pmid: "35767875"
title: "O proteoma de zinco do SARS-CoV-2."
authors: "Andreini C, Arnesano F, Rosato A"
journal: "Metallomics : integrated biometal science"
pubdate: "2022 Jul 25"
doi: "10.1093/mtomcs/mfac047"
source: "PMC Full Text"

O proteoma de zinco do SARS-CoV-2.

Autores

Andreini C, Arnesano F, Rosato A

Periodico

Metallomics : integrated biometal science (2022 Jul 25)

Conteudo

O proteoma de zinco do SARS-CoV-2
Resumo
O zinco é um elemento essencial para a saúde humana. Entre suas muitas funções, o zinco(II) modula a resposta imune a infecções e, em altas concentrações ou na presença de ionóforos, inibe a replicação de vários vírus de RNA. Estudos de biologia estrutural sobre o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) revelaram que o zinco(II) é o íon metálico mais comum que se liga a proteínas virais. No entanto, o número de sítios de ligação ao zinco(II) identificados por métodos experimentais está longe de ser exaustivo, pois os íons metálicos podem ser perdidos durante os protocolos de purificação de proteínas. Para melhor definir o proteoma de ligação ao zinco(II) do coronavírus, aproveitamos a riqueza de dados estruturais depositados e métodos bioinformáticos de ponta. Por meio dessa abordagem in silico, 15 sítios experimentais de zinco(II) foram identificados e outros 22 foram previstos na proteína Spike, nas fases de leitura aberta (ORF)3a/d, ORF8 e em várias proteínas não estruturais, destacando um papel essencial do zinco(II) na replicação viral. Além disso, as relações estruturais entre sítios virais e eucarióticos (tipicamente dedos de zinco) indicam que o SARS-CoV-2 pode competir com proteínas humanas pela ligação ao zinco(II). Dado o efeito de dois gumes dos íons zinco(II), essenciais e tóxicos para o coronavírus, apenas a elucidação completa dos sítios de ligação ao zinco(II) estruturais e regulatórios pode orientar estratégias antivirais seletivas baseadas na suplementação de zinco.
Resumo Gráfico
Uma grande parcela das proteínas do SARS-CoV-2 contém potenciais sítios de ligação ao zinco(II), alguns com suporte estrutural e outros previstos por análise bioinformática em todo o proteoma, os quais mostram similaridade com sítios de dedos de zinco eucarióticos. Questões em aberto e implicações para o tratamento da COVID-19 são apresentadas.
Introdução
Um dos aspectos mais intrigantes e menos debatidos da infecção é a maturação das proteínas virais por meio de modificações pós-traducionais. Nesse sentido, um processo de maturação essencial é o carregamento de íons metálicos, que devem ser fornecidos pelo hospedeiro. Por essa razão, o hospedeiro desenvolveu um mecanismo protetor, conhecido como imunidade nutricional, que inibe o crescimento de patógenos ao limitar a captação de íons metálicos específicos que são nutrientes cruciais.
Ferro e zinco desempenham muitas funções fisiológicas em quase todos os organismos vivos e também são necessários para o crescimento viral. As concentrações circulantes desses minerais diminuem rápida e drasticamente com a inflamação associada à infecção. Acredita-se que a diminuição do ferro e do zinco prive os patógenos invasores desses elementos essenciais, limitando a progressão e a gravidade da doença. Portanto, não é surpreendente que quantidades massivas de calprotectina (S100A8/S100A9), uma proteína sequestrante de zinco(II), tenham sido encontradas no plasma de pacientes que desenvolvem COVID-19 grave. A calprotectina é regulada positivamente em condições de limitação de zinco e funciona ligando-se a dois íons de zinco(II), quelando e privando os micróbios desse mineral essencial. Assim, impedir a maturação das proteínas virais de ligação ao zinco(II) parece uma estratégia terapêutica viável contra a COVID-19. Nesse contexto, o uso de ionóforos seletivos de zinco(II) tem sido explorado. Outra estratégia proposta é alvejar os dedos de zinco nas metaloenzimas virais; alguns compostos que substituem o zinco(II) por outro íon metálico entraram em ensaios clínicos. Os íons de bismuto(III) competem de forma marcante com os íons de zinco(II) da helicase viral (proteína não estrutural; Nsp13), levando à atividade enzimática comprometida e a graves deficiências na replicação viral do coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV) e do SARS-CoV-2.
Do outro lado da moeda, quando sua concentração atinge níveis tóxicos, os íons metálicos podem inibir a função proteica. Estudos in vitro demonstraram vários mecanismos pelos quais o zinco interfere no ciclo de replicação viral, como a inibição do desnudamento viral, da transcrição do genoma viral, da tradução de proteínas virais e do processamento da poliproteína. No caso dos coronavírus, sabe-se que o zinco(II) pode inibir proteínas essenciais, como a RNA-polimerase dependente de RNA (RdRp, Nsp12), a protease principal semelhante à quimotripsina (3CLpro ou Mpro, Nsp5) e a protease semelhante à papaína (PLpro, Nsp3). Essas três enzimas desempenham um papel fundamental na replicação viral e são conservadas no SARS-CoV e no SARS-CoV-2. No entanto, não está claro se é possível atingir in vivo os níveis de concentração de zinco(II) usados em experimentos in vitro sem afetar negativamente o hospedeiro.
Com base nas evidências mencionadas anteriormente e na resposta imunomoduladora mediada por zinco(II) estabelecida, foi levantada a hipótese de que a suplementação de zinco pode ser benéfica para a profilaxia e o tratamento da COVID-19. O impacto potencial da suplementação de zinco na patogênese da COVID-19 também foi avaliado. No entanto, as Diretrizes de Tratamento da COVID-19 do NIH desencorajam a suplementação de zinco acima da ingestão dietética recomendada (11 mg diários para homens e 8 mg para mulheres não grávidas; https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/therapies/supplements/zinc/), exceto em ensaios clínicos (com uma dose máxima de 50 mg de zinco elementar duas vezes ao dia; https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=COVID-19&term=zinc+supplement).
As considerações mencionadas anteriormente sobre o efeito duplo dos íons de zinco apontam que os mecanismos moleculares da homeostase do zinco(II) na interface hospedeiro-patógeno devem ser profundamente compreendidos para conceber estratégias antivirais adequadas e seletivas. Neste trabalho, aproveitamos a riqueza de dados estruturais depositados e métodos bioinformáticos de ponta para prever quais proteínas do SARS-CoV-2 precisam de íons de zinco para desempenhar sua função. Em outras palavras, definimos, por uma abordagem in silico, o proteoma de zinco(II) do SARS-CoV-2. Além disso, analisamos as relações estruturais entre os sítios de ligação a zinco(II) virais e eucarióticos.
Materiais e métodos
Como primeiro passo, criamos duas bibliotecas aplicando a abordagem desenvolvida em Valasatava et al. A primeira biblioteca continha perfis de modelo oculto de Markov (HMM) de domínios de ligação a zinco(II) (biblioteca Pfam), enquanto a segunda continha perfis HMM de motivos estruturais de ligação a zinco(II) (biblioteca de motivos). Conforme descrito em Andreini et al., a biblioteca de domínios Pfam foi construída pela fusão de duas listas: (i) uma lista de domínios Pfam anotados como ligação a zinco(II), recuperada pela mineração do texto das anotações no banco de dados Pfam e (ii) uma lista de padrões de ligação a zinco(II) derivados da análise da sequência de proteínas de ligação a zinco(II) com estrutura tridimensional conhecida disponível no MetalPDB, onde cada perfil HMM está associado às posições dos resíduos de proteína responsáveis pela ligação ao zinco(II). O procedimento resultou em um conjunto de 573 perfis Pfam: 541 com um padrão de ligação a zinco(II) associado e 32 adicionais simplesmente anotados como domínios de ligação a zinco(II).
A biblioteca de motivos estruturais de ligação a zinco(II) foi criada dividindo em fragmentos os sítios de ligação a zinco(II) armazenados no MetalPDB em maio de 2020. Apenas um representante foi mantido para sítios que, embora encontrados em diferentes estruturas do Protein Data Bank (PDB), caem na mesma posição dentro do mesmo domínio proteico. Apenas motivos contendo pelo menos um resíduo de ligação a zinco(II) foram mantidos. Além disso, removemos manualmente os sítios de ligação a zinco(II) que não são fisiologicamente relevantes [por exemplo, sítios espúrios ou estruturas substituídas por zinco(II)] por meio da inspeção da literatura, da seguinte forma: se o(s) artigo(s) relevante(s) não descrevia(m) a função do íon de zinco(II) e a seção experimental relatava que ele estava presente no tampão de purificação ou cristalização, então anotávamos o sítio como espúrio. Descartamos ainda todos os sítios sem átomos doadores da proteína. Este procedimento resultou em uma biblioteca de 3298 motivos de ligação a zinco(II) derivados de 2499 sítios de ligação a zinco(II).
O proteoma de zinco(II) do SARS-CoV-2 foi obtido aplicando a ferramenta hmmscan (http://hmmer.org/) para pesquisar cada sequência de proteína pelos perfis contidos nas duas bibliotecas. A ocorrência de um potencial sítio de ligação a zinco(II) foi identificada se pelo menos uma das seguintes condições foi verificada: (i) os perfis de todos os fragmentos de um determinado sítio corresponderam à sequência viral com um valor e menor que 10−3 e os resíduos de ligação a zinco(II) correspondentes (ou seja, resíduos de proteína que fornecem átomos doadores) são conservados na sequência; (ii) o perfil de um domínio com um padrão de ligação a zinco(II) associado correspondeu à sequência com um valor e menor que 10−5 e o padrão é conservado na sequência; e (iii) o perfil de um domínio sem padrão associado correspondeu à sequência com um valor e menor que 10−7. Este procedimento (e em particular os limiares de valor e selecionados) foi otimizado em Valasatava et al. Essas previsões foram integradas adicionando os sítios de zinco determinados experimentalmente no PDB e com sítios que foram anotados como ligação a zinco(II) no banco de dados UniProt. Uma análise semelhante foi realizada nos proteomas do SARS-CoV e do coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV).

Para modelagem de estrutura, baixamos os modelos estruturais 3D gerados pelo AlphaFold do banco de dados correspondente no EBI. Para cada proteína viral, os resíduos de ligação a metal previstos pela nossa abordagem foram identificados no modelo baixado e um íon de zinco(II) foi colocado no centro geométrico dos átomos doadores.

Inserimos cada sítio de zinco com uma estrutura 3D disponível ou modelo estrutural no programa MetalS3 para identificar sítios de zinco(II) com uma estrutura local semelhante em todo o banco de dados MetalPDB, usando parâmetros padrão.

Resultados e discussão

Identificação dos sítios de zinco nas proteínas do SARS-CoV-2

Os dois terços iniciais do genoma do SARS-CoV-2 codificam as duas poliproteínas sobrepostas referidas como replicase 1a e 1ab (com 4405 e 7096 aminoácidos de comprimento, respectivamente), que são subsequentemente processadas nas Nsps. Os 10 kb restantes do genoma viral codificam as outras proteínas estruturais, nomeadamente as proteínas Spike (S), Envelope (E), Membrana (M) e Nucleocapsídeo (N), bem como várias proteínas acessórias (quadros de leitura abertos; ORFs). Procuramos por proteínas de ligação a zinco(II) no proteoma do SARS-CoV-2 inspecionando as estruturas 3D experimentais disponíveis e aplicando um pipeline de bioinformática previamente desenvolvido para a previsão do proteoma de zinco(II) baseado apenas na sequência de proteínas. O valor preditivo positivo, também chamado de precisão, deste método está entre 85% e 89%.
Os resultados estão resumidos na Tabela 1, mostrando que cerca de 40% das proteínas virais são potencialmente ligantes de zinco(II). Nesta primeira análise, não separamos a replicase 1a e a replicase 1b nas várias Nsps, pois isso nos permitiu identificar sítios potenciais que fazem a ponte entre diferentes Nsps, ou seja, envolvem átomos doadores de resíduos proteicos de duas Nsps distintas. Na Tabela 1, separamos os sítios de ligação a zinco(II) caracterizados experimentalmente (ou seja, sítios observados em estruturas 3D experimentais, Tabela Suplementar S1) daqueles que são apenas previstos (Tabelas Suplementares S2–S4); como resultado, identificamos 37 sítios de ligação a zinco(II), que foram comparados aos de sequências intimamente relacionadas do SARS-CoV e MERS-CoV por alinhamento múltiplo. A maioria dos resíduos previstos de ligação a zinco(II) são conservados em todos os três proteomas virais, ou pelo menos no SARS-CoV e SARS-CoV-2 (Tabelas Suplementares S1–S4).
Proteínas do SARS-CoV-2 contendo sítios de ligação a zinco(II) caracterizados estruturalmente (experimentais) ou previstos
Proteína de zinco(II) Id Uniprot Sítios experimentais Sítios previstos Polipeptídeo replicase 1a P0DTC1 7 9 Polipeptídeo replicase 1ba P0DTD1 8 5 Glicoproteína Spike P0DTC2 0 4 Proteína ORF3a P0DTC3 0 2 ORF3d P0DTG0 0 1 Proteína ORF8 P0DTC8 0 1 Total 15 22

a
Os valores nesta linha levam em conta apenas a porção codificada por ORF1b.
Uma análise detalhada da distribuição dos sítios de ligação de zinco(II) sobre as Nsps individuais, bem como para as ORFs virais, é fornecida na Tabela 2. Em particular, separamos os sítios preditos em três grupos: (i) aqueles nos quais foi possível verificar a proximidade espacial dos resíduos que formam os sítios preditos (a partir de predições do AlphaFold ou da análise das estruturas de proteínas virais similares, Tabela Suplementar S2); (ii) aqueles que não possuem esse tipo de suporte (Tabela Suplementar S3); e (iii) os sítios de ponte (Tabela Suplementar S4), que também carecem de suporte estrutural. Embora a presença de sítios de zinco(II) preditos em estruturas experimentais valide essa abordagem bioinformática, sua ausência pode ser atribuída a vários fatores; por exemplo, o íon zinco(II) pode ser perdido durante a purificação ou nunca ser incorporado à proteína alvo. A afinidade pelo zinco(II) varia significativamente entre diferentes classes de proteínas. Enzimas de zinco(II) e domínios estruturais de zinco(II) que apresentam alta afinidade por zinco(II) são frequentemente associados a uma taxa de dissociação lenta, retendo assim um íon zinco(II) ligado durante a purificação. Outras proteínas, cuja função depende da disponibilidade local de zinco(II), podem ser ativadas ou inibidas apenas transitoriamente. Além disso, sítios de baixa afinidade podem ser funcionalmente relevantes, pois respondem a mudanças dinâmicas na concentração de zinco(II) e proteínas em um compartimento celular específico e são sensíveis a condições fisiológicas ou estados de doença. Isso é particularmente relevante para o nicho de replicação viral, onde transportadores hospedeiros e fatores acessórios podem ser recrutados. Das 16 Nsps do SARS-CoV-2, 10 ligam pelo menos um íon zinco(II) (correspondendo a cerca de 65% das Nsps que compõem as poliproteínas replicase). Esse resultado indica que os sítios de ligação de zinco(II) têm um papel na replicação viral; como descrito posteriormente neste artigo, esses sítios possuem alta similaridade estrutural com sítios de dedos de zinco de proteínas humanas que interagem com DNA/RNA. Vários sítios são intermoleculares, ou seja, fazem ponte entre diferentes Nsps. Sítios de ponte podem ter um papel na modulação da estrutura das poliproteínas replicase antes de sua clivagem, modulando interações domínio-domínio, ou na formação de complexos proteicos. Nesse aspecto, o papel do zinco(II) em induzir interações proteína-proteína tem recebido considerável atenção e está agora bem estabelecido. No banco de dados InterMetalDB, o zinco(II) é o segundo íon metálico interfacial mais comum, logo atrás do cálcio(II). Curiosamente, a predição e validação experimental de interações proteína-proteína (sejam intermoleculares ou entre domínios) impulsionadas por zinco(II) ainda é considerada uma questão em aberto na química bioinorgânica.
Distribuição dos sítios de ligação de zinco(II) para todas as proteínas não estruturais (Nsps), a proteína Spike e as fases de leitura abertas (ORFs) de ligação de zinco(II) do SARS-CoV-2a
Sítios previstos Proteína Comprimento Sítios experimentais Com suporte de modelagem Outros Sítios de ponte Máx 1 Nsp1 180 0 0 0 0 0 2 Nsp2 638 3 0 0 0.5 3.5 3 Nsp3 (Protease semelhante à papaína) 1945 1 3 2 0.5 6.5 4 Nsp4 500 0 0 0 0.5 0.5 5 Nsp5 (Protease principal) 306 1 1 0 0.5 2.5 6 Nsp6 290 0 0 0 0 0 7 Nsp7 (RNA polimerase) 83 0 0 0 0 0 8 Nsp8 (Primase) 198 0 0 0 0 0 9 Nsp9 (Proteína de ligação ao RNA) 198 0 0 0 0 0 10 Nsp10 139 2 0 1 0 3 11 Nsp11 13 0 Não calculado 12 Nsp12 (RNA polimerase) 932 2 0 1 3 13 Nsp13 (Helicase) 932 3 0 1 0.5 4.5 14 Nsp14 (Exorribonuclease) 527 3 0 2 0.5 5.5 15 Nsp15 (Endorribonuclease) 346 0 0 0 0 0 16 Nsp16 (Metiltransferase) 298 0 0 0 0 0 17 Glicoproteína Spike 1273 0 0 4 0 4 18 Proteína ORF3a 274 0 1 1 0 2 19 ORF3d 154 0 0 1 0 1 20 Proteína ORF8 121 0 0 1 0 1 Total 15 5 14 3 37

aA coluna Máx relata a soma de todos os sítios experimentais e previstos, ou seja, o número máximo possível de sítios para cada proteína. Sítios previstos para fazer ponte entre duas Nsps diferentes foram atribuídos como igualmente divididos entre as duas (ou seja, 0,5 cada).
A proteína com o maior número de sítios potenciais é a Nsp3 (seis sítios, mais um sítio de ponte), seguida pela Nsp13 (quatro, mais um sítio de ponte), e depois pela proteína Spike (quatro sítios). Todos os aminoácidos que formam os sítios de ligação de zinco(II) na Nsp3 são conservados em coronavírus. A Figura 1 mostra os sítios de ligação de zinco(II) na Nsp3 que têm suporte estrutural. Um sítio caracterizado experimentalmente está presente no domínio PLP2, enquanto os outros três sítios putativos estão localizados, um no domínio Mac1 (ADP-ribose-fosfatase) e dois no domínio Y1. O sítio de ligação de zinco(II) caracterizado experimentalmente da Nsp3 desempenha um papel estrutural para o domínio catalítico PLP2. Este último papel está de acordo com o ambiente de coordenação do íon zinco(II), que é formado por quatro cisteínas, como comumente observado em sítios estruturais de zinco(II). O sítio de ligação é estritamente conservado em sequências de coronavírus e é essencial para a atividade. Notavelmente, na presença de inibidores, o PLP2 liga vários íons de zinco(II) adicionais, incluindo um que é coordenado pelos resíduos do sítio ativo Cys111 e His272. Parece improvável que estes sítios sejam povoados pelo metal durante o ciclo normal de replicação do vírus. A atividade enzimática do domínio Mac1 permite que o vírus neutralize a ação das proteínas poli(ADP-ribose) polimerase (PARP). A ADP-ribosilação é considerada um mecanismo crucial para a regulação da resposta antiviral da célula. O papel antiviral das proteínas PARP humanas está ligado tanto ao seu envolvimento na cascata de sinalização da resposta ao interferon quanto à sua capacidade de interagir/modificar RNA e proteínas virais para suprimir a replicação. Neste contexto, é bastante interessante que o efeito antiviral da PARP7 e da PARP13 não esteja ligado à sua atividade catalítica, mas sim à interação de seus domínios de dedo de zinco com o RNA viral. O domínio Y1 não é caracterizado estrutural e funcionalmente. O domínio 3Ecto da Nsp3 foi inicialmente proposto para abrigar um ou mais sítios de ligação a metais, devido à presença de um aglomerado de resíduos de His e Cys. No entanto, devido à baixa conservação do aglomerado em diferentes vírus, esta ideia foi subsequentemente abandonada e, de fato, nossa abordagem não identificou quaisquer sítios no domínio 3Ecto.
Os sítios de ligação de zinco(II) da Nsp3. Topo: sítio experimental (ID PDB 6WRH); meio e base: sítios de zinco(II) previstos. Em todos os painéis, o íon zinco(II) está em roxo, os átomos doadores da proteína estão em ciano, e os ligantes de zinco(II) estão em azul.
Nossa abordagem também destacou a presença de 10 cisteínas potenciais de ligação ao zinco(II) na região citoplasmática C-terminal da proteína Spike. Essas cisteínas, que são altamente conservadas em coronavírus (Fig. 2), apresentam uma distribuição ao longo da sequência semelhante à observada em metalotioneínas sequestradoras de metais. Elas poderiam, portanto, ligar um aglomerado de três ou quatro íons zinco(II). Como a proteína Spike forma um trímero, um total de 9–12 íons zinco(II) poderiam estar ligados a cada complexo. A cauda citoplasmática da proteína Spike do SARS-CoV-2 facilita a entrega da proteína à superfície celular e a formação de sincícios. Isso permite que o vírus se espalhe para células vizinhas, evitando a exposição ao sistema imunológico. Sabe-se que algumas das cisteínas na metade proximal à membrana da Spike são palmitoiladas no SARS-CoV e em outros coronavírus e, uma vez modificadas, provavelmente estão embutidas na superfície da bicamada, facilitando assim a fusão celular. Proteínas da família palmitoil aciltransferase contêm um domínio zinc finger Asp–His–His–Cys cuja inibição reduz a palmitoilação da Spike. Curiosamente, uma família diversa de vírus RNA envelopados, os arenavírus, possuem um domínio citoplasmático na subunidade de fusão do complexo glicoproteico com dois aglomerados distintos de resíduos de Cys e His dispostos para coordenar dois íons zinco(II), que estão envolvidos no mecanismo de fusão de membrana e entrada do vírus nas células hospedeiras.

Skylign do alinhamento múltiplo de sequências da sequência C-terminal rica em Cys das proteínas Spike de coronavírus. O Skylign destaca a presença, em cada posição do alinhamento, de aminoácidos que ocorrem com mais frequência do que em uma distribuição aleatória. Quanto mais alta a letra, mais frequente é a ocorrência do aminoácido correspondente em cada posição.

A estrutura experimental de criomicroscopia eletrônica do ORF3a não contém íons metálicos. O sítio metálico que previmos está localizado dentro de uma região descrita como uma região rica em cisteínas, com a adição da His204 próxima (Fig. 3). Essa região é adjacente aos túneis que conectam a parte central da estrutura ao citosol. Embora as distâncias entre as cisteínas sejam grandes demais para permitir a formação de pontes dissulfeto na ausência de rearranjos estruturais significativos, uma reorientação em escala relativamente pequena das cadeias laterais produziria um sítio de ligação ao zinco(II) adequadamente formado. Assim, é possível que esse sítio previsto tenha de fato um papel fisiológico, como regular a atividade da Orf3a, que é um suposto canal iônico (uma viroporina), de maneira dependente da concentração.

O sítio de ligação ao zinco(II) previsto do ORF3a. O código de cores é como na Fig. 1.
Em relação à ORF8, a possibilidade de ela se ligar ao zinco(II) foi mencionada em trabalhos anteriores, juntamente com a ORF7. Esta última interação recebeu recentemente algum suporte experimental, enquanto nenhum experimento pôde ser realizado para a ORF8 devido à disponibilidade insuficiente de amostra. Nossas previsões não identificaram um potencial sítio de ligação de zinco(II) na sequência da ORF7.
Busca por similaridades na estrutura local dos sítios de ligação de zinco(II) do SARS-CoV-2 com outros sítios de ligação de zinco(II) no PDB
Investigamos se os sítios de ligação de zinco(II) das proteínas do SARS-CoV-2 apresentam alguma semelhança estrutural com os sítios de ligação de zinco(II) de outras proteínas. Para isso, comparamos as estruturas locais ao redor dos sítios metálicos, tanto experimentais quanto baseadas em modelos computacionais, com o conteúdo do banco de dados MetalPDB de sítios macromoleculares de ligação a metais, utilizando a ferramenta de busca MetalS3. Esta ferramenta compara apenas o ambiente estrutural ao redor do íon metálico, independentemente do enovelamento completo da proteína, permitindo a detecção de similaridades distantes mesmo entre diferentes famílias proteicas e, portanto, revelando potenciais similaridades funcionais, bem como possíveis sítios concorrentes. Todos os sítios estruturalmente semelhantes recuperados por nossa busca (Tabela 3) continham zinco(II). Na grande maioria dos casos, o resultado de maior pontuação foi uma proteína humana (para cinco sítios virais) ou outra proteína eucariótica (para quatro sítios virais). Duas proteínas eucarióticas distintas mostraram similaridade com o sítio estrutural do domínio PLP2 da Nsp3. Assim, oito sítios distintos de ligação de zinco(II) virais apresentam semelhança com sítios eucarióticos. Notavelmente, esta busca incluiu os sítios virais atualmente previstos com suporte estrutural, pois pudemos construir modelos da estrutura ocupada por zinco(II). Em particular, um dos sítios previstos no domínio Y1 da Nsp3 apresenta semelhança significativa com o sítio de zinco(II) da proteína de ligação ao intensificador CCAAT (C/EBP) epsilon, uma proteína nuclear humana que se liga ao DNA. Outra similaridade intrigante foi detectada entre um dos três sítios da Nsp2 e o único sítio de ligação de zinco(II) da proteína mitocondrial de importação de levedura ZIM17 (PDB ID 2E2Z). O dedo de zinco da Zim17 é importante para a translocação de proteínas para a matriz, ligando-se a proteínas desenoveladas em cooperação com a mtHsp70. O homólogo humano da Zim17 é a Hep1 (também chamada DNLZ), cuja função provável é atuar como co-chaperona da mortaline (ou seja, mtHsp70 de mamíferos). A estrutura da Hep1 é de fato estabilizada pelo zinco(II). Sabe-se que a Nsp2 do SARS-CoV interage com as prohibitinas 1 e 2 (PHB1 e PHB2, respectivamente), que estão envolvidas na manutenção da integridade mitocondrial. Esses dados em conjunto sugerem que a Nsp2 pode desempenhar múltiplos papéis no comprometimento da função mitocondrial causado pelo SARS-CoV-2, interferindo tanto na importação de proteínas mitocondriais quanto nos mecanismos de estabilização mitocondrial.
Similaridade estrutural entre sítios de ligação de zinco(II) do SARS-CoV-2 e de outros organismosa
Proteína viral Resíduos de ligação ao zinco(II) na proteína viral (números referem-se ao Uniprot P0DTD1) Sítio estruturalmente similar no MetalPDB Organismo do sítio no MetalPDB Proteína que abriga o sítio no MetalPDB (ID Uniprot) Superposição estrutural
Nsp2 C323, C326, C341, C344 2e2z_1 Saccharomyces cerevisiaeb Proteína de importação mitocondrial ZIM17 (P42844)
Nsp3 C1752, C1755, C1787, C1789 (PLpro) 5vjj_6 Melampsora lini Proteína de avirulência AvrP123 (B2ZCS6)
Nsp3 C1752, C1755, C1787, C1789 (PLpro) 2jr7_1 Homo sapiens Homólogo DPH3 (Q96FX2)
Nsp3 H2399, C2404, C2409, C2412 3t92_3 Homo sapiens Proteína epsilon de ligação a CCAAT/amplificador (Q15744)
Nsp10 C4327, C4330, C4336, C4343 3mhs_2 Saccharomyces cerevisiaeb Ubiquitina carboxi-terminal hidrolase 8 (P50102)
Nsp10 C4370, C4373, C4381, C4383 2ctu_1 Homo sapiens Proteína do dedo de zinco 483 (Q8TF39)
Nsp13 C5329, H5332, C5350, C5353 5e6c_2 Homo sapiens Receptor de glicocorticoide (P04150)
Nsp13 C5340, C5343, H5357, H5363 2xzl_4 Saccharomyces cerevisiaeb Helicase dependente de ATP NAM7 (P30771)
Nsp13 C5374, C5379, C5396, H5399 5dah_3 Homo sapiens Proteína AF-10 (P55197)
Nsp14 C6132, C6135, C6151, H6154 2naa_2 Mus musculusb Histona-lisina N-metiltransferase, específica para H3 lisina-36 (O88491)
Nsp14 H6182, C6186, H6189, C6204 5bqk_3 Herpesvírus humano 1 Fator de exportação de mRNA (P10238)

aApenas os hits significativos recuperados pelo MetalS3 no banco de dados MetalPDB são mostrados. A comparação estrutural está limitada ao sítio metálico e não envolve o dobramento geral da proteína.

bExiste um homólogo humano com sítio conservado, mas sem estrutura 3D experimental.
Observamos que a maioria dos sítios eucarióticos estruturalmente semelhantes são dedos de zinco, vários dos quais já haviam sido detectados nas estruturas proteicas do SARS-CoV-2. Em vez disso, os dedos de zinco são bastante incomuns em patógenos bacterianos. Na ausência de dados experimentais sobre as constantes de ligação do zinco(II) em proteínas virais, algumas indicações podem ser derivadas do conhecimento dos dedos de zinco eucarióticos clássicos e não clássicos. A afinidade dos dedos de zinco varia em quase sete ordens de grandeza (108–1015) em pH 7 e é altamente dependente de mudanças sutis na sequência proteica e em interações de segunda esfera (rede de ligações de H, empacotamento de resíduos hidrofóbicos, etc.). Apesar dessa alta diversidade na afinidade por zinco(II), que também pode se refletir nos sítios virais de ligação ao zinco(II), ainda é possível traçar algumas semelhanças entre as proteínas de dedo de zinco do hospedeiro e as virais. Enquanto alguns sítios catalíticos e estruturais podem ligar íons zinco(II) de forma estável, outros podem ser ocupados apenas transitoriamente, dependendo dos níveis de concentração de zinco livre, que por sua vez dependem das condições celulares e da localização subcelular. Proteínas reguladas por zinco(II) geralmente exibem menor afinidade por zinco(II), facilitando a ligação reversível. Por outro lado, proteínas de zinco(II) termodinamicamente estáveis podem se tornar cineticamente lábeis em um ambiente competitivo e transferir diretamente o íon metálico via formação de complexo ternário intermediário, em vez de um mecanismo de associação-dissociação. Os dedos de zinco lábeis de PLpro (Nsp3), Nsp10 e Nsp13 são alvo e são desestruturados por diversos ejetores de zinco(II), como o quelante metálico dissulfiram e o fármaco organosselênio ebselen. A similaridade significativa observada aqui sugere que as proteínas de ligação ao zinco(II) do vírus e da célula hospedeira podem competir efetivamente pelo pool intracelular de zinco(II) durante a replicação viral (ver também próxima seção) e/ou que a virulência das infecções por coronavírus também está ligada à capacidade das proteínas virais de interferir nos processos de reconhecimento das células hospedeiras. Embora numerosos aspectos do transporte e tráfego de zinco(II) tenham sido bem caracterizados, os mecanismos de alocação de íons zinco(II) dentro de proteínas individuais permanecem amplamente inexplorados. A descoberta recente da primeira metalochaperona de zinco(II), ZNG1, indica que um motivo de dedo de zinco Cys6His2 entrelaçado na enzima alvo, coordenando dois íons zinco(II) com alta afinidade (pM), fornece a interface de ligação para a metalochaperona. Esta última então utiliza a hidrólise de Guanina-5'-trifosfato (GTP) para entregar um íon zinco(II) a um sítio catalítico na enzima alvo com afinidade mais baixa (nM). Um padrão entrelaçado de dois íons zinco(II) está presente em pelo menos uma proteína do SARS-CoV-2, a helicase Nsp13, e pode-se especular que o recrutamento de uma metalochaperona do hospedeiro pode restaurar a atividade enzimática em condições de baixo zinco(II) celular.
Quantificação da necessidade de zinco(II) para o SARS-CoV-2
Os dados da Tabela 2 permitem uma estimativa aproximada do número de íons de zinco(II) necessários durante a replicação viral para a maturação correta de todas as suas proteínas. Essa estimativa baseia-se no número máximo de sítios e na contagem dos vírions presentes no hospedeiro humano infectado. Esta última varia entre 10^9 e 10^11. Claramente, nem todas as proteínas, particularmente as Nsps, estarão presentes no vírion em um dado momento, e o número de unidades infecciosas é cerca de quatro ordens de grandeza menor. Da mesma forma, nem todas as proteínas serão produzidas na mesma extensão, sendo a proteína do nucleocapsídeo, que não se liga a íons de zinco(II), de longe a mais abundante. Na prática, multiplicando o número máximo de sítios de zinco(II) pela maior estimativa do número de vírions, obtemos um limite superior para a quantidade total de zinco(II) que pode ser necessária do hospedeiro pelo SARS-CoV-2, que é da ordem de 10^(–9) g. Essa quantidade é extremamente pequena em relação ao teor total de zinco(II) no corpo humano, que é de aproximadamente 1–2 g. Embora não haja essencialmente íons de zinco(II) livres disponíveis na célula, nossa análise indica que os sítios virais de ligação ao zinco(II) devem ser capazes de competir com as proteínas do hospedeiro para obter seu cofator metálico. Notavelmente, o chamado pool de zinco(II) lábil [isto é, a fração de íons de zinco(II) que pode ser prontamente removida de seus complexos intracelulares] não está uniformemente distribuído em todos os tecidos e é, na verdade, mais abundante em células epiteliais.
Conclusões
Nossos dados, juntamente com dados estruturais publicados anteriormente, mostram que as proteínas do SARS-CoV-2 contêm vários sítios de ligação ao zinco(II). A maioria desses sítios está localizada dentro das Nsps, portanto é durante a replicação viral que eles estão presentes na célula hospedeira e precisam ser populados. Devido à sua similaridade estrutural, parece provável que sítios virais e eucarióticos (tipicamente dedos de zinco) tenham uma faixa comparável de afinidades por íons de zinco(II). Portanto, as proteínas virais devem ser capazes de competir com sucesso com as proteínas humanas de zinco(II) por íons no pool de zinco lábil. A quantidade total de zinco(II) necessária nas células infectadas também é compatível com a disponibilidade do metal não sendo um fator limitante. Ao observar toda a sequência das poliproteínas do SARS-CoV-2, observamos que vários sítios preditos formam pontes (isto é, envolvem ligantes proteicos de) diferentes Nsps. Embora não seja possível construir modelos estruturais 3D de tais sítios, essa descoberta sugere a ideia intrigante de que os íons de zinco(II) podem contribuir para ajustar as características estruturais das poliproteínas, o que pode, em última análise, afetar o processo de replicação viral.
Material Suplementar
Agradecimentos
Os autores agradecem às Universidades de Bari e Florença, ao Consorzio Interuniversitario di Ricerca in Chimica dei Metalli nei Sistemi Biologici (CIRCMSB) e ao Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche di Metallo Proteine (CIRMMP) pelo apoio.
Contribuições dos autores
C.A.: delineamento da pesquisa; aplicação de métodos de bioinformática; análise dos dados; preparação de tabelas; redação do manuscrito. F.A.: delineamento da pesquisa/concepção do trabalho; análise e interpretação dos dados; redação do manuscrito. A.R.: análise e interpretação dos dados; preparação de figuras; escrita do manuscrito.

Financiamento
F.A. agradece o apoio financeiro do Ministero dell'Università e della Ricerca italiano (Projeto “ICHEMFLY” PRIN 2017WBZFHL).

Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos ou interesses concorrentes.

Disponibilidade de dados
Os dados subjacentes a este artigo estão disponíveis no artigo e em seu material suplementar online.

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