pmid: "34721351"
title: "Influxo de Zinco Restringe a Replicação do Enterovírus D68."
authors: "Liu S, Cao X, Guo H, Wei W"
journal: "Frontiers in microbiology"
pubdate: "2021"
doi: "10.3389/fmicb.2021.748546"
source: "PMC Full Text"

Influxo de Zinco Restringe a Replicação do Enterovírus D68.

Autores

Liu S, Cao X, Guo H, Wei W

Periodico

Frontiers in microbiology (2021)

Conteudo

A Influxo de Zinco Restringe a Replicação do Enterovírus D68
O Enterovírus D68 (EV-D68) é um patógeno viral respiratório que causa doenças respiratórias graves e manifestações neurológicas. Desde o surto de 2014, o EV-D68 tem sido relatado como causador de complicações graves em todo o mundo. No entanto, atualmente não existem agentes antivirais ou vacinas aprovados para o EV-D68. Neste estudo, descobrimos que os íons de zinco exerceram atividade antiviral substancial contra a infecção por EV-D68 in vitro. O tratamento com sal de zinco suprimiu potentemente a replicação do RNA do EV-D68, a síntese de proteínas e a produção de vírions infecciosos, além de inibir os efeitos citopáticos sem produzir citotoxicidade significativa em concentrações virucidas (EC50=0,033mM). O tratamento com cloreto de zinco (ZnCl2) inibiu moderadamente a adsorção do EV-D68. A análise tempo-dose da síntese da proteína estrutural VP1 do EV-D68 mostrou uma supressão mais forte de VP1 no meio de cultura do que nos lisados celulares. Além disso, um ionóforo de zinco, a pirrolidina ditiocarbamato, que pode transportar íons de zinco para dentro das células, também aumentou a atividade anti-EV-D68 do tratamento com ZnCl2. Em conjunto, nossos resultados demonstraram que o aumento do influxo de zinco pode servir como uma estratégia poderosa para o tratamento terapêutico de infecções por EV-D68.
Introdução
O Enterovírus D68 (EV-D68) do gênero Enterovirus (família Picornaviridae) foi isolado pela primeira vez em 1962. Verificou-se que o EV-D68 afeta particularmente crianças, ocasionalmente causando doença respiratória. Foi inicialmente considerado um vírus raro até o primeiro grande surto em 2014. Importante, estudos recentes descobriram que a infecção por EV-D68 não apenas desencadeia doenças respiratórias esporádicas, mas também está associada a condições neurológicas graves como a mielite flácida aguda (AFM), ocorrendo principalmente em pacientes pediátricos. Embora o EV-D68 seja considerado o principal agente causador da AFM, ainda não existe um medicamento terapêutico ou tratamento especificamente para infecções por EV-D68 disponível globalmente.
O Enterovírus D68 é um vírus de RNA de fita simples, sentido positivo, não envelopado. Ao contrário da maioria dos enterovírus que codificam ORF2p/uORF, o genoma do EV-D68 possui apenas uma fase de leitura aberta (ORF). A ORF codifica um precursor de poliproteína, que pode ser processado por proteases virais em quatro proteínas estruturais (VP1, VP2, VP3 e VP4) e sete proteínas não estruturais (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C e 3D). Os receptores conhecidos do EV-D68 são o ácido siálico e o ICAM-5. Até agora, a patogênese das infecções por EV-D68 permanece pouco compreendida.
O íon zinco é o segundo íon metálico de transição mais abundante no corpo humano. Ele desempenha papéis vitais em muitos processos biológicos, incluindo destino e desenvolvimento celular, transcrição gênica e infecção viral. O íon zinco inibe a replicação viral ao prejudicar o processamento de poliproteínas, inibir a transcrição, interferir na fusão da membrana viral-celular para bloquear a ligação e adesão viral, e inibir a replicação do genoma viral. Além disso, o zinco desempenha um papel crucial no aumento da resistência do hospedeiro a infecções virais ao sustentar a homeostase imunológica. Por outro lado, a deficiência de zinco prejudica a resposta imune celular e enfraquece a imunidade celular. Compostos capazes de transportar zinco para dentro das células ou redistribuir o zinco celular exercem um efeito inibitório viral.

Neste estudo, objetivamos avaliar os efeitos inibitórios da concentração de zinco intracelular na replicação do EV-D68. Também objetivamos aumentar a atividade antiviral de sais de zinco usando um ionóforo de zinco. Nossos resultados fornecem coletivamente evidências de prova de conceito para a investigação clínica da suplementação de zinco na terapia contra EV-D68.

Materiais e Métodos

Células e Vírus

Células RD (CCL-136, ATCC, Manassas, VA, Estados Unidos), células A549 (CCL-185, ATCC) e células HeLa (CCL-2, ATCC) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; cat no: SH30022.01, HyClone, Logan, UT, Estados Unidos) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, REF: 04–001-1, Biological Industries, Beit HaEmek, Israel) e 1% de solução de penicilina/estreptomicina. O protótipo EV-D68 Fermon (VR-1826, ATCC) e as cepas circulantes dos EUA de 2014 do EV-D68, US/MO/14-18947 (VR-1823D, ATCC) e US/KY/14-18953 (VR-1825D, ATCC), foram amplificadas em células RD. Uma mistura de células e sobrenadante foi coletada aproximadamente 3 dias após a infecção e submetida a múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Em seguida, as amostras foram clarificadas por centrifugação em baixa velocidade e passadas através de um filtro de 0,22 μm, e as partículas virais foram sedimentadas através de um colchão de sacarose a 20% em um rotor SW28 por centrifugação a 28.000 rpm por 90 min. Os estoques de vírus foram armazenados a -80°C até uso posterior. Todos os experimentos neste estudo foram aprovados pelo comitê de ética do Primeiro Hospital da Universidade de Jilin.

Ensaio de Viabilidade Celular
As células foram tratadas com zinco em gradiente de dose quando a confluência das células RD era de 80%. Preparamos poços em quadruplicata para cada dose em uma placa de 96 poços e preenchemos cada poço com 100 μl de meio. Um grupo branco foi preparado sem células, mas preenchido com meio. Antes de adicionar a solução de zinco, os poços foram lavados uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para evitar a interferência de células mortas. Após 24h de incubação, os poços foram lavados uma vez com PBS e 10 μl de MTS (Biocompare, San Francisco, CA, Estados Unidos) foram adicionados a cada poço, em condições de escuro. Nas 4h seguintes, o valor de DO foi testado a 490 nm por um leitor de placas 550 Bio-Rad a cada hora. Os dados foram analisados com o software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos), e o IC50 foi calculado.
Ensaio de Título Viral
Os vírus dos sobrenadantes foram isolados conforme descrito anteriormente. O sobrenadante foi submetido a três ciclos de congelamento e descongelamento. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 3.000 rpm por 10 min, e os sobrenadantes foram coletados. Os títulos virais foram determinados com base no aparecimento de efeitos citopáticos (ECPs) em células RD usando uma análise de microtitulação de acordo com o método de Reed-Muench. Os títulos virais foram expressos como a dose infecciosa de cultura de tecidos 50% (TCID50).
Quantificação de RNA Viral
O RNA total foi extraído usando um kit de isolamento de RNA viral (Foregene, Chengdu, Sichuan, China) de acordo com o protocolo do fabricante. O cDNA foi gerado usando um kit de transcriptase reversa (TransGen, Beijing, China). O RNA viral foi quantificado usando qRT-PCR com a mistura de reação SYBR Green (GenStar, Beijing, China) em um Roche LightCycler 480 (Roche, Basel, Suíça). O seguinte primer foi utilizado: GAPDH forward primer 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3'; GAPDH reverse primer 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'; EV-D68 forward primer 5'-TGTTCCCACGGTTGAAAACAA-3'; e EV-D68 reverse primer 5'-TGTCTAGCGTCTCATGGTTTTCAC-3'. Os níveis relativos de RNA de EV-D68 em diferentes amostras foram determinados usando o método comparativo 2−△△CT e normalizados para o gene GAPDH.
Imunotransferência
As células foram coletadas em vários pontos de tempo após a infecção, lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas em tampão de lise [150 mM Tris (pH 7,5) contendo 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 e coquetel inibidor de protease completo (Roche)] e tampão de carregamento [0,08 M Tris (pH 6,8) contendo 2,0% SDS, 10% glicerol, 0,1 M DTT e 0,2% azul de bromofenol]. As soluções foram fervidas e vortexadas por 10 min e então centrifugadas a 12.000 rpm por 10 min. As proteínas do sobrenadante foram separadas usando SDS-PAGE e transferidas para membranas de nitrocelulose usando um aparelho semi-seco (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos). As membranas foram sondadas com anticorpos primários [anticorpo policlonal anti-EV-D68 VP1 (GTX132312, Genetex, Irvine, CA, Estados Unidos) e anticorpo monoclonal anti-α-tubulina (A01410, GenScript, Nanjing, Jiangsu, China)] a 4°C durante a noite, seguidas de incubação com anticorpos secundários (IgG de cabra anti-coelho conjugada com fosfatase alcalina (código: 115-005-045, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, Estados Unidos) e IgG de cabra anti-camundongo (código: 115-055-062, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, Estados Unidos), respectivamente por 1 h a 25°C. As membranas foram coradas com 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato e cloreto de nitrotetrazólio azul (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos) e visualizadas para quantificação de bandas.
Ensaios de Aderência Viral
Para experimentos de aderência viral, as células foram primeiro lavadas com PBS frio e então incubadas com vírus (multiplicidade de infecção, MOI=0,1) a 4 ou 37°C por 2 h. Após isso, as células infectadas foram lavadas com DMEM frio para remover vírus não aderidos. O RNA total foi extraído usando um kit de isolamento de RNA viral (Foregene, Chengdu, Sichuan, China). O RNA viral aderido foi determinado usando qRT-PCR conforme descrito acima.
Análise Estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos). As diferenças entre os grupos de teste foram analisadas usando ANOVA. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Íons de Zinco Inibem a Replicação do EV-D68
Para investigar os efeitos dos sais de zinco na infectividade do EV-D68, células RD foram tratadas com cloreto de zinco (ZnCl₂), seguidas de desafio com um protótipo Fermon de EV-D68 (MOI=0,1). Os ECPs foram detectados 48h pós-infecção (hpi) no grupo controle, enquanto as células tratadas com ZnCl₂ mostraram resistência proeminente aos ECPs (Figura 1A). Os títulos de vírus totais foram significativamente suprimidos com o tratamento com ZnCl₂ (Figura 1B). Consistentemente, a proteína estrutural viral VP1 no sobrenadante de células infectadas também foi reduzida (Figura 1C). O valor de EC50 do ZnCl₂ contra a replicação do EV-D68 foi de aproximadamente 0,033mM (Figura 1D). Também medimos a citotoxicidade do ZnCl₂ usando o ensaio MTS e determinamos que o IC50 do ZnCl₂ era de 0,26mM (Figura 1E), que foi muito maior que o EC50 da atividade antiviral. A atividade anti-EV-D68 do ZnCl₂ também foi observada em outras células permissivas, nomeadamente células A549 e células HeLa (Figura Suplementar S1). Além disso, também confirmamos o efeito inibitório do sulfato de zinco e do acetato de zinco na replicação do EV-D68 (Tabela 1). Coletivamente, os íons de zinco podem inibir potentemente o EV-D68.
O ZnCl₂ inibe a replicação do enterovírus D68 (EV-D68). (A) Após exposição de 2h ao EV-D68, células RD foram tratadas com ZnCl₂. As células foram incubadas sob condições padrão. Efeitos citopáticos (ECPs) foram observados 48h pós-infecção (hpi). (B) Determinação da produção viral de progênie. Sobrenadantes foram coletados 48hpi, e os títulos virais foram determinados por ensaio de placa padrão. As barras de erro indicam o DP (p<0,05, p<0,01 e p<0,001). (C) Expressão de VP1 no sobrenadante de células RD tratadas com ZnCl₂. O sobrenadante foi coletado em 48hpi, e as amostras foram preparadas para western blot. (D) Efeito do zinco na replicação do RNA do EV-D68 (EC50=0,033mM). (E) Ensaio de viabilidade celular. A toxicidade celular do cloreto de zinco foi avaliada pelo ensaio MTS.
Efeito de vários sais de zinco na replicação do EV-D68.
Sal Concentração Título viral (mM) (48hpi.) Cloreto 0 5,5 0,01 5 0,1 4 Sulfato 0 5 0,01 4,5 0,1 4 Acetato 0 5 0,01 4,3 0,1 4
Os sais de zinco exercem efeito inibitório na replicação do EV-D68. Células RD infectadas com EV-D68 foram tratadas com vários sais de zinco (cloreto de zinco, sulfato de zinco e acetato de zinco). Em 48hpi, o sobrenadante foi coletado para ensaio de título viral.
Íons de Zinco Suprimem a Entrada do EV-D68
Procuramos determinar a fase do ciclo de vida do EV-D68 que foi inibida pelo tratamento com ZnCl₂. Células RD pré-tratadas com ZnCl₂ foram incubadas com quantidades iguais de partículas de EV-D68 a 4 e 37°C (Figura 2A). Duas horas depois, os virions não ligados foram lavados com PBS frio, e a fixação e entrada do RNA viral foram determinadas usando qRT-PCR. Os resultados indicaram que tanto a fixação quanto a entrada do vírus foram inibidas pelo tratamento com ZnCl₂ (Figuras 2B,C), em comparação com os grupos controle.
Íons de zinco suprimem a entrada do EV-D68. (A–C) Células RD pré-tratadas com ZnCl2 por 24h. As células RD foram pré-resfriadas a 4°C por 30min antes do desafio com a cepa Fermon do EV-D68, e as células foram mantidas a 4 ou 37°C por 2h. Partículas virais não aderidas foram lavadas. As células foram coletadas para ensaio de qRT-PCR para detectar a replicação viral. (D–F) O EV-D68 foi incubado com ZnCl2 por 2h a 37°C. As células RD pré-resfriadas foram tratadas com essa mistura a 4 ou 37°C por 2h. As células foram coletadas com 2 hpi para ensaio de qRT-PCR. As barras de erro indicam o desvio padrão (p<0,05; p<0,01; e p<0,001).

Para eliminar os potenciais efeitos da interação entre os íons de zinco e as partículas do EV-D68 sobre a atividade antiviral do ZnCl2, primeiro incubamos os vírions do EV-D68 com ZnCl2 por 2h antes de processar o ensaio de fixação ou entrada do vírus (Figura 2D). A pré-incubação com ZnCl2 não teve influência significativa na entrada do EV-D68 (Figuras 2E, F). Assim, nossos resultados sugeriram que os íons de zinco inibiram a entrada do EV-D68 aparentemente devido ao efeito do ZnCl2 na capacidade das células de suportar a replicação viral, e não a um efeito direto sobre o próprio vírus.

Íons de Zinco também Interferem na Liberação do EV-D68

Como nossos dados mostraram que a inibição da entrada do EV-D68 foi mais branda do que a supressão da replicação do EV-D68 pelos íons de zinco, suspeitamos que os sais de zinco também podem bloquear a replicação viral em outras etapas do ciclo de vida do EV-D68. Os níveis de VP1 foram usados como indicadores da síntese de proteínas virais intracelulares e da liberação de partículas virais. Células RD foram desafiadas com EV-D68 (MOI=0,1). Após 48h, as células e o sobrenadante foram colhidos para o ensaio de imunoblotagem. O ZnCl2 mostrou efeitos leves na expressão de VP1 nos lisados celulares, mas diminuiu potentemente o VP1 extracelular (Figuras 3A, B). Em seguida, medimos as alterações nos níveis de VP1 durante a infecção na presença ou ausência de ZnCl2 em diferentes tempos após a infecção e descobrimos que o ZnCl2 inibiu os níveis de expressão de VP1 extracelular de forma mais potente do que o VP1 intracelular. Também descobrimos que o ZnCl2 exerceu um efeito inibitório sobre os níveis de VP1 extracelular após 8h, o que foi próximo ao final do primeiro ciclo de vida do EV-D68 (Figuras 3C–E). Em resumo, os íons de zinco pareceram exibir atividade antiviral dupla contra o EV-D68 durante as etapas de entrada e liberação viral.

Íons de zinco suprimem a liberação do EV-D68. (A) Expressão de VP1 no sobrenadante e no lisado celular com 48hpi. (B) O nível de expressão da proteína do capsídeo viral no sobrenadante e no lisado celular sob a mesma concentração tratada com ZnCl2 foi comparado entre si. (C) As alterações na expressão de VP1 do sobrenadante e dos lisados celulares entre o grupo de tratamento com ZnCl2 e o grupo controle em diferentes tempos após a infecção. Células RD foram tratadas com ZnCl2 em vários pontos de tempo específicos, e o nível de expressão da proteína do capsídeo viral no sobrenadante (D) e nos lisados celulares (E) foi comparado com o do grupo controle pelo Image J.

Íons de Zinco Inibem a Cepa Circulante dos EUA de 2014 do EV-D68
Recentemente, nós e outros demonstramos que o vírus protótipo EV-D68 e as cepas circulantes dos EUA de 2014 mantêm diferentes sensibilidades para a entrada viral mediada por ácido siálico. Para avaliar a ampla atividade anti-EV-D68 do ZnCl2, examinamos sua atividade antiviral contra a infecção viral por isolados primários de EV-D68 (US/MO/14–18947 [MO] e US/KY/14–18953 [KY]). Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl2 protegeu as células RD contra ambas as cepas circulantes dos EUA de 2014 do EV-D68, conforme demonstrado por diminuições nos ECPs relacionados (Figura 4A). A proteína viral VP1 também foi reduzida pelos íons de zinco (Figuras 4B,C). Além disso, observamos uma supressão significativamente maior dos níveis de VP1 no sobrenadante do que nos lisados celulares, o que apoiou ainda mais nossa conclusão de que os íons de zinco mantinham atividades antivirais duais na entrada e liberação viral. Além disso, o tratamento com ZnCl2 diminuiu significativamente os títulos virais dos virions totais das cepas MO e KY (Figuras 4D,E), em comparação com o grupo controle.
O zinco exerce efeitos inibitórios nas cepas US/MO/14-18947 e US/KY/14-18953. (A) Efeitos citopáticos foram observados às 48 hpi. (B,C) Imunotransferência mostrando expressão de VP1 às 48 hpi. (D,E) Determinação da produção de vírus progenitores. Sobrenadantes foram coletados às 48 hpi, e os títulos virais foram determinados por ensaio de placa padrão. As barras de erro indicam o DP (p<0.05; p<0.01; e p<0.001).
Pirrolidina Ditiocarbamato Aumenta a Atividade Antiviral dos Íons de Zinco Contra o EV-D68
A pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), um ionóforo de zinco, demonstrou restringir a infecção por diferentes vírus humanos ao facilitar a importação de íons de zinco para as células. Investigamos se o PDTC poderia fortalecer a atividade anti-EV-D68 dos íons de zinco. Utilizamos uma concentração muito menor de ZnCl2 (0,0005 mM) para tratar células RD, que não mostrou efeito protetor contra a infecção por EV-D68 (Figura 5). Enquanto isso, um tratamento único com PDTC a uma concentração de 65 μM também não mostrou influência na infecção viral. A expressão intracelular de VP1 foi suprimida apenas na presença de ambos PDTC e ZnCl2, em comparação com o grupo controle (Figura 5A). O tratamento com PDTC e ZnCl2 aumentou significativamente a resistência das células RD à infecção por EV-D68 (Figura 5B). Observamos que a mudança na dobra dos títulos de virions liberados é maior do que a expressão intracelular de VP1 na presença do tratamento com PDTC, o que apoia ainda mais nossa conclusão de que a inibição do EV-D68 pelo influxo de zinco tem como alvo principal a etapa de liberação viral. Além disso, confirmamos que os íons de zinco do SFB estavam associados à atividade antiviral do PDTC (Figura 5C). Portanto, o aumento do influxo de íons de zinco pode fortalecer as células hospedeiras contra a infecção por EV-D68.
Tratamento combinado de zinco e ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC) inibe a replicação do EV-D68. (A) A combinação de PDTC e zinco tem um efeito inibitório na expressão celular de VP1. (B) A combinação de PDTC e zinco diminui a quantidade de vírions liberados de células RD infectadas. (C) Células infectadas foram tratadas com PDTC com ou sem soro fetal bovino (SFB). O íon zinco no SFB ajuda o PDTC a exercer o efeito inibitório viral.

Discussão

O enterovírus D68 e o EV-A71 são os dois principais enterovírus não poliomielite que circulam periodicamente ao redor do mundo. Devido à atual pandemia da doença do coronavírus de 2019 (COVID-19), o número de casos relatados de EV-D68 diminuiu nos últimos anos. No entanto, o EV-D68 ainda é uma ameaça não negligenciável à saúde pública devido à sua rápida disseminação e neurotoxicidade irreversível. Em nosso estudo, demonstramos que os íons de zinco podem suprimir o efeito citopático (CPE) e a geração de vírus infecciosos pelo EV-D68 in vitro. Diferentes sais de zinco, nomeadamente cloreto de zinco, sulfato de zinco e acetato de zinco, tiveram efeitos idênticos na inibição do EV-D68 (Tabela 1). A inibição foi dependente da concentração e de amplo espectro tanto para a cepa protótipo quanto para as cepas circulantes do EV-D68 nos EUA em 2014 (Figura 4). Portanto, nossos resultados apoiam a noção de que a suplementação com zinco pode servir como um potencial tratamento profilático e terapêutico contra a infecção por EV-D68.

Relata-se que a suplementação com zinco inibe a replicação de diversos vírus, como o vírus herpes simplex (HSV), o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o vírus vaccínia. A suplementação com zinco interfere nesses vírus em diferentes estágios, incluindo a inibição do desnudamento viral, da transcrição do genoma viral, da tradução de proteínas virais e do processamento de poliproteínas virais. Aqui, descobrimos que os íons de zinco diminuíram a capacidade do EV-D68 de se ligar às células-alvo, que é a etapa inicial para a entrada do EV-D68 (Figura 2). Semelhante a esse comportamento, estudos anteriores revelaram que os íons de zinco podem se encaixar nos cânions na superfície dos vírions do rinovírus, impedindo assim a ligação dos vírus à superfície celular. Esses resultados foram consistentes com estudos anteriores de microscopia crioeletrônica estrutural que mostraram alta similaridade entre a conformação da superfície do EV-D68 e do rinovírus. Além disso, confirmamos que a inibição dependia do efeito do ZnCl₂ na capacidade das células de suportar a replicação viral, em vez de um efeito direto sobre o próprio vírus.
Além da inibição da entrada do EV-D68, também descobrimos que o tratamento com zinco suprimiu a liberação total de vírions das células produtoras, comparando as taxas de expressão de VP1 nas células e no sobrenadante durante a replicação viral (Figura 3). Assim, os íons de zinco bloquearam potente a infecção por EV-D68 através da dupla inibição da entrada e liberação do vírus. Os fatores intracelulares detalhados alvejados pelos íons de zinco, que são essenciais para sua atividade anti-EV-D68, merecem investigação adicional. No entanto, o presente estudo enriqueceu ainda mais nossa compreensão dos mecanismos de ação dos sais de zinco contra infecções virais.

O nível fisiológico de zinco no plasma é de 10–20 μM, e apenas cerca de 10–20% do zinco ingerido é absorvido. Aumentar a sensibilidade das células hospedeiras à inibição do EV-D68 pelos sais de zinco poderia ser útil para a aplicação de sais de zinco no tratamento antiviral. Descobrimos que o ionóforo de zinco PDTC, que facilita o influxo de íons de zinco nas células, amplificou fortemente a atividade antiviral do zinco. A concentração de ZnCl2 que usamos foi muito menor que a EC50, não mostrando efeito significativo na infecção por EV-D68 em células tratadas individualmente, mas suprimindo potente a infecção viral na presença de PDTC. Esses resultados mostraram que aumentar o influxo de zinco pode ser uma estratégia potencialmente eficaz para o tratamento antiviral.

É importante investigar melhor a infecção por EV-D68 e os resultados clínicos em populações com deficiência de zinco e em lactentes com suplementação de zinco. Considerando a segurança do uso de zinco, sua fácil disponibilidade e a atividade antiviral, o trabalho aqui descrito fornece evidências convincentes de que a suplementação de zinco é um candidato terapêutico ideal para o tratamento de infecções por EV-D68.

Declaração de Disponibilidade de Dados
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no artigo/Material Suplementar; mais informações podem ser solicitadas aos autores correspondentes.

Contribuições dos Autores
WW, SL e HG realizaram a redação do manuscrito. WW, SL, HG e XC realizaram a análise de dados. WW contribuiu para o desenho do estudo. SL e HG realizaram a coleta de dados. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.

Financiamento
Este trabalho foi apoiado em parte por financiamento da National Natural Science Foundation of China (81772183 e 31800150), do National Science and Technology Major Project (2018ZX10731-101-001-016), do projeto aberto do Key Laboratory of Organ Regeneration and Transplantation, Ministry of Education (20202005), e do Department of Science and Technology of Jilin Province (Nos. 20190304033YY e 20180101127JC).

Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Nota do Editor
Todas as afirmações expressas neste artigo são de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, as do editor, os editores e os revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou afirmação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.

Material Suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.748546/full#supplementary-material

Referências
Sais de zinco inativam isolados clínicos do vírus herpes simplex in vitro
Requisitos do receptor do enterovírus D68 revelados pela genética haploide
Ensaio clínico randomizado e controlado de suplementação de zinco para prevenir falha imunológica em adultos infectados pelo HIV
Inibição da replicação do vírus Sindbis por íons de zinco
Examinando a relação estresse-esgotamento: o papel mediador de pensamentos negativos
A neurociência cognitiva da memória de trabalho
Mecanismo de inibição da transcriptase reversa do HIV pelo zinco: formação de um complexo enzima-(primer-molde) altamente estável com atividade catalítica profundamente diminuída
Inibição seletiva da DNA polimerase do vírus herpes simplex tipo 1 por íons de zinco
Uma segunda janela aberta de leitura no enterovírus humano determina a replicação viral em células epiteliais intestinais
Inibição da infecção pelo HIV-1 por compostos metálicos do grupo do zinco
Metil-beta-ciclodextrina inibe a entrada do vírus EV-D68 ao perturbar o acúmulo de partículas virais e ICAM-5 em balsas lipídicas
Inibição da maturação do vírus vaccinia por cloreto de zinco
Íons de zinco inibem a replicação de rinovírus
O mecanismo da atividade anti-herpética do sulfato de zinco
PDTC inibe o processamento da poliproteína do picornavírus e a replicação do RNA ao transportar íons de zinco para dentro das células
Identificação de uma região específica na proteína de fusão e1 envolvida na inibição por zinco da fusão do vírus da floresta de Semliki
Entrada celular do enterovírus D68 humano dependente de ácido siálico
Estrutura e inibição do EV-D68, um vírus que causa doença respiratória em crianças
Uma região codificadora de proteína a montante em enterovírus modula a infecção viral em células epiteliais intestinais
Emergência do enterovírus D68 na Dinamarca, junho de 2014 a fevereiro de 2015
Doença respiratória grave associada ao enterovírus D68—Missouri e Illinois, 2014
Relato de caso de paralisia flácida aguda causada por infecção pelo enterovírus D68: o início de uma epidemia semelhante à poliomielite?
Pirrolidina ditiocarbamato inibe a replicação do herpes simplex vírus 1 e 2, e sua atividade pode ser mediada pela desregulação do sistema ubiquitina-proteassoma
Um método simples de estimar endpoints de cinquenta por cento
Um provável novo picornavírus humano associado a doenças respiratórias
Efeito dos sais de zinco na replicação do vírus sincicial respiratório
Zinco e infecção
ICAM-5/Telencefalina é um receptor de entrada funcional para o enterovírus D68
O zinco é um regulador negativo da replicação do RNA do vírus da hepatite C