórias de qualquer composto é a abordagem de EA. A noção do ensaio de desnaturação de EA inclui a triagem da natureza anti-inflamatória dos compostos que seriam potentes na estabilização da arquitetura proteica e na inibição da desnaturação proteica, o que está comumente ligado à inflamação tecidual e celular. No ensaio realizado, o gel de AgNP e o gel de CuONP mediados por acerola foram triados quanto a características anti-inflamatórias. Os resultados mostraram que a inibição da desnaturação proteica pelo gel de CuONP variou de 53% a 78% nas doses testadas, e para o gel de AgNP, variou de 50% a 78%. O valor de IC50 do gel de CuONP foi de 9,9 µg/mL, enquanto para o gel de AgNP foi de 10,1 µg/mL. Ambas as NPs forneceram capacidade de inibição da desnaturação proteica dependente da dose (Figura 6 A e B). O padrão AA forneceu potência anti-inflamatória de 55% a 81% com IC50 de 8,7 µg/mL para o gel de CuONP, enquanto para o gel de AgNP foi de 56% a 81% com dose de IC50 de 8,1 µg/mL.
Ensaio de EA
A % de inibição de (A) AgNPs e (B) CuONPs de maneira dependente da dose em comparação com o padrão.
EA: albumina de ovo, AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Ensaio de BSA
Ambos os géis de NP forneceram reações inibitórias dependentes da dose na desnaturação da BSA. O IC50 medido para o gel de CuONP foi de 11,4 µg/mL com 42% a 79% de inibição da desnaturação proteica, enquanto o fármaco de referência comumente prescrito, AA, mostrou uma dose de IC50 de 10 µg/mL com uma porcentagem de inibição variando de 47% a 84%. O gel de AgNP testado forneceu inibição da desnaturação da albumina de 40% a 80% com IC50 de 7,4 µg/mL (Figura 7 A e B). AA demonstrou uma dose de IC50 de 6,9 µg/mL com inibição de 47% a 84%. Tanto o gel de AgNP quanto o gel de CuONP mediados por acerola forneceram um papel de inibição proteica (albumina) dependente da dose juntamente com AA.
Ensaio de BSA
A % de inibição por (A) AgNPs e (B) CuONPs de maneira dependente da dose em comparação com o padrão.
BSA: albumina sérica bovina, AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Ensaio de Estabilização de Membrana
Tanto a membrana dos glóbulos vermelhos humanos quanto a membrana dos lisossomos apresentam semelhanças em sua integridade e estrutura. Essa analogia auxilia na utilização de HRBC (glóbulos vermelhos humanos) para avaliar o potencial de estabilização de membrana do composto testado. O resultado do ensaio (Figura 8 A e B) mostrou que tanto o gel de AgNP mediado por acerola quanto o gel de CuONP foram ativos de forma dose-dependente na inibição da desestabilização da membrana. Aqui, o gel de CuONP apresentou uma faixa de inibição de 54% a 84% com uma dose IC50 de 9,1 µg/mL, e o gel de AgNP apresentou uma faixa de inibição de 53% a 84% com uma dose IC50 de 8,2 µg/mL. O AA forneceu um IC50 de 8,8 µg/mL para o gel de CuONP e 7,5 µg/mL para o gel de AgNP.
Ensaio de estabilização de membrana
(A) Ensaio de estabilização de membrana de AgNPs. Um gráfico mostrando a % de inibição por AgNPs de forma dose-dependente em comparação com o padrão. (B) Ensaio de estabilização de membrana de CuONPs. Um gráfico mostrando a % de inibição por CuONPs de forma dose-dependente em comparação com o padrão.
AgNPs: nanopartículas de prata, CuONPs: nanopartículas de óxido de cobre.
Discussão
Os dados apresentados elucidam uma atividade antioxidante e anti-inflamatória significativa e dose-dependente do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP, destacando o profundo impacto dos fitoquímicos aderidos às superfícies das nanopartículas. Notavelmente, o gel de AgNP exibiu capacidades superiores de eliminação de radicais livres em comparação com o gel de CuONP, o que pode ser atribuído à presença de PC, flavonoides e alcaloides no extrato de acerola, formando uma camada protetora nas nanopartículas, melhorando suas capacidades de doação de elétrons ou hidrogênio. A capacidade de absorver, neutralizar ou suprimir oxigênio singleto e tripleto são alguns dos fatores importantes que contribuem para a atividade antioxidante superior. Eles são cruciais na redução dos radicais DPPH e peróxido de hidrogênio, o que é vital para prevenir o estresse oxidativo e o dano celular subsequente.
A eficácia do gel de AgNP mediado por acerola e do gel de CuONP em exibir atividades antioxidantes e anti-inflamatórias, conforme revelado em nosso estudo, traça paralelos importantes com pesquisas anteriores, destacando o potencial das terapias mediadas por nanopartículas. Notavelmente, nossos achados ressoam com os de Adebayo et al., que relataram atividades substanciais de eliminação de radicais DPPH para AgNPs mediados por Persea americana. Essa correlação enfatiza o papel das biomoléculas aderidas às superfícies das nanopartículas no aumento das capacidades antioxidantes, o que é crucial para mitigar o dano celular induzido pelo estresse oxidativo. O gel de AgNP fabricado usando Artemisia absinthium, Thymus vulgaris e Humulus lupulus mostrou capacidade significativa de eliminação de radicais através do ensaio FRAP, o que corrobora nossos dados.
Além disso, ambas as nanopartículas demonstraram inibição substancial da desnaturação proteica, um marcador chave da atividade anti-inflamatória. O gel de AgNP apresentou um efeito mais pronunciado na prevenção da desnaturação da albumina, com um valor de IC50 menor em comparação ao gel de CuONP. Isso sugere que os AgNPs podem oferecer um potencial terapêutico mais forte para condições caracterizadas por inflamação e estresse oxidativo, como a artrite reumatoide. A inibição da desnaturação proteica, principalmente através da estabilização da estrutura da albumina contra estressores externos, contribui para sua eficácia anti-inflamatória.

O estudo também destacou o papel das nanopartículas na estabilização da membrana, uma função crítica na prevenção de danos celulares durante a inflamação. O gel de AgNP foi particularmente eficaz na manutenção da integridade da membrana celular, inibindo assim a liberação de mediadores inflamatórios. Isso está alinhado com descobertas anteriores de que as nanopartículas podem interagir beneficamente com os lipídios da membrana para fortalecer as estruturas celulares contra danos oxidativos. Os resultados com o gel de CuONP, embora eficazes, foram menos pronunciados em comparação com os AgNPs, ressaltando a potencial variabilidade na eficiência terapêutica de diferentes formulações de nanopartículas. Em termos de propriedades anti-inflamatórias, tanto os géis de AgNP quanto de CuONP demonstraram inibição significativa da desnaturação proteica, um marcador fundamental da inflamação. O gel de AgNP, em particular, exibiu um efeito inibitório potente sobre a desnaturação da albumina com um valor de IC50 menor do que o gel de CuONP, sugerindo um potencial mais forte em aplicações terapêuticas. Essa observação é apoiada por estudos anteriores, como aqueles que utilizam nanopartículas sintetizadas de forma verde a partir de Phoenix dactylifera e Abutilon indicum, que também destacaram melhorias dose-dependentes nas propriedades antioxidantes através de um mecanismo redox.

Além disso, as capacidades anti-inflamatórias das formulações de nanopartículas foram ainda mais evidenciadas pela sua capacidade de estabilizar as membranas celulares, prevenindo assim a liberação de mediadores inflamatórios. Essa descoberta está alinhada com pesquisas anteriores de Naveed et al., que observaram uma inibição comparável da desnaturação proteica através de AgNPs sintetizados de forma verde, corroborando assim os efeitos anti-inflamatórios dos AgNPs. Além disso, o papel dos CuONPs na estabilização da membrana, conforme observado em nosso estudo, ecoa as descobertas de pesquisas que utilizaram extrato de Mussaenda frondosa, onde os CuONPs demonstraram notável estabilidade de membrana. Muitos experimentos e seus resultados sobre o impacto anti-inflamatório das NPs de CuO estavam em concordância com nosso relatório.
No geral, esses achados apoiam o potencial terapêutico das nanopartículas em formulações bioativas. As vantagens distintas das nanopartículas, incluindo a maior relação superfície-volume e a capacidade de modular processos celulares em nível molecular, as tornam candidatas promissoras no desenvolvimento de agentes terapêuticos avançados. As limitações do estudo incluíram produção em escala limitada e falta de avaliação da estabilidade dos géis em diferentes temperaturas. Estudos futuros devem continuar explorando as vias mecanísticas pelas quais essas nanopartículas exercem seus efeitos protetores, com o objetivo de otimizar e adaptar tratamentos baseados em nanopartículas para aplicações clínicas específicas.

Conclusões
O presente estudo destaca o potencial significativo dos géis contendo AgNPs e CuONPs mediadas por acerola na redução e eliminação de radicais livres. Esses radicais incluem DPPH, óxido nítrico e peróxido de hidrogênio, que são conhecidos contribuintes para o estresse oxidativo e inflamação no corpo. Ao mitigar a presença desses radicais prejudiciais, os géis podem prevenir efetivamente a inflamação, que é um fator crítico no desenvolvimento de várias doenças. As propriedades anti-inflamatórias dessas nanopartículas sugerem que elas podem desempenhar um papel crucial na manutenção da saúde geral, particularmente na cavidade oral, onde o estresse oxidativo é um problema comum.

Consequentemente, o uso de nanopartículas de prata e óxido de cobre derivadas de cerejas de acerola está sendo explorado por seu potencial para prevenir doenças orais associadas a radicais livres, com foco específico em doenças periodontais. As propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias das AgNPs e CuONPs poderiam fornecer uma nova abordagem terapêutica para prevenir ou reduzir a gravidade dessas doenças. Ao incorporar essas nanopartículas em produtos de cuidados orais, pode ser possível melhorar a manutenção da saúde do tecido periodontal, oferecendo uma nova via para melhorar a higiene oral e o bem-estar geral.

Divulgações
Sujeitos humanos: Todos os autores confirmaram que este estudo não envolveu participantes humanos ou tecido.
Sujeitos animais: Todos os autores confirmaram que este estudo não envolveu sujeitos animais ou tecido.
Conflitos de interesse: Em conformidade com o formulário de divulgação uniforme do ICMJE, todos os autores declaram o seguinte:
Informações de pagamento/serviços: Todos os autores declararam que não receberam apoio financeiro de nenhuma organização para o trabalho submetido.
Relações financeiras: Todos os autores declararam que não têm relações financeiras atualmente ou nos últimos três anos com organizações que possam ter interesse no trabalho submetido.
Informações de propriedade intelectual: Patentes sobre (1) “Um Processo de Preparação de Nanogel de Óxido de Cobre à Base de Malpighia Emarginata para Tratar Periodontite Crônica e seu Produto” e (2) “Um Processo de Preparação de Nanogel de Prata Mediada por Acerola para Tratar Periodontite Crônica e seu Produto” foram publicadas e estão pendentes.
Outros relacionamentos: Todos os autores declararam que não há outros relacionamentos ou atividades que possam parecer ter influenciado o trabalho submetido.
Contribuições dos Autores
Conceito e design:  Burnice Nalina Kumari Chellathurai, Ambalavanan N, Rajeshkumar Shanmugam, Uma Sudhakar
Aquisição, análise ou interpretação de dados:  Burnice Nalina Kumari Chellathurai, Ambalavanan N, Rajeshkumar Shanmugam, Jaideep Mahendra
Redação do manuscrito:  Burnice Nalina Kumari Chellathurai, Jaideep Mahendra
Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante:  Burnice Nalina Kumari Chellathurai, Ambalavanan N, Rajeshkumar Shanmugam, Jaideep Mahendra, Uma Sudhakar
Supervisão:  Ambalavanan N, Rajeshkumar Shanmugam, Jaideep Mahendra, Uma Sudhakar
Referências
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