pmid: "35255411"
title: "Inibição da replicação do SARS-CoV-2 pelo gluconato de zinco em combinação com hinokitiol."
authors: "Tao X, Zhang L, Du L, Lu K, Zhao Z, Xie Y, Li X, Huang S, Wang PH, Pan JA, Xia W, Dai J, Mao ZW"
journal: "Journal of inorganic biochemistry"
pubdate: "2022 Jun"
doi: "10.1016/j.jinorgbio.2022.111777"
source: "PMC Full Text"

Inibição da replicação do SARS-CoV-2 pelo gluconato de zinco em combinação com hinokitiol.

Autores

Tao X, Zhang L, Du L, Lu K, Zhao Z, Xie Y, Li X, Huang S, Wang PH, Pan JA, Xia W, Dai J, Mao ZW

Periodico

Journal of inorganic biochemistry (2022 Jun)

Conteudo

Inibição da replicação do SARS-CoV-2 pelo gluconato de zinco em combinação com hinokitiol
A pandemia do Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) é atualmente o principal desafio para a saúde pública global. Duas proteases, a protease semelhante à papaína (PLpro) e a protease semelhante à 3-quimotripsina (3CLpro ou Mpro), são indispensáveis para a replicação do SARS-CoV-2, tornando-as alvos atraentes para o desenvolvimento de terapias antivirais. Aqui, examinamos um painel de íons metálicos essenciais usando um ensaio proteolítico e identificamos que o gluconato de zinco, um suplemento de zinco amplamente utilizado, inibiu fortemente as atividades proteolíticas das duas proteases in vitro. Dados bioquímicos e cristalográficos revelam que o gluconato de zinco exerceu a função inibitória através da ligação aos resíduos do sítio catalítico da protease. Mostramos ainda que o tratamento com gluconato de zinco em combinação com o ionóforo de pequena molécula hinokitiol, pode levar a um nível elevado de Zn2+ intracelular e, consequentemente, prejudicar significativamente as atividades das duas proteases in cellulo. Particularmente, esta abordagem também pode ser aplicada para resgatar células de mamíferos infectadas pelo SARS-CoV-2, indicando uma aplicação potencial para combater infecções por coronavírus. Nossos estudos fornecem a evidência experimental direta de que o aumento da concentração intracelular de zinco inibe diretamente a replicação do SARS-CoV-2 e sugerem os potenciais benefícios do uso de suplementos de zinco para o tratamento da doença do coronavírus 2019 (COVID-19).
Resumo gráfico
A protease semelhante à 3-quimotripsina (3CLpro) e a protease semelhante à papaína (PLpro) são duas proteases essenciais para o processamento de poliproteínas no Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2). O gluconato de zinco inibe as atividades proteolíticas de 3CLpro e PLpro tanto in vitro quanto in cellulo, resultando na inibição da replicação do SARS-CoV-2 em células de mamíferos.
Introdução
O Coronavírus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) é a causa da atual pandemia da doença do coronavírus 2019 (COVID-19). Esta crise mundial de saúde pública resultou em mais de 5,6 milhões de mortes em todo o mundo até o final de janeiro de 2022. Semelhante ao coronavírus da SARS (SARS-CoV), o SARS-CoV-2 também codificou duas proteases essenciais para o processamento das poliproteínas que são traduzidas a partir do RNA viral, a protease semelhante à papaina (PLpro, codificada dentro de nsp3) e a protease "principal" semelhante à 3-quimotripsina (3CLpro ou Mpro, codificada por nsp5). Portanto, as duas proteases podem servir como alvos promissores de potenciais agentes terapêuticos. Uma série de inibidores de protease do SARS-CoV-2 foram relatados. Por exemplo, os medicamentos aprovados para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Lopinavir e Ritonavir, estão sendo estudados em ensaios clínicos de Fase III como inibidores da 3CLpro. E vários outros compostos orgânicos estão sendo considerados em ensaios pré-clínicos. Recentemente, vários compostos à base de metais também foram relatados por exibirem propriedades antivirais, como complexos de Au, complexos de bismuto e complexos de tricarbonila de Re(I). Apesar do grande esforço, ainda não existe um tratamento antiviral eficaz para a COVID-19. Devido à rápida propagação e ao crescente número de pacientes infectados em todo o mundo, tratamentos custo-efetivos, seguros com efeitos colaterais mínimos e de fácil aplicação são urgentemente necessários.

A análise estrutural da PLpro e 3CLpro do SARS-CoV-2 revela que o centro catalítico da PLpro consiste em uma cisteína e uma histidina, enquanto o sítio ativo da 3CLpro é composto por uma cisteína, uma histidina e um ácido aspártico. Espera-se que o grupo imidazol da histidina, o grupo carboxila do ácido aspártico e especialmente o grupo tiol da cisteína formem ligações de coordenação com íons de metais de transição. Portanto, as atividades proteolíticas dessas duas enzimas poderiam ser potencialmente abolidas pela ligação de íons de metais de transição, o que resulta ainda na inibição da replicação do SARS-CoV-2, conforme relatado anteriormente. Evidências crescentes apoiam uma estreita relação entre a concentração intracelular de metais e a imunidade inata. Por exemplo, a análise de metais demonstrou que o teor total de zinco estava elevado em macrófagos ativados infectados por patógenos bacterianos ou fúngicos. Estudos recentes também mostraram que o íon manganês foi liberado das organelas celulares e se acumulou no citosol após a infecção viral. A mudança na concentração intracelular de metais confere à célula hospedeira uma capacidade mais forte de combater a infecção.

O mecanismo de como um tratamento combinado de Zn2+-hinokitiol inibe a replicação intracelular do SARS-CoV-2.
Esquema 1
Aqui, relatamos que o gluconato de zinco, um suplemento oral de zinco comumente utilizado, é um potente inibidor das duas proteases essenciais do SARS-CoV-2, PLpro e 3CLpro, in vitro e in cellulo. A co-cristalografia da 3CLpro com gluconato de zinco mostrou que o Zn2+ livre se ligou à díade catalítica para prejudicar a atividade da protease. Importante, o tratamento com gluconato de zinco em combinação com o ionóforo hinokitiol aboliu significativamente as atividades das proteases in cellulo e inibiu a replicação do SARS-CoV-2 em células de mamíferos, indicando que o zinco pode ser um potente inibidor para suprimir a replicação do SARS-CoV-2 (Esquema 1). A inibição da replicação do SARS-CoV-2 pela combinação de medicamentos de zinco e hinokitiol descrita aqui pode lançar luz sobre o desenvolvimento de uma abordagem segura e fácil de usar para tratar a COVID-19.
Resultados
Identificação de íons metálicos inibidores para PLpro e 3CLpro do SARS-CoV-2. Gráficos de barras mostram as atividades relativas da protease PLpro (A) e 3CLpro (B) após incubação com 50 μM de diferentes íons metálicos, respectivamente. Ensaios de deslocamento térmico de proteínas baseados em fluorescência da PLpro (C) e 3CLpro (D) do SARS-CoV-2, respectivamente. Cada experimento foi realizado em triplicata. Os dados são apresentados como média ± dp.
Fig. 1
Para investigar se os íons de metais de transição poderiam impactar o processamento da poliproteína do SARS-CoV-2, um ensaio proteolítico in vitro foi projetado para triar íons metálicos contra as atividades da 3CLpro (ou PLpro) usando um peptídeo fluorogênico como substrato. Conforme mostrado na Fig. 1, a presença dos íons de metais de transição divalentes Co2+, Ni2+, Cu2+ e Zn2+ retardou substancialmente as atividades de ambas as PLpro e 3CLpro. Para a PLpro, Co2+, Ni2+, Cu2+ e Zn2+ inibiram 54%, 36%, 98% e 98% da atividade proteolítica, respectivamente (Fig. 1A). Enquanto isso, a atividade proteolítica da 3CLpro foi abolida em 36%, 74% e 97,6% na presença de Co2+, Cu2+ e Zn2+ (Fig. 1B). Em particular, 50 μM de Zn2+ conseguiu abolir completamente as atividades de ambas as PLpro e 3CLpro. Além disso, ensaios de deslocamento térmico de proteínas baseados em fluorescência (F-TSA) com diferentes íons metálicos também demonstraram que o Zn2+ foi o íon metálico mais potente para diminuir as temperaturas de fusão da PLpro e da 3CLpro, indicativo de desestabilização das duas proteases após a ligação do Zn2+ (Fig. 1C e D). A desestabilização das duas proteases observada aqui foi provavelmente devida à distorção conformacional após a ligação do Zn2+, uma vez que o Zn2+ não é um ligante fisiológico para as proteases.
Para investigar melhor as propriedades de ligação ao Zn2+ das duas proteases, examinamos a capacidade de ligação ao Zn2+ da PLpro e da 3CLpro usando espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). A apo-PLpro contém 0,85 ± 0,09 equivalentes molares (eq.) de Zn2+, o que é consistente com o estudo de que a PLpro possui um sítio conservado de dedo de zinco. Em contraste, nenhum teor de Zn2+ ligado foi detectado para a apo-3CLpro. Após incubação com 5 eq. de Zn2+, a PLpro saturada com Zn2+ apresentou capacidade de ligação aumentada com 1,90 ± 0,01 eq. de Zn2+ por monômero, indicativo de um sítio adicional de Zn2+. Enquanto a 3CLpro (monômero) foi capaz de ligar 1,24 ± 0,01 eq. de Zn2+ (Fig. S1). De forma consistente, experimentos de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) também demonstraram que a PLpro ligou 1,23 ± 0,01 eq. de Zn2+ com um valor de constante de dissociação (K D) de 2,17 ± 0,36 μM, enquanto a 3CLpro (monômero) ligou 0,79 ± 0,01 eq. de Zn2+ com um valor de K D similar de 4,08 ± 0,66 μM (Fig. S2).
Inibição das atividades proteolíticas da PLpro (A) e da 3CLpro (B) por Zn2+ em concentrações variadas in vitro. Curvas de dose-resposta para os valores de concentração inibitória média (IC50) foram determinadas por regressão não linear.
Fig. 2
Para elucidar a atividade inibitória do Zn2+ para a PLpro e a 3CLpro in vitro, os valores de concentração inibitória média (IC50) para a inibição por Zn2+ foram calculados. Conforme mostrado na Fig. 2A, B, os valores de IC50 do Zn2+ para a PLpro e a 3CLpro do SARS-CoV-2 foram de 0,53 ± 0,04 μM e 0,54 ± 0,04 μM, respectivamente. Os valores de IC50 submicromolares calculados são comparáveis aos relatados para inibidores potentes de moléculas pequenas, como o Boceprevir com um valor de IC50 de 4,13 ± 0,61 μM para a 3CLpro. Além disso, a inibição do Zn2+ na atividade de desubiquitinação da PLpro também foi examinada usando o substrato ubiquitina-AMC conforme descrito anteriormente. E o resultado revelou que 0,1 μM de Zn2+ poderia levar a 95,7% de inibição da atividade da PLpro (Fig. S3). As curvas de saturação de Michaelis-Menten da PLpro e da 3CLpro também foram plotadas antes e após a ligação ao Zn2+. Inesperadamente, o k cat e o Km de ambas as proteases diminuíram após a ligação ao Zn2+, enquanto os valores de k cat /Km permaneceram inalterados, implicando que o Zn2+ é um inibidor incompetitivo tanto para a PLpro quanto para a 3CLpro (Fig. S4). Coletivamente, os resultados indicaram que o Zn2+ possui alta afinidade pela PLpro e pela 3CLpro para inibir suas atividades proteolíticas in vitro.
Posteriormente, tentamos examinar o modo de ligação do Zn2+ à PLpro e à 3CLpro resolvendo as estruturas de co-cristal da PLpro e da 3CLpro ligadas ao Zn2+. Apesar de grande esforço, não conseguimos obter cristais de PLpro. No entanto, descobrimos que o mutante de resíduo catalítico PLproC112S apresentava quase a mesma capacidade de ligação ao Zn2+ antes e depois da incubação com excesso de Zn2+, com 0,85 ± 0,01 e 0,71 ± 0,01 eq. de Zn2+, respectivamente (Fig. S5), indicando uma perda do sítio adicional de Zn2+ além do dedo de zinco. Os resultados dos experimentos bioquímicos demonstraram que o Zn2+ se liga ao centro catalítico para inibir a atividade proteolítica da PLpro.

Felizmente, a 3CLpro purificada produziu cristais tridimensionais em uma solução reservatório contendo 15% de PEG20000 e 100 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), pH 6,5. O Zn2+ foi incorporado ao cristal de 3CLpro em solução reservatório contendo 5 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e 2 mM de gluconato de zinco por 17 h. Os cristais de proteína foram transferidos para uma solução crioprotetora contendo a solução reservatório suplementada com 15–20% de glicerol (v/v) e congelados instantaneamente em nitrogênio líquido. Os cristais de 3CLpro incorporados com Zn2+ pertencem ao grupo espacial C2 e difrataram a uma resolução de 2,45 Å. As fases iniciais foram obtidas por substituição molecular com os programas PHASER e Molrep no pacote CCP4, utilizando a forma apo da 3CLpro do SARS-CoV-2 (PDB: 6M2Q) como modelo de busca. O modelo estrutural final contém um monômero de 3CLpro do SARS-CoV-2 em uma unidade assimétrica e foi refinado para um Rwork de 20,1% e Rfree de 24,2% (Tabela S2). A estrutura geral da Zn2+-SARS-CoV-2-3CLpro adota um dobramento típico de estrutura de 3CLpro com o domínio I (resíduos 10–99), II (resíduos 100–184), III (resíduos 201–300) e uma longa região de alça (resíduos 185–200) conectando os domínios II e III. A sobreposição estrutural revela que as estruturas da apo e da Zn2+-SARS-CoV-2-3CLpro são bastante semelhantes, com um valor de RMSD da cadeia principal de 0,3 Å.

Estrutura cristalina da Zn2+-3CLpro. (A) Estrutura geral do homodímero de Zn2+-3CLpro com dois sítios potenciais de ligação ao Zn2+. A estrutura é mostrada como modelo de cartoon. As duas cadeias são coloridas em salmão e cinza, respectivamente. Os íons de zinco são mostrados em esferas laranja. (B) Ligação do Zn2+ ao sítio catalítico da 3CLpro do SARS-CoV-2. Os resíduos ligantes são mostrados em modelo de bastões. A molécula de água coordenada é mostrada em esfera vermelha. (Para interpretação das referências à cor nesta legenda de figura, o leitor é remetido à versão web deste artigo.)
Fig. 3
Dois sítios com densidade eletrônica redundante em uma unidade assimétrica foram observados, os quais são atribuídos como sítios de ligação de Zn2+ (Fig. 3A e S6). Um sítio está no centro catalítico da díade (sítio I), e o outro está localizado na superfície da estrutura proteica (sítio II) (Fig. 3A). Os resíduos de coordenação do sítio de ligação de Zn2+ tetraédrico I envolvem Cys145, His41, His164 e uma molécula de água (Fig. 3B). As distâncias entre o Zn2+ e o átomo de enxofre no grupo tiol de Cys145, o átomo de nitrogênio no grupo imidazolil de His41, o átomo de oxigênio na cadeia principal de His164 e a molécula de água são 2,4 Å, 2,1 Å, 3,9 Å e 4,4 Å, respectivamente. Para o sítio II, Cys156, Asp153 e Asp155 estão envolvidos na ligação (Fig. S7). As distâncias entre o Zn2+ e o átomo de enxofre no grupo tiol de Cys156, os dois átomos de oxigênio carbonila de Asp153 e os dois átomos de oxigênio carbonila de Asp155 são 2,6 Å, 2,3 Å, 3,1 Å, 2,7 Å e 3,1 Å, respectivamente. Vale notar que os resultados de ICP-MS revelaram que a 3CLpro (monômero) só poderia ligar 1 equivalente molar de Zn2+. Essa discrepância é provavelmente devida à fraca associação do Zn2+ ao sítio de ligação II altamente exposto durante a difusão do cristal. Vale notar que os sítios de coordenação de Zn2+ aqui são diferentes das estruturas do complexo 3CLpro-Zn2+ recentemente relatadas. Na estrutura de alta resolução de 1,9 Å do complexo 3CLpro-Zn2+ (PDBID: 7DK1), apenas um sítio de Zn2+ foi identificado e coordenado com a cadeia lateral de Cys145, His41 e duas moléculas de água. A discrepância no sítio de ligação de Zn2+ é provavelmente devida ao diferente empacotamento cristalino.

Para excluir a possibilidade de que a ligação de Zn2+ ao sítio II prejudique a atividade da 3CLpro, construímos ainda um duplo mutante da 3CLpro, 3CLproD155A/C156S, para abolir o sítio de ligação II. Ensaios de atividade proteolítica in vitro mostraram que a atividade de 3CLproD155A/C156S foi comparável à da 3CLpro do tipo selvagem (WT), sugerindo que a estrutura geral da 3CLpro não foi alterada pelas mutações (Fig. S8). No entanto, a adição de Zn2+ também inibiu a atividade de 3CLproD155A/C156S com um valor de IC50 calculado de 1,54 ± 0,05 μM, que é semelhante ao valor da 3CLpro-WT (Fig. S9). Coletivamente, os resultados indicaram que o Zn2+ se ligou ao sítio catalítico (sítio I) da 3CLpro e, assim, inibiu a atividade proteolítica.
Subsequentemente, gostaríamos de investigar se o Zn2+ poderia impactar as atividades proteolíticas da PLpro e 3CLpro in cellulo. Estudos anteriores indicaram que a concentração intracelular livre de Zn2+ é mantida na faixa nanomolar a picomolar para evitar citotoxicidade, embora o Zn2+ seja um oligoelemento essencial. Como os valores de K D entre as duas proteases e o Zn2+ estão ambos na faixa micromolar, a elevação da concentração intracelular de Zn2+ é desejada para interferir na atividade das duas proteases in cellulo. Hinokitiol (Hino) é um produto natural de pequena molécula que foi relatado como promotor da captação de íons metálicos divalentes por células de mamíferos. Portanto, testamos a possibilidade de usar Hino como ionóforo para elevar a concentração intracelular de Zn2+. Um indicador fluorescente de Zn2+, 2-[2-[2-[2-[bis(carboxilatometil)amino]-5-metoxifenoxi]etoxi]-4-(2,7-difluoro-3-oxido-6-oxo-4a,9a-di-hidroxanten-9-il)anilino]acetato (FluoZin-3), foi utilizado para examinar a concentração intracelular livre de Zn2+ nas células. Como mostrado na Fig. S10, apenas uma fluorescência verde fraca pôde ser detectada em células COS-7 em repouso, o que estava de acordo com a baixa concentração de Zn2+ livre no citoplasma na maioria das linhagens celulares de mamíferos. Quando tratadas com uma combinação de 125 μM de Hino e 16 μM de Zn2+ a 37 °C por 30 min, o sinal fluorescente aumentou substancialmente, indicativo de elevação da concentração intracelular livre de Zn2+.

O aumento da concentração intracelular de Zn2+ com hinokitiol prejudica as atividades proteolíticas da PLpro e 3CLpro do SARS-CoV-2 in cellulo. (A) Ilustração esquemática dos ensaios proteolíticos in cellulo. As células HEK293 coexpressam a protease (PLpro ou 3CLpro) e a luciferase de vaga-lume (Luc) fusionada à poliubiquitina (UB). Um sítio de clivagem pela protease é inserido entre Luc e UB. A clivagem proteolítica neste sítio liberará a luciferase. Os gráficos de barras mostram a atividade relativa da luciferase em lisados celulares de células HEK293 que expressam PLpro (B) ou 3CLpro (C) após tratamento com 125 μM de Hino e concentrações variadas de gluconato de zinco. Cada experimento foi realizado em triplicata. Os dados são apresentados como média ± dp. ⁎⁎p < 0,01, ⁎⁎⁎p < 0,001, ⁎⁎⁎⁎p < 0,0001.
Fig. 4
Para investigar a atividade proteolítica de PLpro e 3CLpro em células, estabelecemos subsequentemente um sistema de ensaio repórter de luciferase baseado em células (Fig. 4A). Em resumo, o gene repórter da luciferase do vaga-lume (Luc) é fundido com poliubiquitina (UB), o que leva à rápida degradação da luciferase no proteassomo. Um sítio de clivagem de PLpro (ou 3CLpro) é inserido entre Luc e UB. Na presença de PLpro (ou 3CLpro), a clivagem proteolítica nesse sítio liberará a luciferase e a atividade da luciferase poderá ser detectada. Aplicamos o ensaio de luciferase para examinar as atividades proteolíticas de PLpro e 3CLpro do SARS-CoV-2 usando o peptídeo nsp2/3 e nsp4/5 como ligante entre Luc e UB, respectivamente. Conforme mostrado nas Fig. 4B e C, os resultados dos ensaios repórteres de luciferase revelaram que 32 μM de Zn2+ em combinação com 125 μM de Hino poderiam suprimir notavelmente a atividade proteolítica celular de PLpro e 3CLpro do SARS-CoV-2 em 78% e 75%, respectivamente. Em conjunto, os resultados demonstraram que as atividades proteolíticas celulares de PLpro e 3CLpro do SARS-CoV-2 seriam inibidas com o aumento das concentrações intracelulares de Zn2+.
Inibição da replicação do SARS-CoV-2 em células Vero-E6 por Hino-gluconato de zinco. O eixo X representa concentrações de gluconato de zinco variando de 0 a 150 μM, o eixo Y representa concentrações de Hino variando de 0 a 60 μM, e o eixo Z representa a sobrevivência do vírus. N/A indica que poucas células sobreviveram após o tratamento com os fármacos. Cada experimento foi repetido em duplicata.
Fig. 5
Como demonstramos que o aumento da concentração intracelular de Zn2+ foi potente para abolir as atividades de PLpro e 3CLpro in cellulo, imaginamos que essa abordagem também poderia ser aplicada para inibir a replicação do SARS-CoV-2 em células. Portanto, experimentos de infecção viral foram realizados para testar a hipótese. Estudos anteriores demonstraram que o Hino exibia toxicidade relativa em células de mamíferos e a adição de Mg2+ poderia reduzir a citotoxicidade do Hino. Para evitar o efeito citotóxico do Hino, o método de checkerboard foi utilizado para examinar os efeitos de inibição viral de diferentes combinações de Hino e gluconato de zinco na presença de 30 mM de MgCl2. Resumidamente, células Vero-E6 foram infectadas com SARS-CoV-2 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,05 com um tratamento de diferentes concentrações de gluconato de zinco e Hino por 24 h. O núcleo das células Vero-E6 remanescentes foi corado com 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e a nucleocapsídeo viral (proteína N) nas células infectadas foi imunodetectada e quantificada por imunofluorescência verde, conforme descrito nas Informações de Suporte (Fig. S11). Os resultados são mostrados na Fig. 5. Combinações de altas doses de Zn2+ e Hino (60 μM) foram relativamente tóxicas para as células Vero-E6, resultando em sinais de DAPI não detectáveis. No entanto, a toxicidade do Zn2+ foi significativamente atenuada após a redução da concentração de Hino. Especialmente, uma combinação de 30 μM de Hino e 125 μM de gluconato de zinco não exibiu citotoxicidade detectável em células Vero-E6, mas inibiu notavelmente a replicação do SARS-CoV-2 em 80%. Os resultados indicaram claramente que o tratamento com dosagem adequada da mistura de zinco e Hino poderia inibir eficientemente a replicação intracelular do SARS-CoV-2 sem citotoxicidade significativa.
Discussões
Como o segundo elemento mais abundante na célula, o Zn2+ funciona principalmente como cofator de metaloenzimas. A maioria do zinco intracelular está presente na forma ligada a proteínas e é considerada essencial para o enovelamento e a atividade adequados de várias enzimas intracelulares e fatores de transcrição. A concentração intracelular de íons de zinco livre em condições fisiológicas é mantida em um nível relativamente baixo, pois os íons de zinco livres são relativamente tóxicos e podem até mesmo desencadear apoptose em concentrações elevadas. Além disso, o Zn2+ também desempenha um papel crítico na mediação da imunidade inata. A deficiência de zinco pode levar à disfunção do sistema imunológico humano, como diminuição da produção de anticorpos, redução da atividade de células natural killer e prejuízo na proliferação de células T. Estudos recentes também relataram a relação entre deficiência de zinco e infecção por SARS-CoV-2. Em particular, um estudo de coorte observacional muito recente com 249 pacientes com COVID-19 demonstrou que níveis séricos de zinco inferiores a 50 μg/dL se correlacionaram com pior apresentação clínica e maior mortalidade, sugerindo que baixos níveis de zinco favorecem a replicação do SARS-CoV-2 em células infectadas.
Embora dados clínicos acumulados impliquem a associação do status individual de zinco com o risco de infecção e progressão grave da COVID-19, faltam até o momento evidências diretas de pesquisa sobre o impacto do zinco na replicação do SARS-CoV-2. Nossos estudos bioquímicos e estruturais in vitro revelaram que o Zn2+ era um inibidor altamente potente da PLpro e da 3CLpro, as duas proteases essenciais do SARS-CoV-2 in vitro. Além disso, estudos de cultura celular demonstraram que o aumento da captação celular de Zn2+ por ionóforo poderia resultar em disfunção da PLpro e da 3CLpro in cellulo. Mais importante ainda, a importação aumentada de Zn2+ com a combinação adequada de Hino e gluconato de zinco poderia inibir eficientemente a replicação do SARS-CoV-2 em células Vero-E6 sem toxicidade celular significativa. Nossas descobertas fornecem a evidência experimental direta de que células infectadas pelo SARS-CoV-2 poderiam ser resgatadas pelo aumento da concentração intracelular de Zn2+ livre.

De acordo com os valores de K D calculados entre Zn2+ e proteases in vitro, as concentrações intracelulares de Zn2+ livre em nossa condição experimental deveriam atingir o nível micromolar. Isso é significativamente maior do que a concentração intracelular de Zn2+ livre eucariótica relatada no estado de repouso, que está na faixa nanomolar a picomolar. Portanto, o ionóforo Hino é aplicado juntamente com gluconato de zinco para aumentar o nível intracelular de zinco. Os resultados implicaram que as células de mamíferos poderiam tolerar concentrações intracelulares de Zn2+ livre relativamente aumentadas. De fato, foi relatado que as concentrações intracelulares de Zn2+ livre também poderiam aumentar dramaticamente em muitas células em resposta a vários estímulos. Por exemplo, é relatado que a ativação do receptor Fcɛ I na superfície celular poderia induzir diretamente uma liberação de Zn2+ do retículo endoplasmático (RE) para aumentar a concentração intracelular de Zn2+ livre, o que é chamado de onda de zinco. Além disso, o Zn2+ livre também poderia ser liberado no citosol a partir da metalotioneína ligada a Zn2+ em resposta a sinais redox celulares. Também deve ser observado que altas concentrações intracelulares seriam tóxicas para as células de mamíferos, levando à produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) ou até mesmo à apoptose. Nosso estudo aqui fornece a prova de conceito de que o aumento da concentração intracelular de zinco livre poderia ser uma abordagem potencial para tratar a infecção por SARS-CoV-2. Vale a pena notar que um estudo recente também demonstrou que o ionóforo natural quercetina poderia aumentar a potência antiviral do Zn2+. No entanto, como controlar precisamente a concentração intracelular de Zn2+ livre para permitir inibição eficiente da replicação viral, mas citotoxicidade mínima, merece investigação adicional.
Em resumo, demonstramos que o Zn2+ pode inibir as atividades proteolíticas das proteases do SARS-CoV-2, PLpro e 3CLpro in vitro. A estrutura cristalina da forma 3CLpro ligada ao Zn2+ mostrou que o Zn2+ se ligou ao sítio catalítico da 3CLpro e aboliu a atividade proteolítica. O ensaio proteolítico in cellulo e os resultados de infecção viral intracelular indicaram ainda que a concentração elevada de Zn2+ livre intracelular teve impactos significativos na replicação do SARS-CoV-2 em células de mamíferos. Nossas descobertas não apenas fornecem a evidência direta de que o zinco inibe a replicação do SARS-CoV-2 em células de mamíferos, mas também sugerem os potenciais benefícios da suplementação de zinco no tratamento da COVID-19.
Materiais e métodos
Purificação de proteínas
A PLpro e a 3CLpro do SARS-CoV-2 foram expressas e purificadas conforme descrito nas informações de suporte. A pureza da proteína foi de pelo menos 95% determinada por SDS-PAGE.
Ensaios de atividade proteolítica in vitro
Os procedimentos detalhados dos ensaios proteolíticos foram descritos nas informações de suporte. Em resumo, dois substratos peptídicos fluorogênicos Dabcyl-FRLKGGAPIKG(Edans)V e MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 foram usados para medir as atividades proteolíticas da PLpro e da 3CLpro, respectivamente. As concentrações de PLpro e 3CLpro foram 1 μM e 0,5 μM. As taxas de reação inicial e as concentrações de substrato foram ajustadas à curva de Michaelis-Menten usando o software Graphpad para obter os valores de Vmax e Kcat.
Cristalização da proteína 3CLpro do SARS-CoV-2 e determinação da estrutura
Para a cristalização da proteína 3CLpro do SARS-CoV-2, 200 nL de 3CLpro na concentração de 10,81 mg/mL foram misturados com 200 nL de solução reservatório composta por 15% de PEG 20000 e 100 mM de MES, pH 6,5. Os cristais foram obtidos por difusão em gota pendente a 20 °C. Os cristais de 3CLpro ligados ao Zn2+ foram obtidos pela imersão dos cristais de 3CLpro em 2 mM de gluconato de zinco por 17 h. Os cristais de proteína foram subsequentemente transferidos para uma solução crioprotetora contendo a solução reservatório suplementada com 25% de glicerol (v/v) e congelados instantaneamente em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios X foram coletados na linha de luz 08ID-1 da Canadian Macromolecular Crystallography Facility (CMCF). A redução e o escalonamento dos dados cristalográficos foram processados usando XDS e Aimless, respectivamente. As estruturas foram resolvidas por PHASER & Molrep com o programa CCP4 e a estrutura da 3CLpro do SARS-CoV-2 (código PDB 6M2Q) foi usada como modelo de busca. A construção e o refinamento do modelo subsequente foram realizados no CCP4 e Refmac.2. As estatísticas dos dados cristalográficos estão resumidas na Tabela S2.
Ensaio de atividade proteolítica in cellulo
A construção de repórteres de atividade proteolítica de 3CLpro/PLpro in cellulo (UB-CS-Luc) é descrita em outro manuscrito (em preparação). Em resumo, o gene repórter, luciferase do vagalume (Luc), é fundido com poliubiquitina (UB), o que leva à rápida degradação da luciferase no proteassoma. Um sítio de clivagem da protease PLpro/3CL foi inserido entre Luc e UB. A sequência proteica para o sítio de clivagem nsp2/3 foi FTLKGG↓APTKV e para o sítio de clivagem nsp4/5 foi TSAVLQ↓SGFRK. A clivagem neste sítio por PLpro/3CLpro libera a luciferase, cuja atividade pode ser detectada usando ensaio de atividade de luciferase. Células HEK293T foram co-transfectadas com o plasmídeo codificando PLpro (ou 3CLpro), o gene repórter UB-CS-Luc correspondente e o pRL-TK (plasmídeo de expressão de luciferase Renilla) como controle interno. 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem 125 μM de hinokitiol, 30 mM de MgCl2 e várias concentrações de gluconato de zinco (0–32 μM). Após 24 h de tratamento, as células foram coletadas e submetidas a ensaios de repórter de luciferase dupla (Sistema de Ensaio de Luciferase Dual-Glo®) seguindo as instruções do fabricante e as atividades de luciferase foram quantificadas no Leitor Multi-Modo Híbrido Synergy H1 (BIOTEK). Cada experimento foi realizado em triplicata.
Atividade antiviral do gluconato de zinco
Para avaliar a eficácia antiviral do gluconato de zinco, células Vero-E6 foram cultivadas durante a noite em placa de cultura celular de 96 poços com uma densidade de 2 × 10^4 células/poço. As células foram pré-tratadas com as diferentes concentrações do gluconato de zinco indicado (0–150 μM)-hinokitiol (0–60 μM)-MgCl2 (30 mM) por 1 h. O vírus SARS-CoV-2 (MOI de 0.05) foi subsequentemente adicionado para permitir a infecção por 1 h. As misturas vírus-fármaco foram então substituídas por meio fresco que contém apenas gluconato de zinco-hinokitiol-MgCl2. Após 24 h, a placa foi fixada com paraformaldeído a 4% (PFA). A proteína do nucleocapsídeo do SARS-CoV-2 (proteína N) na célula infectada foi detectada com um anticorpo policlonal de coelho contra a proteína N do SARS-CoV-2 seguido por um anticorpo IgG de cabra anti-coelho (Alexa Fluor® 488, ab150077). Os núcleos celulares foram marcados com o corante de ácido nucleico DAPI. As imagens de fluorescência foram adquiridas com um Citômetro de Imagem Celigo.
Disponibilidade de dados
A estrutura da 3CLpro ligada a Zn2+ foi depositada no RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org) com o código PDB 7D64.
Contribuições dos autores
X.T., K.L., W.X. e Z.-W.M. conceberam o projeto e desenharam os experimentos. X.T., K.L., Z.Z., Y.X. e P.-H.W. realizaram a purificação de proteínas e ensaios proteolíticos in vitro. L.D. realizou o experimento de inibição in cellulo. L.Z., X.L. e S.H. realizaram experimentos de inibição viral e análises estatísticas. X.T., L.Z., L.D., J.-A.P., W.X. e Z.-W.M. escreveram e revisaram o artigo. J.-A.P., W.X., J.D. e Z.-W.M. supervisionaram o estudo. Todos os autores revisaram, comentaram e aprovaram a versão final submetida do manuscrito.
Declaração de Interesse Concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Referências
Dados suplementares
Os dados suplementares deste artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2022.111777.