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pmid: "41315933"
title: "CUEDC1 promove a reprogramação do metabolismo glicolítico através do eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K para promover o crescimento do câncer de mama ER-positivo."
authors: "Lu Z, Lei M, Chen J, Deng A, Chang C, Chen J, Meng D, Wang R, Wan X, Tu G, Liu M, Tang L"
journal: "Cellular & molecular biology letters"
pubdate: "2025 Nov 28"
doi: "10.1186/s11658-025-00819-2"
source: "PMC Full Text"

CUEDC1 promove a reprogramação do metabolismo glicolítico através do eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K para promover o crescimento do câncer de mama ER-positivo.

Autores

Lu Z, Lei M, Chen J, Deng A, Chang C, Chen J, Meng D, Wang R, Wan X, Tu G, Liu M, Tang L

Periodico

Cellular & molecular biology letters (2025 Nov 28)

Conteudo

CUEDC1 promove a reprogramação do metabolismo glicolítico através do eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K para promover o crescimento do câncer de mama ER-positivo

Introdução
A reprogramação do metabolismo energético, particularmente da glicólise, sustenta a malignidade dos tumores. A relação entre a proteína 1 contendo domínio CUE (CUEDC1) e a glicólise, juntamente com sua influência no desenvolvimento do câncer de mama positivo para receptor de estrogênio (ER+ BRCA), não está bem definida. Esta investigação explora o envolvimento funcional da CUEDC1 na regulação da glicólise e revela uma via anteriormente não identificada que contribui para a progressão do ER+ BRCA.

Métodos
Imuno-histoquímica, western blotting e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foram utilizados para detectar a expressão de CUEDC1 em tecidos e linhagens celulares de ER+ BRCA. Uma série de análises moleculares, incluindo ensaios de repórter da luciferase dupla, RNA-seq e imunoprecipitação da cromatina (ChIP), foram realizadas para elucidar os mecanismos potenciais subjacentes ao envolvimento da CUEDC1 na progressão do ER+ BRCA. Ensaios metabólicos focados na glicólise foram empregados para investigar os papéis funcionais da CUEDC1 e da subunidade auxiliar gama 4 do canal de cálcio dependente de voltagem (CACNG4). O banco de dados Connectivity Map (CMap) foi utilizado para rastrear inibidores da CUEDC1.

Resultados
A CUEDC1 está aberrantemente superexpressa em tecidos e células de ER+ BRCA. O aumento da CUEDC1 pode promover maior crescimento tumoral e levar a desfechos clínicos ruins em pacientes com ER+ BRCA. A proteína de dedo de zinco associada ao MYC (MAZ) pode regular positivamente a transcrição do gene CUEDC1 em células de ER+ BRCA ao se ligar diretamente ao seu promotor. Determinamos que a CUEDC1 modulou diretamente a CACNG4 para potencializar a ativação da via da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/proteína quinase B (AKT), facilitando assim o crescimento tumoral do ER+ BRCA. Observações clínicas também revelaram uma correlação positiva entre a expressão de CACNG4 e CUEDC1, com ambos os fatores estando fortemente associados a mau prognóstico em pacientes com ER+ BRCA. Mecanicamente, o eixo de sinalização CUEDC1/CACNG4/PI3K potencializou a glicólise através da regulação positiva do transportador de glicose 1 (GLUT1), uma proteína crucial no metabolismo da glicose, sustentando assim o crescimento tumoral do ER+ BRCA. Além disso, o metotrexato foi identificado como um potencial inibidor da CUEDC1. Importantemente, a combinação de ipatasertibe (um inibidor da via PI3K/AKT) com metotrexato suprimiu efetivamente o crescimento do ER+ BRCA em um modelo murino.

Conclusões
Nossa pesquisa revela que a CUEDC1 aumentada desempenha um papel essencial na proliferação de células de ER+ BRCA e no crescimento tumoral através do eixo CACNG4/PI3K. A CUEDC1 é um fator prognóstico promissor para ER+ BRCA, e o eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K pode servir como um alvo terapêutico potencial para o tratamento do ER+ BRCA.

Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s11658-025-00819-2.
O câncer de mama, a neoplasia mais prevalente entre as mulheres, contribui com aproximadamente um quarto de todos os casos de câncer e mais de 15% da mortalidade global por câncer entre as mulheres. Cerca de três quartos dos tumores mamários expressam o receptor de estrogênio alfa (ERα) e geralmente apresentam prognóstico mais favorável que outros subtipos, principalmente devido à sua contínua dependência da atividade do ERα. A ligação do estrogênio aos REs desencadeia dimerização e translocação, resultando, em última análise, na proliferação de células cancerígenas. Tratamentos endócrinos, notadamente o tamoxifeno (TAM) e os inibidores da aromatase, são amplamente adotados na prática clínica para inibir a sinalização do RE ou conter a produção de estrogênio. Embora o tratamento com TAM tenha demonstrado benefícios significativos para pacientes com CPE RE+, o surgimento de resistência à terapia endócrina pode levar à recidiva em um subgrupo de pacientes, representando um desafio clínico significativo. No entanto, o mecanismo subjacente à resistência à terapia endócrina permanece obscuro. Consequentemente, a identificação e a pesquisa aprofundada de reguladores críticos da progressão do CPE RE+ poderiam facilitar o desenvolvimento de estratégias de direcionamento eficazes e novas terapias medicamentosas.
O domínio CUE é um pequeno domínio conservado de ligação à ubiquitina, consistindo em aproximadamente 40 aminoácidos. A proteína 1 contendo domínio CUE (CUEDC1), localizada no cromossomo 17q22, é uma proteína expressa de forma ubíqua. Em vários tumores primários, foi observada expressão aberrante de CUEDC1, com efeitos que podem potencializar ou inibir o crescimento tumoral. Foi encontrada expressão elevada de CUEDC1 em tumores de câncer de colo do útero metastáticos quando comparados a tumores não metastáticos. Também foi relatado que a CUEDC1 promove tumorigênese e progressão maligna em células tumorais hematológicas malignas. Por outro lado, a CUEDC1 inibe a progressão tumoral no câncer de pulmão. Embora estudos anteriores tenham reconhecido a CUEDC1 como um alvo crucial do ERα necessário no CPE RE+, note-se que os mecanismos moleculares pelos quais ela promove o crescimento tumoral no CPE RE+ permanecem desconhecidos.
A reprogramação metabólica energética, reconhecida como uma característica crucial do câncer, é de grande importância na promoção do desenvolvimento de tumores malignos. A maioria das células cancerígenas sustenta preferencialmente sua proliferação e fenótipo metastático por meio da via energética e biossintética gerada pela glicólise aeróbica. A glicólise aeróbica serve como um regulador chave nos microambientes de tumores agressivos. Ela impacta múltiplos processos, incluindo a secreção de fatores pró-inflamatórios, angiogênese, evasão do sistema imunológico e resposta a terapias. Portanto, as células cancerígenas exibem enzimas metabólicas e transportadores envolvidos na glicólise elevados em comparação com células normais. O aumento da atividade glicolítica nas células neoplásicas leva ao acúmulo de lactato no microambiente tumoral (TME). Esse acúmulo de lactato está associado ao avanço da malignidade e a um prognóstico ruim em vários tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. Além disso, estudos crescentes mostram que a adaptação metabólica exibida pelas células cancerígenas serve como um mecanismo principal subjacente à resistência ao tratamento no BRCA ER+. A regulação transcricional relacionada ao ERα no BRCA ER+ tem sido extensivamente investigada. Notavelmente, a atividade transcricional relacionada ao ERα está envolvida na regulação positiva de moléculas glicolíticas chave, levando a um aumento anormal no fluxo glicolítico do BRCA ER+. O CUEDC2, outro membro da família de proteínas contendo domínio estrutural CUE (CUEDC), foi relatado como promotor do efeito Warburg e da tumorigênese em vários tipos de câncer, regulando GLUT3 e LDHA. No entanto, o papel funcional do CUEDC1 na reprogramação metabólica energética foi pouco relatado. Portanto, estamos particularmente interessados em saber se a expressão aberrante de CUEDC1 no BRCA ER+ impulsiona sua progressão ao promover a reprogramação metabólica.

Aqui, demonstramos que o CUEDC1 serve como um regulador crucial na promoção da expansão de células neoplásicas e da progressão tumoral neste subtipo específico de câncer de mama. O CUEDC1 pode modular diretamente o CACNG4, que subsequentemente promove a ativação da via PI3K/AKT, aumentando assim os processos glicolíticos e acelerando o crescimento tumoral do BRCA ER+. Além disso, através de triagem extensiva utilizando o banco de dados CMap, o metotrexato surge como um promissor inibidor de pequena molécula do CUEDC1 e é validado por impedir a proliferação celular maligna mediada pelo CUEDC1. Visar o CUEDC1 juntamente com suas vias downstream tem potencial para conter a progressão do BRCA ER+, apresentando assim uma estratégia terapêutica convincente para o tratamento deste subtipo de câncer de mama.

Materiais e métodos
Amostras de pacientes
Amostras de tecido de BRCA RE+ e tecido mamário não canceroso adjacente foram obtidas de pacientes diagnosticadas no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Chongqing. Antes da coleta das amostras de tecido, essas pacientes não haviam recebido qualquer tratamento. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional, e todos os participantes forneceram consentimento informado para o uso de seus espécimes em pesquisa científica.
Cultura celular
O estudo experimental utilizou múltiplos modelos celulares, incluindo a linhagem celular epitelial mamária não tumorigênica MCF-10A e um painel de linhagens celulares de câncer de mama (BT-474, MDA-MB-231, MCF-7, T47D, HCC1806, BT-549 e MDA-MB-468), juntamente com células HEK293T, todas obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). As condições de cultura celular foram mantidas de acordo com protocolos padrão, com células MCF-10A, MDA-MB-231 e HEK293T cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (HyClone) e 1% de solução antibiótico-antimicótica (penicilina/estreptomicina; Beyotime Biotechnology, Xangai, China). As demais linhagens celulares foram propagadas em meio RPMI 1640 (Gibco, EUA) contendo concentrações idênticas de 10% de FBS e antibióticos. Todas as culturas celulares foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2.
Western blotting
A concentração de proteína total dos lisados extraídos de tecidos tumorais de BRCA RE+ ou linhagens celulares foi determinada usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Beyotime, China). As proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad, EUA). Em seguida, a membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado preparado em solução salina tamponada com Tris e Tween 20 (TBST) por 2 h. A membrana foi incubada em uma solução de trabalho de anticorpo primário específico e reagiu durante a noite a 4 °C. Os anticorpos primários foram os seguintes: CUEDC1 (DF14596; Affinity), CACNG4 (ER1803-13; HUABIO), MAZ (21068-1-AP; Proteintech), GLUT1 (66290-1-Ig; Proteintech), AKT (ET1609-51; HUABIO), PI3K (ET1608-70; HUABIO), p-AKT (ET1607-73; HUABIO) e β-actina (M1210-2; HUABIO). Após incubação de 2 h com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) à temperatura ambiente, as imagens foram capturadas usando um imageador de quimioluminescência. A β-actina foi usada como controle de carregamento, e as intensidades das bandas foram quantificadas usando ImageJ.
Preparação de RNA e PCR quantitativa em tempo real (qRT‑PCR)
Primeiramente, o RNA foi isolado usando o reagente TRIzol (Takara, Japão). Em seguida, o DNA complementar (cDNA) foi preparado de acordo com as instruções do Kit PrimeScript RT (Takara, Japão). Finalmente, a qRT-PCR foi realizada usando o Kit SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japão). As sequências dos iniciadores estão fornecidas na Tabela Suplementar S2.
Transfecção lentiviral, de RNA pequeno interferente e de plasmídeo
Para construir linhagens celulares estáveis, partículas lentivirais contendo plasmídeos de knockdown de CUEDC1, knockdown de CACNG4 e superexpressão de CACNG4 foram adquiridas da GenePharma (Xangai, China). shRNA mediado por lentivírus ou gene ectópico foi utilizado para infectar células T47D, BT-474 e MCF-7 para gerar knockdown estável de CUEDC1, superexpressão de CUEDC1, knockdown de CACNG4 e superexpressão de CACNG4, e células do grupo controle correspondente.

Para transfecção transiente, a GeneChem (Xangai, China) sintetizou siRNA específico para ESR1 e CACNG4. Lipofectamina 3000 (Invitrogen, Life Technologies) foi utilizada para transfectar células com o siRNA seguindo as instruções do fabricante. As sequências do siRNA de ESR1, shRNAs de CUEDC1, shRNAs de CACNG4 e siRNA de CACNG4 são apresentadas na Tabela Suplementar S3.

Imuno-histoquímica (IHC)

Seguindo o protocolo do fabricante, a coloração por IHC foi realizada em seções de tecido de pacientes ou camundongos. Resumidamente, as seções foram submetidas a desparafinização, reidratação, recuperação antigênica e selamento em soro de cabra, seguidas de incubação com anticorpos contra Ki67 (AF02778, Aifang Biotechnology), CUEDC1 (DF14596; Affinity) e CACNG4 (ER1803-13; HUABIO) durante a noite a 4 °C. Após 1 hora de incubação das seções com anticorpos secundários à temperatura ambiente, o processo de coloração foi realizado com um kit de diaminobenzidina (DAB) (Beyotime, China). Em seguida, um microscópio Nikon Eclipse 80i (Tóquio, Japão) foi utilizado para capturar as imagens.

Ensaio de formação de colônias

Para ressuspensão de contagem celular, células T47D (1100 células/poço), BT-474 (1500 células/poço) e MCF-7 (800 células/poço) foram distribuídas uniformemente em placas de seis poços e cultivadas por 10–14 dias. As colônias foram fixadas com metanol por 30 min e, em seguida, coradas com Violeta Cristal. Finalmente, a contagem de colônias (50 ou mais células) foi realizada sob um microscópio.

Ensaio de kit de contagem celular-8 (CCK-8)

Células T47D (4000 células/poço), células BT-474 (4000 células/poço) ou células MCF-7 (1200 células/poço) foram colocadas em sextuplicatas em placas de 96 poços. Fluido de trabalho de CCK-8 na proporção 1:10 (APExBIO, EUA) foi adicionado à suspensão celular, seguido de incubação a 37 °C por 1,5 h. A absorbância foi detectada a 450 nm com um leitor de microplacas Eon (BioTek, EUA).

Ensaio de incorporação de EdU

O ensaio de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) foi realizado usando um kit kFlour647 Click-iT EdU (KeyGEN Biotech, China). Resumidamente, células T47D, BT-474 e MCF-7 foram submetidas a incubação com EdU 2× por 2 h, em seguida, 1 ml de paraformaldeído foi usado para fixar as células. Posteriormente, as células foram permeabilizadas usando Triton X-100 por 15 min e, em seguida, incubadas por 30 min usando 500 μl de coquetel de reação Click. As células foram coradas com Hoechst 33.342. Finalmente, fotos foram tiradas sob um microscópio.

Ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP)
Um kit de ensaio de ChIP (Bersin Bio, China) foi utilizado para realizar o ensaio de ChIP em células MCF-7, e foram coletadas 2 × 10⁷ células. Em seguida, a reticulação do DNA foi realizada utilizando formaldeído a 1%. O tampão de lise foi usado para isolar o conteúdo nuclear dos precipitados lavados. Após isso, o enriquecimento do DNA segmentado por ultrassom foi potencializado pela incubação com anticorpo durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, a extração do DNA enriquecido da mistura foi realizada após a mistura ter passado por reticulação reversa a 65 °C durante a noite, e então análises de quantificação foram realizadas por qPCR. O anticorpo MAZ (21068-1-AP, Proteintech) foi utilizado para finalizar este ensaio. As sequências dos primers para ChIP-qPCR podem ser encontradas na Tabela Suplementar S4.

Ensaio repórter dual-luciferase

Primeiro, células HEK293T ou MCF-7 foram semeadas em placas de 24 poços e cotransfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase dirigido pelo promotor de CUEDC1 por 48 h. Após coletar os lisados celulares, o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega, EUA) foi utilizado para medir as atividades de luciferase Renilla e firefly seguindo as instruções do fabricante.

Sequenciamento de RNA

A extração de RNA total de células T47D com knockdown de CUEDC1 e controle foi realizada com um Nano Drop e bioanalisador Agilent 2100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O sequenciamento de RNA subsequente foi realizado pela BGI (Shenzhen, Guangdong, China). Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram selecionados com base em ǀlog2 FCǀ > 1. Todas as análises subsequentes (salvo indicação em contrário) foram realizadas no sistema de análise Dr. Tom.

Ensaio de captação de glicose

A concentração de glicose foi determinada usando um kit de detecção colorimétrica disponível comercialmente (AAT Bioquest) seguindo o protocolo do fabricante. As medições de intensidade de fluorescência foram realizadas nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 570 e 610 nm, respectivamente, utilizando um leitor de microplacas multimodo TECAN SPARK para análise quantitativa.

Medição de lactato

A quantificação dos níveis intracelulares de lactato foi realizada usando um kit de ensaio de lactato disponível comercialmente (BC2235, Solarbio). Após a lise celular por ultrassonicação por 3 min, o homogenato resultante foi submetido à centrifugação para obter o sobrenadante. Medições de densidade óptica no comprimento de onda de 530 nm foram realizadas tanto para o sobrenadante celular quanto para uma série de soluções padrão, com os valores de absorbância demonstrando uma correlação linear com a concentração de lactato. A concentração de lactato no sobrenadante celular foi subsequentemente determinada por interpolação a partir da curva padrão estabelecida.

ECAR
Células MCF-7 (6000) foram plaqueadas em cada poço da microplaca XFe96. O Analisador Seahorse XFe96 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) foi utilizado em conjunto com os kits de teste de estresse glicolítico e mitocondrial Seahorse, seguindo as diretrizes fornecidas pelo fabricante. Para o teste de estresse glicolítico, foram utilizados glicose (10 mM), oligomicina (1 µM) e 2-desoxiglicose (2-DG, 50 mM). Subsequentemente, os resultados foram analisados usando o software Seahorse Wave 2.6.1.
Experimentos com animais
Os protocolos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas e receberam aprovação formal do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucional da Universidade Médica de Chongqing. Para as investigações in vivo, camundongos nus atímicos fêmeas (6 semanas de idade) foram obtidos da Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Pequim, China) e mantidos em condições livres de patógenos específicos durante todo o período do estudo. Uma semana antes da injeção, 30 μg de estradiol (cipionato) em 30 μL de óleo de milho foram injetados por via intramuscular para estimular a proliferação de células MCF-7 dependentes de estrogênio, e o estradiol foi suplementado a cada 7 dias. Células MCF-7 (5 × 10⁶) do grupo controle ou tratado foram ressuspensas em uma mistura 1:1 de PBS e BD Matrigel®. Essas células foram injetadas ortotopicamente nos coxins adiposos mamários de camundongos nus (n = 5 por grupo). Para avaliar se ipatasertibe e metotrexato inibem o crescimento tumoral in vivo, cada grupo recebeu injeções intraperitoneais de ipatasertibe (30 mg/kg) ou metotrexato (10 mg/kg) duas vezes por semana. Após a implantação das células tumorais, o crescimento do xenoenxerto foi monitorado sistematicamente por meio de medições semanais. As dimensões do tumor foram quantificadas usando a fórmula padrão de cálculo de volume elipsoide: V = 0,5 × (eixo curto)² × (eixo longo). Ao atingir os pontos finais experimentais, os animais foram sacrificados humanitariamente de acordo com as diretrizes institucionais, seguido pela ressecção cirúrgica das massas tumorais. Os tecidos excisados foram subsequentemente pesados, processados e preservados para exame histopatológico abrangente e estudos de caracterização molecular.
Análise de bioinformática
Os dados de sequenciamento de RNA do projeto TCGA-BRCA (Carcinoma Invasivo da Mama), processados através do pipeline STAR, foram baixados e processados a partir do portal TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov). Dados formatados em Transcripts por milhão (TPM) foram extraídos. Amostras sem informações clínicas e amostras normais foram excluídas, e apenas amostras de câncer de mama do subtipo luminal com dados clínicos foram retidas para análise posterior. O estudo foi analisado utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon, teste t pareado, teste de Kruskal–Wallis, transformação log2(valor + 1) e correlação de Spearman. O RStudio (versão 4.2.1) foi utilizado como software de análise, com a conversão de IDs de dados realizada por meio do pacote org.Hs.eg.db. A análise de dados foi realizada utilizando os pacotes cluster Profiler, stats (versão 4.2.1) e car (versão 3.1–0), e a visualização de dados foi realizada com ggplot2. Para realizar a análise de sobrevida utilizando o Kaplan–Meier plotter, usamos o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) com os seguintes conjuntos de dados: GSE26971, GSE7930 e GSE6532. Fatores de transcrição relacionados ao gene alvo foram previstos utilizando bancos de dados online, incluindo ENCODE (https://www.encodeproject.org/), ChIP-Atlas (http://chip-atlas.org/) e PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3). Os sítios de ligação de fatores de transcrição e genes alvo relacionados foram posteriormente previstos utilizando o banco de dados JASPAR (https://jaspar.elixir.no/). A filtragem de genes relacionados ao câncer de mama foi realizada utilizando o banco de dados UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/).
Análise estatística
Cada um dos experimentos foi replicado três vezes. Os dados quantitativos são apresentados como média ± desvio padrão (DP), os qualitativos como frequências/porcentagens. O GraphPad Prism 8.0 foi utilizado para as estatísticas. Aplicamos o teste t pareado, o teste t de Student não pareado ou o teste qui-quadrado para comparações entre dois grupos; uma análise de variância (ANOVA) de uma via foi realizada para comparar múltiplos grupos. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para analisar a correlação entre as expressões gênicas correspondentes. P < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
A expressão elevada de CUEDC1 está associada a um prognóstico ruim em BRCA ER+.
Níveis elevados de CUEDC1 exibem uma correlação notável com progressão adversa em BRCA RE+. A, B Análise dos padrões de expressão de CUEDC1 na coorte TCGA-BRCA. C A correlação entre os níveis de mRNA de CUEDC1 e os estágios patológicos de pacientes com câncer de mama foi investigada analisando dados do banco de dados TCGA. D Análise da expressão de mRNA de CUEDC1 em diferentes subtipos de câncer de mama no banco de dados TCGA. E Coloração imuno-histoquímica (IHQ) foi empregada para obter imagens representativas que descrevem a expressão de CUEDC1 em diversos subtipos de câncer de mama (n = 6). Barra de escala, 50 µm. F Os níveis da proteína CUEDC1 em pacientes com BRCA RE+ foram analisados por western blotting (n = 12). G, H Os níveis de CUEDC1 em BRCA RE+ (n = 50) versus tecidos paracancerosos (n = 33) foram quantificados e visualizados. Barra de escala, 50 µm. I Análise de Kaplan–Meier para mostrar a progressão de pacientes com BRCA RE+ com nível alto ou baixo de CUEDC1. Os dados são representativos de três experimentos independentes. Todos os dados são apresentados como média ± DP. ***P < 0,001

Inicialmente, realizamos uma análise comparativa da expressão de CUEDC1 no banco de dados TCGA. O resultado revelou uma regulação positiva de CUEDC1 em tecidos tumorais primários, em contraste com sua expressão em tecidos normais (Fig. 1A, B). Além disso, a expressão elevada de CUEDC1 correlacionou-se significativamente com o estágio patológico do câncer de mama (Fig. 1C). Curiosamente, nossa análise do banco de dados TCGA revelou maior expressão de CUEDC1 em BRCA RE+ do que em outros subtipos de câncer de mama (Fig. 1D). Uma avaliação adicional da expressão de CUEDC1 em uma coorte de pacientes com vários subtipos de câncer de mama também mostrou CUEDC1 mais abundante em tecidos tumorais de BRCA RE+ (Fig. 1E). Os níveis aumentados da proteína CUEDC1 foram confirmados por western blotting usando tecidos tumorais frescos de BRCA RE+ versus tecidos paracancerosos adjacentes (Fig. 1F) e coloração imuno-histoquímica (IHQ) (Fig. 1G). Comprovamos ainda que os pacientes com tumor BRCA RE+ com superexpressão de CUEDC1 representaram 90% (Fig. 1H). Além disso, o CUEDC1 elevado foi estreitamente correlacionado com características clínicas de BRCA RE+ (Tabela Suplementar S1), e uma correlação inversa com a sobrevida em pacientes com BRCA RE+ (Fig. 1I). No geral, esses dados demonstram que a expressão aumentada de CUEDC1 se correlaciona com pior prognóstico em BRCA RE+.
Considerando que a expressão de CUEDC1 é significativamente maior em câncer de mama ER+, levantamos a hipótese de que o CUEDC1 pode ser regulado pela sinalização do estrogênio. Como esperado, o tratamento com 17β-estradiol (E2) induziu marcadamente a expressão de mRNA e proteína de CUEDC1 em células T47D e MCF-7 (Fig. Suplementar S1A–C). Notavelmente, a regulação positiva mediada por E2 foi bloqueada tanto pelo antagonista de ERα, fulvestranto (Fig. Suplementar S1D–F), quanto por um siRNA específico que silencia a expressão de ERα (Fig. Suplementar S1G, H). Consistente com a descoberta anterior de que CUEDC1 serve como um gene alvo funcional de ERα, confirmamos um papel putativo da sinalização mediada por ERα na modulação da expressão de CUEDC1 em células de câncer de mama ER+. Coletivamente, esses dados indicam que a sinalização de ERα é significativamente crítica na modulação da expressão de CUEDC1.
A alta expressão de CUEDC1 acelera o crescimento tumoral do câncer de mama ER+
A maior expressão de CUEDC1 aumenta a capacidade proliferativa das células de câncer de mama ER+. A Western blotting para avaliar os níveis da proteína CUEDC1 em células de câncer de mama (BT-474, MDA-MB-231, MCF-7, T47D, HCC1806, BT-549 e MDA-MB-468) e células epiteliais mamárias humanas normais (MCF-10A) (n = 3). B, C Western blotting foi utilizada para avaliar a eficiência do knockdown de CUEDC1 em células T47D ou BT-474 (B) e a eficiência da superexpressão de CUEDC1 em células MCF-7 (C). D, E Ensaio de formação de colônias para avaliar a proliferação celular nas células de câncer de mama ER+ indicadas (n = 3). Imagens representativas são mostradas. F, G Ensaio CCK-8 foi realizado para avaliar a proliferação das células T47D e BT-474 com knockdown de CUEDC1 (F) e das células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 (G) (n = 6). H Xenoinxertos derivados de células MCF-7 com superexpressão de CUEDC1 e controles relativos (n = 5). I Os pesos dos tumores foram comparados entre os grupos controle e experimental (n = 5). J Os volumes dos tumores foram medidos nos pontos de tempo designados para construir uma curva de crescimento (n = 5). K A eficiência da superexpressão de CUEDC1 in vivo foi avaliada por western blotting (n = 5). L, M IHC mostra que as proteínas CUEDC1 (L) e Ki-67 (M) foram marcadamente mais fortes nas massas tumorais originadas de células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 (n = 5). N A correlação entre a expressão de CUEDC1 e Ki-67 pela análise de correlação de Pearson em amostras de câncer de mama ER+ utilizando o banco de dados TCGA. Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Todos os dados apresentados como média ± DP. ***P < 0,001
Para avaliar a função potencial do CUEDC1 na progressão do BRCA ER+, primeiro detectamos a expressão do CUEDC1 em múltiplas linhagens celulares de câncer de mama, para confirmar ainda mais que a expressão do CUEDC1 é aumentada nas linhagens celulares BRCA ER+, como células T47D, MCF-7 e BT-474, e relativamente menor em células de câncer de mama HER2-positivo e TNBC (Figura Suplementar S2A; Figura 2A). Usando o sistema de empacotamento lentiviral, o CUEDC1 foi silenciado de forma estável em células T47D e BT-474 (Figura Suplementar S2B, C; Figura 2B) e superexpresso em células MCF-7 (Figura Suplementar S2D, E; Figura 2C). O silenciamento eficiente do CUEDC1 inibiu notavelmente a proliferação das células T47D e BT-474 (Figura 2D; Figura Suplementar S2F). De forma inversa, a superexpressão ectópica do CUEDC1 promoveu significativamente a proliferação das células MCF-7 (Figura 2E; Figura Suplementar S2G). Resultados semelhantes foram obtidos usando o ensaio CCK-8 (Figura 2F, G).

Para confirmar a função vital do CUEDC1 in vivo, estabelecemos um modelo de xenoenxerto subcutâneo em camundongos fêmeas BALB/c nude usando células MCF-7 superexpressando CUEDC1 e suas células MCF-7 controle. A superexpressão do CUEDC1 aumentou significativamente o tamanho e o peso do tumor em comparação com o grupo controle (Figura 2H–J), e o aumento do CUEDC1 no tumor foi comprovado por western blotting (Figura 2K, Figura Suplementar S2H) e IHC (Figura 2L). Além disso, os tumores MCF-7 com superexpressão de CUEDC1 apresentaram expressão mais forte de Ki-67 do que aqueles nos grupos controle (Figura 2M). De fato, o nível mais forte de mRNA de Ki-67 foi intimamente correlacionado com a expressão de CUEDC1 em pacientes com BRCA ER+ no banco de dados TCGA (Figura 2N). Assim, esses dados indicam que o CUEDC1 é crítico para a proliferação de células BRCA ER+ e o crescimento tumoral.

MAZ regula positivamente a expressão de CUEDC1 ao se ligar diretamente ao seu promotor
CUEDC1 é regulado positivamente por MAZ. A Um diagrama de Venn para mostrar os potenciais fatores de transcrição (TFs) do CUEDC1, conforme previsto por TCGA, ENCODE, PROMO e ChIP-Atlas. B O banco de dados JASPAR identificou quatro TFs que se ligam ao promotor do CUEDC1. C A correlação entre os níveis de mRNA de CUEDC1 e MAZ no banco de dados TCGA. D, E Expressão do mRNA de MAZ em diferentes subtipos de câncer de mama do banco de dados TCGA. F A expressão de MAZ foi validada por western blotting em células BRCA ER+ (T47D, MCF-7 e BT-474) e MCF-10A (n=3). G Os sítios de ligação de MAZ no promotor do CUEDC1. H Dois sítios potenciais de ligação de MAZ no promotor do CUEDC1 previstos pelo banco de dados JASPAR. I O ensaio ChIP foi usado para confirmar a capacidade de ligação de MAZ ao promotor do CUEDC1 em células MCF-7 (n=3). J Um ensaio repórter de luciferase dupla para avaliar a atividade transcricional de MAZ no CUEDC1 em células MCF-7 (painel esquerdo) e 293T (painel direito) (n=3). K, L qRT-PCR (K) e western blotting (L) para avaliar a regulação de MAZ sobre CUEDC1 em células T47D e MCF-7 silenciadas para MAZ (n=3). NS, não significativo. Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Dados apresentados como média ± DP. ***P < 0,001
Para descobrir o mecanismo potencial da expressão elevada de CUEDC1 em BRCA ER+, investigamos os fatores de transcrição a montante que regulam sua expressão. Fatores de transcrição diferenciais em BRCA ER+ foram analisados via banco de dados TCGA (Fig. Suplementar S3A). Em seguida, pesquisamos os bancos de dados PROMO, ENCODE, CHIP-ATLAS e TCGA em busca de fatores de transcrição que possam ativar a transcrição de CUEDC1 em BRCA ER+. Quatro fatores de transcrição (ESR1, MAZ, STAT1 e USF1) se sobrepuseram (Fig. 3A). Entre os três fatores de transcrição com as maiores pontuações de correspondência do banco de dados JASPAR, o MAZ, codificado por um gene de 2,7 kb no cromossomo 16p11.2, apresentou a correlação positiva mais forte com CUEDC1 no banco de dados TCGA (Fig. 3B, C; Fig. Suplementar S3B), sugerindo que o MAZ potencialmente regula a expressão de CUEDC1. Além disso, descobrimos que o MAZ era altamente expresso no câncer de mama, particularmente em BRCA ER+ (Fig. 3D, E). Adicionalmente, o MAZ estava aumentado em células BRCA ER+ em comparação com células MCF-10A (Fig. Suplementar S3C, D; Fig. 3F). Subsequentemente, análises adicionais realizadas usando o banco de dados JASPAR revelaram possíveis sítios de ligação do MAZ no promotor de CUEDC1 (Fig. 3G). Dois sítios de ligação previstos estavam presentes neste segmento genômico (Fig. 3H). O ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) revelou que o MAZ podia ligar-se diretamente ao promotor de CUEDC1 em células BRCA ER+ (Fig. 3I). Ensaios repórter de luciferase dupla demonstraram que a deleção do sítio mutante 1 afetou significativamente a ligação do MAZ à região promotora de CUEDC1. Isso destaca o papel crucial do sítio 1 na mediação da atividade transcricional de CUEDC1 induzida por MAZ (Fig. 3J). De forma correspondente, o knockdown de MAZ obviamente levou à diminuição dos mRNAs de CUEDC1 (Fig. 3K) e proteínas (Fig. 3L, Fig. Suplementar S3E) em células T47D e MCF-7. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de células BT-474 (Fig. Suplementar S3F, G). Em conjunto, o aumento de MAZ em BRCA ER+ contribui para a regulação positiva de CUEDC1 ao ligar-se diretamente ao seu promotor.
CACNG4 é regulado positivamente por CUEDC1
CACNG4 é um alvo direto do CUEDC1. A, B Gráficos de vulcão e mapa de calor mostram genes diferencialmente expressos entre células T47D shNC e shCUEDC1 (n = 3), ponto de corte de fold-change > 1.0 e P < 0.05. C Dois genes alvo adquiridos usando RNA-seq e banco de dados UALCAN. D, E qRT-PCR para detectar os níveis de mRNA de dois genes alvo em células T47D ou BT-474 com knockdown de CUEDC1 (D) e células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 (E) (n = 3). F Análise da expressão de CACNG4 em câncer de mama humano nos conjuntos de dados de câncer de mama do TCGA. G Comparação da expressão de CUEDC1 em vários subtipos de câncer de mama usando os conjuntos de dados do TCGA. H Análise de Kaplan–Meier da sobrevida global de BRCA ER+ regulada por CACNG4. I Western blotting para determinar a correlação entre os níveis das proteínas CUEDC1 e CACNG4 em tecidos de BRCA ER+ (n = 12). J Imagens imunohistoquímicas representativas de CUEDC1 e CACNG4 em câncer de mama ER+ (n = 8). Barra de escala, 50 µm. Os resultados do ensaio de western blotting foram quantificados e analisados por regressão linear e correlação. NS, não significativo. Os resultados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Dados apresentados como média ± DP. *P < 0.05, ***P < 0.001
Para investigar os mecanismos moleculares da proliferação induzida por CUEDC1 em células ER+ BRCA, realizamos sequenciamento de RNA para comparar os perfis de expressão de mRNA entre células T47D shNC e shCUEDC1. Mapas de vulcão (Fig. 4A) e um heatmap (Fig. 4B) mostraram genes expressos diferencialmente. Além disso, 156 genes correlacionados com CUEDC1 em câncer de mama foram recuperados do banco de dados UALCAN. Comparando os dois conjuntos de genes, dois genes alvo potenciais de CUEDC1 foram encontrados, incluindo CACNG4 e RNF43 (Fig. 4C). Após análise adicional dos níveis de expressão desses dois genes nas respectivas linhagens celulares, observou-se que a ausência de CUEDC1 resultou em uma diminuição acentuada na expressão de CACNG4 (Fig. 4D; Fig. Suplementar S4A, B), enquanto a superexpressão de CUEDC1 aumentou significativamente CACNG4 (Fig. 4E; Fig. Suplementar S4C), sugerindo que CACNG4 é a molécula a jusante de CUEDC1. Para elucidar melhor a relevância clínica de CACNG4 em ER+ BRCA, realizamos uma análise de expressão usando o banco de dados de câncer de mama do TCGA. Esta análise revelou uma regulação positiva consistente da expressão de CACNG4 em amostras de câncer de mama (Fig. 4F), especialmente em ER+ BRCA (Fig. 4G; Fig. Suplementar S4D). E o aumento de CACNG4 foi significativamente associado ao estágio patológico (Fig. Suplementar S4E), sobrevida ruim (Fig. 4H) e progressão da doença em pacientes (Fig. Suplementar S4F). Além disso, em tecidos pareados de ER+ BRCA e seus tecidos não cancerosos adjacentes correspondentes, as proteínas CACNG4 estavam significativamente elevadas em tecidos tumorais com alta expressão de CUEDC1, enquanto estavam notavelmente reduzidas em tecidos tumorais com baixa expressão de CUEDC1 (R2 = 0,4444, P = 0,0179, Fig. Suplementar S4G; Fig. 4I). Consistentemente, a relação positiva entre a expressão de proteínas CUEDC1 e CACNG4 foi ainda confirmada em tecidos ER+ BRCA e paracancerosos usando análise de IHC (Fig. 4J). Em conjunto, esses resultados corroboram que CUEDC1 aumenta diretamente a expressão de CACNG4 em tecidos e células ER+ BRCA.

CACNG4 é necessário para a malignidade mediada por CUEDC1 em células ER+ BRCA

Os efeitos malignos de CUEDC1 dependem da alta expressão de CACNG4 em células ER+ BRCA. A, B Ensaios de formação de colônias (A) (n = 3) e CCK-8 (B) (n = 6) para testar a capacidade de proliferação de células MCF-7 deficientes em CACNG4 ou células T47D com superexpressão ectópica de CACNG4. C–E A perda de CACNG4 diminui o tamanho do tumor (C), o peso do tumor (D), bem como o crescimento tumoral (E) (n = 5). F Western blotting para avaliar a eficiência da reexpressão de CACNG4 em células T47D deficientes em CUEDC1 (n = 3). G Western blotting para testar a eficiência do knockdown de CACNG4 em células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 (n = 3). H–L Ensaios de CCK-8 (H, I) (n = 6), incorporação de EdU (J, K) (n = 3) e formação de colônias (L, M) (n = 3) para testar a proliferação celular nas células de ER+ BRCA indicadas. Barra de escala, 50 µm. Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Os dados são apresentados como média ± DP. ***P < 0,001
Para determinar o papel do CACNG4 na proliferação maligna induzida por CUEDC1 em BRCA ER+, primeiro detectamos a expressão de CACNG4 em células BRCA ER+ e descobrimos que CACNG4 era altamente expresso em células BRCA ER+ em comparação com células MCF-10A (Fig. Suplementar S5A, B). Em seguida, CACNG4 foi silenciado de forma estável em células MCF-7 e BT-474 (Fig. Suplementar S5C–F) e superexpresso em células T47D (Fig. Suplementar S5G, H). Consistente com os resultados malignos induzidos por CUEDC1, a deficiência de CACNG4 inibiu significativamente a proliferação celular, enquanto o aumento de CACNG4 teve efeitos opostos em comparação com as células controle (Fig. 5A, B; Fig. Suplementar S6A, B). Além disso, a depleção de CACNG4 levou a uma inibição significativa do crescimento tumoral in vivo, evidenciada por uma redução no tamanho, volume e peso do tumor (Fig. 5C–E).
Considerando os papéis funcionais do CUEDC1 na regulação da expressão de CACNG4 e na condução da progressão do BRCA ER+, especulamos que o CUEDC1 possa promover a progressão do BRCA ER+ dependente de CACNG4. Assim, CACNG4 foi ectopicamente superexpresso em células T47D com silenciamento de CUEDC1 (Fig. 5F; Fig. Suplementar S6C) e células BT-474 (Fig. Suplementar S6D), e silenciado em células MCF-7 com superexpressão de CUEDC1 para experimentos de resgate (Fig. 5G; Fig. Suplementar S6E). Curiosamente, a superexpressão de CACNG4 restaurou amplamente a capacidade de proliferação das células T47D silenciadas para CUEDC1. Por outro lado, a promoção mediada por CUEDC1 da proliferação de células MCF-7 pôde ser amplamente revertida pelo silenciamento de CACNG4 (Fig. 5H–M; Fig. Suplementar S6F, G). Coletivamente, esses achados validam que o CACNG4 é essencial para a proliferação maligna impulsionada por CUEDC1 das células BRCA ER+ in vitro.
O eixo CUEDC1/CACNG4 está envolvido na regulação do crescimento tumoral através da ativação da sinalização PI3K/AKT
O eixo CUEDC1/CACNG4 ativa a via PI3K/AKT. A análise KEGG enriqueceu a via de sinalização PI3K-AKT em células T47D com alta expressão de CUEDC1. B Análise GSEA mostrando a via de sinalização PI3K-AKT enriquecida em tumores BRCA ER+ dos conjuntos de dados do TCGA. C-D Western blotting para avaliar a atividade de PI3K/AKT em células T47D com silenciamento de CUEDC1 (C) e BT-474 (D) (n = 3). E CACNG4 foi reexpresso em células T47D com silenciamento de CUEDC1 (painel esquerdo) e células BT-474 (painel direito). Western blotting para avaliar a ativação da sinalização PI3K/AKT (n = 3). F, G CCK-8 (F) (n = 6) e ensaio de formação de colônias (G) (n = 3) para detectar a capacidade de proliferação de células T47D e BT-474 com silenciamento de CUEDC1 tratadas com SC79, um agonista da sinalização PI3K-AKT. H, I Tamanhos tumorais (H) e pesos tumorais (I) de células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 avaliadas em camundongos sob tratamento com ou sem inibidor da via PI3K/AKT (ipatasertib) (n = 5). J Western blotting para verificar os níveis da proteína p-AKT em tecidos tumorais de camundongos sob diferentes tratamentos (painel esquerdo) (n = 3). Os resultados dos ensaios de western blotting foram quantificados e analisados estatisticamente (painel direito). Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Todos os dados apresentados como média ± DP. ***P < 0,001
Para investigar mais a fundo os alvos downstream do eixo CUEDC1–CACNG4, foi realizada a análise da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) para investigar a via downstream relacionada ao CUEDC1 usando dados de sequenciamento de RNA, indicando que a sinalização PI3K/AKT estava intimamente relacionada ao CUEDC1 em células T47D (Fig. 6A). Enquanto isso, foi ainda comprovado que o CUEDC1 ativa a via PI3K/AKT em conjuntos de dados de grande escala de BRCA ER+ comparando tumores CUEDC1high e CUEDC1low do banco de dados TCGA (Fig. 6B). Portanto, levantamos a hipótese de que o CUEDC1 poderia promover a ativação de PI3K/AKT para facilitar o crescimento tumoral de células BRCA ER+. De fato, o knockdown de CUEDC1 resultou na supressão da via PI3K/AKT em comparação com células controle (Fig. 6C, D). Resultados semelhantes foram obtidos com células com knockdown de CACNG4 (Fig. Suplementar S7A, B). Esses dados indicaram efetivamente que o eixo CUEDC1-CACNG4 estava de fato envolvido na ativação da sinalização PI3K/AKT. Exploramos ainda se o CUEDC1 promovia a ativação de PI3K/AKT via regulação positiva de CACNG4 para facilitar o crescimento tumoral de BRCA ER+. De fato, descobrimos que a ativação da sinalização PI3K/AKT induzida por CUEDC1 depende de CACNG4 (Fig. 6E; Fig. Suplementar S7C). Em conjunto, esses dados revelam que a expressão aumentada de CUEDC1 leva à ativação da via PI3K/AKT através da regulação de CACNG4.
Para investigar se a proliferação maligna de células BRCA ER+ causada pelo eixo CUEDC1–CACNG4 depende da sinalização PI3K/AKT ativada, empregamos SC79, um agonista da via de sinalização PI3K/AKT, bem como ipatasertib, um inibidor da sinalização PI3K/AKT, para tratar as células BRCA ER+ e avaliar as capacidades de proliferação celular. O SC79 conseguiu restaurar parcialmente a proliferação celular em células BRCA ER+ com knockdown de CUEDC1 (Fig. 6F, G). Em contraste, a proliferação maligna induzida pela expressão ectópica de CUEDC1 em MCF-7 foi atenuada pelo tratamento com ipatasertib (Fig. Suplementar S7D, E). Consistentemente, a administração de ipatasertib a camundongos com carga tumoral injetados com células MCF-7 superexpressando CUEDC1 ectópico causou uma redução significativa do crescimento tumoral (Fig. 6H, I). Correspondentemente, a ativação de PI3K/AKT induzida por CUEDC1 ectópico foi dramaticamente enfraquecida em tumores tratados com ipatasertib (Fig. 6J). Em conjunto, essas descobertas demonstram que o CUEDC1 elevado ativa a sinalização PI3K/AKT para promover o crescimento de tumores de mama ER+.
O eixo CUEDC1–CACNG4 ativa a via PI3K/AKT para coordenar a glicólise para o crescimento de tumores de mama ER+.
CUEDC1/CACNG4/PI3K axis de sinalização promove glicólise via regulação positiva da expressão de GLUT1 em BRCA ER+. A, B Consumo de glicose (A) e produção de lactato (B) em células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 (n = 4). C Perfil de ECAR medido em células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 utilizando o analisador Seahorse XF24 (n = 3). Inibidores metabólicos foram injetados sequencialmente nos pontos de tempo designados, conforme mostrado. D, E Consumo de glicose (D) e produção de lactato (E) em células BT-474 com knockdown de CUEDC1 (n = 4). F, G Consumo de glicose (F) e produção de lactato (G) em células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 com ou sem tratamento com ipatasertib (n = 4). H Análise de correlação da expressão de CACNG4 com genes relacionados ao metabolismo em tumores BRCA ER+ provenientes dos conjuntos de dados do TCGA. I, J A regulação de CACNG4 sobre GLUT1 foi determinada por western blotting em células MCF-7 e BT-474 com knockdown de CACNG4 (I) e células T47D com superexpressão ectópica de CACNG4 (J) (n = 3). K, L Células T47D ou BT-474 e células MCF-7 foram tratadas com ou sem inibidor glicolítico de hexocinase (2-DG) e submetidas ao ensaio de formação de colônias para testar a proliferação celular das células T47D ou BT-474 com knockdown de CUEDC1 (K) e células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 (L) (n = 3). Imagens representativas são mostradas. M, N Tamanhos tumorais (M) e pesos tumorais (N) de células MCF-7 com superexpressão ectópica de CUEDC1 avaliadas em camundongos com ou sem tratamento com 2-DG (n = 5). Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Todos os dados apresentados como média ± DP. **P < 0,01, ***P < 0,001
Foi relatado que a sinalização PI3K/AKT desempenha um papel central na promoção da captação de glicose e da glicólise em cânceres. Além disso, CACNG4 está associada à glicólise no câncer de cólon. Estudos anteriores também mostraram que a maioria das células cancerígenas preferencialmente sustenta sua proliferação dependendo de energia e biossíntese provenientes da glicólise aeróbica. Consequentemente, levantamos a hipótese de que o eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K ativado em BRCA ER+ poderia promover o crescimento tumoral através da glicólise mediada por PI3K/AKT. Em consonância com isso, a superexpressão de CUEDC1 aumentou a captação de glicose e a produção de lactato (Fig. 7A, B) e causou maior ECAR, um indicador do fluxo glicolítico geral (Fig. 7C). Por outro lado, o knockdown de CUEDC1 inibiu a captação de glicose e a produção de lactato (Fig. 7D, E). Além disso, o knockdown de CACNG4 também levou à diminuição da captação de glicose (Fig. Suplementar S8A) e menor produção de lactato (Fig. Suplementar S8B), e correspondente redução de ECAR (Fig. Suplementar S8C) em células BRCA ER+. O tratamento com ipatasertib neutralizou amplamente o aumento induzido por CUEDC1 ectópico na captação de glicose e produção de lactato (Fig. 7F, G). Para obter uma compreensão mais profunda do mecanismo que impulsiona a glicólise mediada por CUEDC1/CACNG4, primeiro analisamos a relação entre os níveis de CACNG4 e a expressão de genes-chave relacionados ao metabolismo da glicose (ALDOA, ENO1, HK2, HK3, LDHA, PDK1, PDK2, PDK3, PGAM1, PGK1 e GLUT1) usando os bancos de dados do TCGA em BRCA ER+. Descobriu-se que GLUT1 tem a correlação positiva mais forte com CACNG4 em BRCA (Fig. 7H). Resultados semelhantes foram obtidos usando o ensaio de qRT-PCR (Fig. Suplementar S8D–F). Em consonância com isso, GLUT1 foi significativamente regulado negativamente em células BRCA ER+ com knockdown de CACNG4 (Fig. 7I; Fig. Suplementar S8G, H). Inversamente, a regulação positiva de CACNG4 levou a um aumento da expressão de GLUT1 em células BRCA ER+ (Fig. 7J; Fig. Suplementar S8I). Resultados semelhantes foram obtidos em células T47D ou BT-474 com knockdown de CUEDC1, e células MCF-7 com superexpressão de CUEDC1 ectópico (Fig. Suplementar S8J, K). GLUT, o transportador de glicose, permite o transporte de glicose através da membrana plasmática. Como um membro principal da família de transportadores de glicose, GLUT1, atuando como um fator limitante para o transporte de glicose, sustenta a glicólise e medeia eventos de reprogramação do metabolismo tumoral. A expressão aberrante de GLUT1, juntamente com afinidades alteradas por hexoses, pode permitir que as células cancerígenas ajustem finamente seu suprimento de energia, oferecendo assim uma vantagem crítica para o crescimento tumoral. Coletivamente, nossos dados apoiam que o eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K promove a glicólise ao regular a expressão de GLUT1 em células BRCA ER+.
Posteriormente, questionamos se a reprogramação metabólica energética mediada pelo eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K poderia afetar o crescimento tumoral do BRCA ER+. 2-desoxiglicose (2-DG), um inibidor da hexocinase glicolítica, foi empregada. O knockdown de CUEDC1 combinado com o tratamento com 2-DG reduziu ainda mais a proliferação de células BRCA ER+ (Fig. 7K). Em contraste, a administração de tratamento com 2-DG em células BRCA ER+ com superexpressão de CUEDC1 com 2-DG atenuou notavelmente a proliferação maligna (Fig. 7L) e o crescimento tumoral (Fig. 7M, N). No geral, a glicólise mediada pelo eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K é crítica para a proliferação de células BRCA ER+ e crescimento tumoral.

Metotrexato, um inibidor de CUEDC1 identificado, combinado com ipatasertib melhora os benefícios terapêuticos para BRCA ER+
Visar CUEDC1 combinado com ipatasertib melhora os benefícios terapêuticos para BRCA ER+ in vitro e in vivo. A Um potencial inibidor direcionado a CUEDC1 foi obtido usando o banco de dados CMap. B, C Níveis de mRNA de CUEDC1 e CACNG4 em células BRCA ER+ sob tratamento com ou sem metotrexato (n = 3). D–F Células T47D, MCF-7 e BT-474 tratadas com ou sem metotrexato em baixa dose em combinação com ipatasertib, CCK-8 (D) (n = 6) e formação de colônias (E, F) (n = 3) para avaliar a proliferação celular. G Fotos representativas de tumor de células MCF-7 em camundongos tratados com uma combinação de metotrexato em baixa dose e ipatasertib (n = 5). H–J Os pesos tumorais (H), peso corporal (I), relação fígado/peso corporal (J) e relação baço/peso corporal (K) foram verificados em camundongos sob tratamento com uma combinação de metotrexato e ipatasertib (n = 5). NS, não significativo. Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Todos os dados apresentados como média ± DP. ***P < 0,01
Numerosos estudos demonstraram que a sinalização PI3K/AKT é hiperativada no câncer de mama. Consequentemente, a combinação de um inibidor seletivo de PI3Kα com um antagonista do receptor de estrogênio (ER) é aprovada para doença HR+ avançada, no entanto, os benefícios da terapia ainda são limitados. Para avaliar o potencial aprimoramento terapêutico para o câncer de mama ER+ sob o direcionamento de CUEDC1 em combinação com um inibidor da via de sinalização PI3K/AKT, tentamos utilizar o banco de dados Connectivity Map (CMap) (https://clue.io/) para obter o composto farmacológico priorizado. Esta plataforma, que cataloga sistematicamente as alterações na expressão gênica em células humanas após exposição a diversas perturbações farmacológicas e genéticas, foi empregada para identificar potenciais inibidores de CUEDC1. Após a integração computacional de nossos conjuntos de dados de sequenciamento de RNA com os perfis de referência no banco de dados CMap, geramos uma lista priorizada de compostos farmacológicos com base em suas métricas de conectividade. Isso identificou uma lista de fármacos candidatos que apresentaram os maiores escores de conectividade (Fig. 8A). Esses perfis de expressão gênica induzidos por fármacos se assemelhavam muito aos observados em células tumorais com knockdown de CUEDC1, identificando assim potenciais inibidores de CUEDC1. O metotrexato, classificado no topo, é um metabólito antifolato que impede a síntese, reparo e replicação celular do DNA, e possui propriedades anti-inflamatórias e imunomoduladoras. Para avaliar o efeito do metotrexato na inibição de CUEDC1, primeiro medimos seu valor de concentração inibitória média (IC50) em células tumorais BRCA ER+ (Fig. Suplementar S9A). Como esperado, o tratamento de células BRCA ER+ com metotrexato mostrou um perfil de expressão gênica semelhante ao induzido pelo knockdown de CUEDC1. Importante, CACNG4, o alvo a jusante de CUEDC1, foi marcadamente regulado negativamente nas células tratadas com metotrexato, sugerindo que o metotrexato pode inibir a atividade de CUEDC1 (Fig. 8B, C; Fig. Suplementar S9B–D). Além disso, revelamos que o metotrexato combinado com ipatasertibe poderia inibir significativamente a proliferação de células BRCA ER+ (Fig. Suplementar S9E–G) e o crescimento tumoral (Fig. Suplementar S9H, I).
O metotrexato é amplamente utilizado no tratamento de vários tipos de câncer, seja como monoterapia ou em combinação, incluindo câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço e leucemia linfoblástica aguda infantil (LLA), além de seu uso na artrite reumatoide e em certos distúrbios dermatológicos. No entanto, sua aplicação clínica como agente quimioterápico é frequentemente limitada pela necessidade de altas doses, pelo desenvolvimento de resistência e por efeitos colaterais neurológicos. Portanto, avaliamos ainda o efeito terapêutico do metotrexato em baixa dose em combinação com ipatasertib em ER+ BRCA. Como esperado, em comparação com o grupo controle, o metotrexato em baixa dose combinado com ipatasertib ainda inibiu significativamente a proliferação de células ER+ BRCA (Fig. 8D–F) e o crescimento tumoral (Fig. 8G, H). Curiosamente, não houve alterações significativas no peso corporal, nos volumes do fígado e do baço de camundongos nus, indicando que esses tratamentos foram bem tolerados sem toxicidade significativa (Fig. 8I–K). Em conclusão, o metotrexato é um potencial inibidor de CUEDC1, e o metotrexato combinado com ipatasertib pode agir sinergicamente para suprimir o crescimento tumoral de ER+ BRCA, destacando seu potencial terapêutico para pacientes com ER+ BRCA.
Discussão
A glicólise aeróbica elevada é cada vez mais reconhecida como uma característica distintiva de diversos tipos de câncer. O ER+ BRCA é distinguido por proliferação descontrolada, comportamento invasivo, potencial metastático e glicólise aumentada, levando à rápida progressão tumoral. Aqui, revelamos o papel crucial do CUEDC1 na promoção do crescimento do ER+ BRCA. O CUEDC1 está significativamente elevado em células e tecidos tumorais de ER+ BRCA e está envolvido na regulação da expressão de CACNG4, contribuindo para a ativação da sinalização PI3K/AKT, estando assim envolvido na regulação da glicólise em células de ER+ BRCA para mediar o crescimento tumoral. O metotrexato foi selecionado como um inibidor de CUEDC1. Em resumo, nossos achados destacam que o CUEDC1 acelera o crescimento tumoral no ER+ BRCA, e o eixo CUEDC1/CACNG4/PI3K recentemente identificado representa um alvo terapêutico promissor para a malignidade do ER+ BRCA.
Proteína-1 contendo domínio CUE (CUEDC1), uma proteína de 42 kDa, composta por 386 aminoácidos, é um membro da família de proteínas contendo domínio estrutural CUE (CUEDC). Relatos têm revelado o envolvimento crucial do CUEDC2 na progressão de vários cânceres, sendo o câncer de mama um dos principais exemplos. No entanto, o papel molecular exato do CUEDC1 na progressão do BRCA ER+ permanece incerto. Neste estudo, mostramos que o CUEDC1 funciona como um motor crucial na progressão do BRCA ER+. O aumento do CUEDC1 leva a uma malignidade aumentada, incluindo rápida proliferação celular e reprogramação glicolítica. A relação próxima entre o CUEDC1 elevado e a má progressão da doença do BRCA ER+ indica que o CUEDC1 pode servir como um biomarcador diagnóstico promissor para BRCA ER+. Além disso, tanto evidências bioinformáticas quanto experimentais confirmam que o MAZ é um regulador transcricional a montante do CUEDC1, sugerindo que o direcionamento do eixo MAZ/CUEDC1 pode ser uma estratégia terapêutica promissora para BRCA ER+.

CACNG4, atuando como a subunidade gama do canal de cálcio dependente de voltagem tipo L, é um alvo chave do CUEDC1. Estudos anteriores mostram que o CACNG4 pode ser um biomarcador valioso para o diagnóstico do câncer de mama e um potencial alvo terapêutico de tumores; por exemplo, a regulação positiva do CACNG4 ocorre em linhagens de células tumorais resistentes ao inibidor de EGFR (erlotinibe). No carcinoma hepatocelular, o CACNG4 desempenha um papel na manutenção das células-tronco cancerígenas. Neste estudo, validamos que o CACNG4 é um fator efetivo chave do crescimento tumoral mediado pelo CUEDC1 no BRCA ER+, enfatizando ainda mais seu papel substancial no desenvolvimento tumoral induzido pelo CUEDC1. No entanto, o mecanismo molecular detalhado de como o CUEDC1 regula a expressão do CACNG4 no BRCA ER+ precisa ser explorado no futuro. Clinicamente, confirmamos que o aumento do CACNG4 está positivamente correlacionado com o CUEDC1 em tecidos de BRCA ER+, sugerindo o potencial valor biológico e diagnóstico do CUEDC1 e CACNG4 em tumores de BRCA ER+.

O eixo ativado CUEDC1/CACNG4/PI3K é necessário para o crescimento do BRCA ER+. É bem conhecido que a sinalização PI3K/AKT/mTOR é uma cascata regulatória chave para muitos comportamentos biológicos celulares, incluindo crescimento, metabolismo e sobrevivência. No câncer de mama luminal, acredita-se que a sinalização robusta PI3K/AKT esteja envolvida na condução da malignidade e progressão tumoral. Assim, o direcionamento específico da sinalização PI3K/AKT tem sido considerado uma boa estratégia para o tratamento do BRCA ER+. Neste estudo, descobriu-se que o CUEDC1 regula positivamente a ativação da sinalização PI3K/AKT por meio do CACNG4, contribuindo para o crescimento do tumor de mama ER+. O ipatasertibe, que está atualmente em um ensaio clínico de fase II como medicamento direcionado à AKT para câncer de mama humano, foi encontrado para neutralizar efetivamente os efeitos promotores de tumor mediados pelo CUEDC1, reduzindo significativamente tanto a proliferação celular quanto o crescimento tumoral. Nossas descobertas enfatizam um papel chave do eixo CUEDC1–CACNG4 na propulsão da progressão do BRCA ER+ por meio da ativação da sinalização PI3K/AKT.
Nosso trabalho revela que a glicólise mediada por CUEDC1 é crítica para o crescimento do BRCA ER+. Geralmente, o metabolismo ativado da glicose é um fator importante que impulsiona a progressão de vários tumores. Por exemplo, o estrogênio (E2) aumenta substancialmente a sinalização rápida dependente de ER, o que permite que as células de câncer de mama ERα-positivas aumentem a captação de glicose para acelerar a proliferação celular. Em outros estudos, o papel da via PI3K/AKT no metabolismo da glicose está firmemente estabelecido. Além disso, vários estudos indicaram que a CUEDC2 tem um papel notável na reprogramação metabólica. No entanto, se a CUEDC1 regula a cascata PI3K/AKT para afetar o metabolismo da glicose permanece desconhecido. No presente estudo, descobrimos o metabolismo da glicose mediado pelo eixo CUEDC1–CACNG4 via expressão de GLUT1 regulada pela sinalização PI3K/AKT. GLUT1 é o principal transportador de glicose, responsável por importar glicose do ambiente extracelular para o citoplasma, apoiando assim a reprogramação da glicólise para alimentar o desenvolvimento tumoral. Esses estudos sugerem que direcionar o GLUT1 pode eliminar a proliferação maligna das células BRCA ER+ mediada pelo eixo CUEDC1/CACNG4. De fato, vários estudos mostraram que a inibição direcionada ao GLUT1 tem eficácia terapêutica significativa. Pretendemos explorar em profundidade se a inibição direcionada do GLUT1 pode suprimir a proliferação maligna das células BRCA ER+ mediada pelo eixo CUEDC1/CACNG4 no futuro.

Mais importante ainda, nosso estudo identifica um potencial inibidor de CUEDC1. Usando o banco de dados CMap, uma plataforma abrangente com perfis detalhados de expressão gênica de quase 5000 compostos de pequenas moléculas, que pode ajudar a identificar candidatos terapêuticos promissores, compilamos uma lista de potenciais inibidores de CUEDC1 com base em sua capacidade de induzir perfis de expressão gênica semelhantes aos observados no knockdown de CUEDC1. Entre eles, o metotrexato (MTX) foi selecionado como o candidato mais forte para direcionar CUEDC1. Um estudo anterior mostrou que o metotrexato pode inibir a replicação do DNA em células cancerígenas em proliferação rápida. No entanto, altas doses de metotrexato podem resultar em efeitos colaterais tóxicos graves. Portanto, reduzir a dose de metotrexato em combinação com outros medicamentos, como o ipatasertib em nosso estudo, pode ser uma abordagem racional para um tratamento melhorado. O tratamento combinado com baixa dose de metotrexato e ipatasertib exibe notáveis efeitos antitumorais no crescimento, sugerindo que direcionar CUEDC1 é um tratamento eficaz para BRCA ER+.

Em resumo, nosso estudo revela um mecanismo regulatório até então não reconhecido pelo qual a CUEDC1 regula a expressão de CACNG4 e a ativação de PI3K/AKT para desencadear a glicólise, contribuindo para a progressão do BRCA ER+. A combinação de metotrexato, um inibidor de CUEDC1, com ipatasertib exerce um efeito sinérgico na supressão da proliferação do BRCA ER+.
Conclusões
Diagrama de mecanismo molecular deste estudo. O esquema mostra a função do CUEDC1 na promoção do crescimento tumoral do BRCA RE+. O MAZ elevado no BRCA RE+ contribui para a transcrição do CUEDC1, levando ao aumento do CUEDC1. O CUEDC1 aumentado modula diretamente o CACNG4 para estimular a ativação da via de sinalização PI3K/AKT, aumentando assim os processos glicolíticos e acelerando o crescimento tumoral do BRCA RE+. O direcionamento do CUEDC1 combinado com ipatasertibe reduz o crescimento tumoral do BRCA RE+
Nossos achados destacam o papel crítico pró-tumoral do CUEDC1 na progressão do BRCA RE+. A sinalização CACNG4/PI3K causada pelo CUEDC1 promove a progressão do câncer de mama RE-positivo através do aumento da glicólise. Este novo insight sobre o mecanismo molecular da progressão do BRCA RE+ pode fornecer oportunidades promissoras para o desenvolvimento de estratégias diagnósticas e terapêuticas para o BRCA RE+ (Fig. 9).
Informações Suplementares
Abreviaturas
BRCA
Câncer de mama
RE
Receptor de estrogênio
TAM
Tamoxifeno
CUEDC2
Proteína 2 contendo domínio CUE
CUEDC1
Proteína 1 contendo domínio CUE
ESR1
Receptor de estrogênio 1
shRNA
RNA de grampo curto
MAZ
Proteína de dedo de zinco associada a MYC
RNF43
Proteína 43 do anel de dedo
CACNG4
Subunidade auxiliar gama 4 do canal de cálcio dependente de voltagem
siRNA
Pequeno RNA interferente
ECAR
Taxa de acidificação extracelular
GLUT1
Transportador de glicose 1
PI3K
Fosfoinositídeo 3-quinase
AKT
Proteína quinase B
p-AKT
AKT fosforilada
TME
Microambiente tumoral
LDHA
Lactato desidrogenase A
GLUT3
Transportador de glicose 3
ALL
Leucemia linfoblástica aguda
STAT3
Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3
HER2
Receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano
TNBC
Câncer de mama triplo-negativo
GLUT4
Transportador de glicose 4
mTOR
Alvo mamífero da rapamicina
EGFR
Receptor do fator de crescimento epidérmico
HR
Receptor hormonal
Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Zexiu Lu, Ming Lei e Jian Chen contribuíram igualmente para este trabalho.
Contribuições dos autores
Lingfeng Tang e Manran Liu conceberam e desenharam este estudo, e revisaram o rascunho. Zexiu Lu, Ming Lei e Jian Chen realizaram a maioria dos experimentos e análises de dados, e redigiram o manuscrito. Ao Deng, Jing Chen, Die Meng e Chao Chang auxiliaram no trabalho experimental. Rui Wang, Xueying Wan e Gang Tu coletaram amostras de pacientes e ajudaram a organizar as figuras. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do artigo.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pelo projeto de construção de disciplina de primeira classe de Medicina Clínica do Colégio Clínico para o Departamento de Cirurgia de Mama e Tireoide (CYYY-BSYJSCXXW-202322), e também parcialmente pelo Programa de Professorado Distinto da Universidade Médica de Chongqing (2019-R10005) para Manran Liu.
Disponibilidade de dados
Todos os dados estão disponíveis mediante solicitação razoável. Os dados de RNA-seq foram depositados no Gene Expression Omnibus (GSE306470).
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participar
A pesquisa seguiu a Declaração de Helsinque e os padrões éticos nacionais e internacionais. O Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Chongqing aprovou o uso de materiais clínicos (aprovação nº 2020–202, 29 de abril de 2020; aprovação nº K2023-514, 11 de outubro de 2023), e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes desta pesquisa. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Internacional para Ciência de Animais de Laboratório (ICLAS) e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Médica de Chongqing (aprovação nº IACUC-CQMU-2023–0267, 28 de setembro de 2023).
Consentimento para publicação
Todos os autores aprovaram o manuscrito para submissão e deram seu consentimento para publicação.
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Referências
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Papel da SUMOilação na repressão transcricional diferencial do ERα por tamoxifeno e fulvestranto em células de câncer de mama
A fosforilação do receptor alfa de estrogênio mutante K303R na serina 305 afeta a sensibilidade ao inibidor da aromatase
A comunicação bidirecional entre as vias de sinalização ERα e EGFR regula o crescimento resistente ao tamoxifeno
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Construção de um vetor lentiviral carregando o gene CUEDC1 e seu efeito na proliferação e capacidade de formação de colônias de células MOLT-4
CUEDC1 é um alvo primário do ERα essencial para o crescimento de células de câncer de mama
Visando o metabolismo do câncer na era da oncologia de precisão
As características emergentes do metabolismo do câncer
Compreendendo as intersecções entre metabolismo e biologia do câncer
Regulação metabólica da expressão gênica pela lactilação de histonas
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SEC61G promove o desenvolvimento e metástase do câncer de mama via modulação da glicólise e é regulado transcricionalmente por E2F1
A proteína 2 contendo domínio CUE promove o efeito Warburg e a tumorigênese
MAZ, uma proteína de dedo de zinco, liga-se às sequências dos genes c-MYC e C2 regulando a iniciação e terminação transcricional
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17beta-estradiol ativa a captação de glicose via translocação de GLUT4 e via de sinalização PI3K/Akt em células MCF-7
Akt fosforila HK-II em Thr-473 e aumenta a associação mitocondrial de HK-II para proteger cardiomiócitos
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HPV16 E6/E7 promovem a translocação e captação de glicose de GLUT1 pela via PI3K/AKT ao aliviar o efeito inibitório do miR-451 sobre CAB39 em células de câncer de pulmão
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Termogéis de dupla regulação metabolismo/imunidade potencializando a imunoterapia do glioblastoma através da inibição da excreção de lactato e bloqueio de PD-1/PD-L1
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O inibidor de GLUT1 BAY-876 induz apoptose e aumenta os efeitos anticancerígenos de agonistas de receptores amargos em células de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço
O ácido etacrínico inibe a atividade de STAT3 através da modulação das tirosina fosfatases SHP2 e PTP1B em células de carcinoma de próstata DU145
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